两种方法分离子宫内膜干细胞的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外尚无统一方法分离培养子宫内膜干细胞，实验重复性较差。
目的：寻找一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。
方法：采用混合法(机械和酶消化相结合)及胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞，比较两种方法分离所得活细胞数及细胞生长周期的差异；并采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测CD90和CD117的表达情况。
结果与结论：经过15 d的原代培养后，子宫内膜干细胞形态呈圆梭形，细胞贴壁平铺生长，具有成纤维细胞形态，细胞排列无极性；细胞化学染色及RT-PCR法均检测到干细胞标志物CD90和CD117表达，证明培养的细胞具有干细胞特性。混合法获得的活细胞数多于胶原酶Ⅰ法，其差异有显著性意义 (P < 0.01)，两种方法分离所得的细胞具有相同的生长周期。结果说明混合法是一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 子宫内膜干细胞, 分离, 胶原酶Ⅰ, 混合, 机械, 酶消化, CD90, CD117, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: There have been no standard methods used to isolate and culture of endometrial stem cells and the existing methods show poor repeatability.
OBJECTIVE: To search a method that can be used to conveniently, high-efficiently and scientifically isolate endometrial stem cells.
METHODS: Endometrial stem cells were isolated by collagenase Ⅰ digestion combined with mechanical dissociation and collagenase Ⅰ digestion. The number and growth cycle of living cells were compared between these two methods. CD90 and CD117 expression levels were detected by immunocytochemical staining and RT-PCR method.
RESULTS AND CONCLUSION: After 15 days of primary culture, endometrial stem cells exhibited a shuttle-shaped appearance, adhered to the wall of culture dish, showed the morphology of fibroblasts and arranged in the absence of polarity. The expression of stem cell markers CD90 and CD117 was detected by immunocytochemical staining and RT-PCR method. This suggests that the cultured cells exhibit the characteristics of stem cells. Collagenase Ⅰ digestion combined with mechanical dissociation yielded higher number of living cells than enzymatic digestion (P < 0.01), but the growth cycle was the same after cultured by these two methods. These results indicate that collagenase Ⅰ digestion combined with mechanical dissociation is a convenient, highly efficient and scientific method used for in vitro isolation of endometrial stem cells.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, endometrial stem cells, isolation, collagenase Ⅰ, mixture, mechanical dissociation, enzymatic digestion, CD90, CD117, provincial grants-supported paper, stem cells photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

马颖，何援利. 两种方法分离子宫内膜干细胞的比较[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1089-1093.

Ma Ying, He Yuan-li. Enzymatic digestion versus collagenase I digestion combined with mechanical dissociation for isolation of endometrial stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1089-1093.

图/表（结果） 8

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞分离培养实验。
时间及地点：实验于2011年1至6月在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。
材料：
标本收集：子宫内膜来源于本科因宫颈上皮内瘤变Ⅲ级行子宫切除的女性，术前3个内未使用过外源性激素，年龄30-50岁，详细记录患者的信息，并与患者签署知情同意书。所取样本包括5 mm子宫肌层的子宫内膜全层。
试剂和仪器：
Main experimental reagents and instruments:

方法：
标本的处理：将收集的20份子宫内膜标本放入无菌的青链霉素溶液中1 h，送入实验室。用无Ca²⁺、Mg²⁺的缓冲液(PBS)进行冲洗，直到液体清亮。移入无菌的培养皿中，用眼科剪切成1 mm×1 mm×1 mm。
分离方法：
混合法(酶消化和机械方法相结合)：用含有300 g/L胶原酶Ⅲ和40 g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的PBS，在37 ℃，150 r/min振荡培养箱内消化。消化后的细胞悬液用200目和400目的滤网两次过滤，富含基质细胞的滤液离心后制成基质细胞悬液。用PBS冲洗滤网，收集贴附其上的腺上皮细胞离心后制成上皮细胞悬液^[4]。
胶原酶Ⅰ法：在培养皿中加入约2倍体积的的胶原酶Ⅰ，37 ℃，消化50-60 min，将消化好的细胞悬液吸入离心管中，静置几分钟以去除未完全消化的大块组织。 1 200 r/min离心5 min，上清中富含基质细胞和上皮细胞。
将分离的细胞悬液按照2×10⁸ L^-1的细胞浓度分别接种于25 cm的培养瓶中，DMEM/F12培养基中包含体积分数为10%胎牛血清、青链霉素溶液，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱孵育48 h后换液1次。弃去未贴壁细胞，以后每2 d或3 d换液1次，观察细胞生长情况。
以上实验重复5次，取第2代生长到第6天的细胞，用锥虫蓝染色，倒置显维镜下计数活细胞数，每高倍镜下计数3次，取其平均数。
细胞形态观察：第2代培养细胞悬液接种于培养瓶后2-48 h，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态，细胞的数量，细胞的形态及细胞的贴壁情况等。
绘制细胞生长曲线：利用体积分数为10%甲醛溶液固定第2代培养细胞20 min，加入0.1 g/L的结晶紫染液染色30 min，再用2 mL 10%的冰醋酸抽提，抽提液与双蒸水混匀，在酶标仪上读取590 nm处吸光度值，绘制接种后6 d(接种当天计为0 d)的细胞生长曲线图。
细胞免疫化学法检测CD90和CD117的表达：在6孔培养皿底部铺上载玻片，按2×10⁸ L^-1的细胞浓度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5 d后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。用中性树胶把爬片贴在载玻片上，PBS清洗标本3次各1 min，冰丙酮固定15 min，空气干燥5 min，PBS清洗标本3次各2 min，0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min，PBS清洗标本3次各2 min，体积分数为3%H₂O₂孵育15 min，DPBS清洗标本3次各2 min，封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20 min，一抗孵育(PBS配，滴度1∶200，湿盒)4 ℃过夜或37 ℃ 60 min，PBS清洗标本3次5 min，二抗工作液孵育(湿盒)37 ℃ 30 min，PBS清洗标本3次各5 min，C液(湿盒)37 ℃ 30 min，PBS清洗标本3次各5 min，DAB显色(避光，镜下观察至棕色)3-10 min，蒸馏水洗2次1 min，苏木精复染0.5-1 min，自来水洗30 min，树胶封固，显微镜下观察染色结果。
RT-PCR检测CD90和CD117的表达：取第2代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞后，把细胞悬液移入离心管(15 mL)中，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS吹打混匀成细胞悬液后移入1 mL EP管中，Trizol试剂盒抽提总RNA，加入无RNase的DNaseI 37℃孵育10 min后，70 ℃ 15 min灭活。用获得的RNA进行反转录，取2 μL cDNA产物为模板进行CD90和CD117基因的PCR扩增。
统计学分析：采用SPSS16.0软件分析，数据采用x(_)±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，方差分析前对各组数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk Test)和方差齐性检验(Levene’s Test)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年大量研究均提示子宫内膜可能存在具有高度增殖、自我更新和分化潜能的干细胞，其来源可能是循环中的骨髓干细胞，或者由内膜部分残存的胚胎干细胞发育而来^[5-6]，这些细胞可能参与了多种病理生理过程。既往研究认为有干细胞活性的细胞可能存在于基底层^[7-9]，亦有文献报道在脱落的功能层即月经血中也发现子宫内膜干细胞^[10-11]。

实验分别采用混合法(机械和酶消化相结合)和胶原酶Ⅰ法对组织进行消化，混合法分离人子宫内膜干细胞具有一定优势，其中胶原酶Ⅲ可水解结缔组织中胶原蛋白成分，胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害，且通过机械性目网的筛选作用，可区分出不同大小的细胞，更有利于那些需要区分子宫内膜基质细胞和上皮细胞的实验研究。而胶原酶Ⅰ法消化得到的子宫内膜干细胞细胞数量多，细胞培养易于成活，生长状态良好，但消化时间较长，消化后的细胞黏度较大，且操作比较复杂，细胞数量的损失较大，细胞贴壁需要时间较长[^12-13]。但两种分选方法对细胞的生长周期均无明显影响，因此，混合法较胶原酶Ⅰ法有更大的优势。

由于子宫内膜干细胞尚未发现特异性的表面标志物，所以其鉴定问题多数的学者仍是依靠在造血、神经、表皮或其他系统中的干细胞标记去研究子宫内膜干细胞^[14-15]。实验采用了目前较常用的干细胞的主要标志物CD90和CD117^[16]，应用免疫细胞化学方法和RT-PCR法均检测到两种标记物在子宫内膜细胞中的表达，提示这些细胞具有干细胞特性，而在子宫肌层组织中不表达。这些实验结果均为后续的人子宫内膜干细胞的研究奠定了基础。

基金资助：广东省医学科研课题(B2010208) ；广东省自然科学基金博士科研启动项目(10451051501005729)。
作者贡献：第一作者马颖为实验设计及主要实验实施者，并对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：子宫内膜来源于因CINⅢ级行子宫切除的女性，患者同意其用于科学研究，并签署知情同意书。该研究方案获医院伦理委员会批准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

文章快阅

延伸阅读

近年有大量的研究均提示子宫内膜可能存在具有高度增殖、自我更新和分化潜能的干细胞，其来源可能是循环中的骨髓干细胞，或者由内膜部分残存的胚胎干细胞发育而来，这些细胞可能参与了多种病理生理过程。既往研究认为有干细胞活性的细胞可能存在于基底层，亦有文献报道在脱落的功能层即月经血中也发现子宫内膜干细胞。本实验分别采用混合法(机械和酶消化相结合)和胶原酶Ⅰ法对组织进行消化，混合法分离人子宫内膜干细胞具有一定优势，其中胶原酶Ⅲ可水解结缔组织中胶原蛋白成分，胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害，且通过机械性目网的筛选作用，可区分出不同大小的细胞，更有利于那些需要区分子宫内膜基质细胞和上皮细胞的实验研究。而胶原酶Ⅰ法消化得到的子宫内膜干细胞细胞数量多，细胞培养易于成活，生长状态良好，但消化时间较长，消化后的细胞黏度较大，且操作比较复杂，细胞数量的损失较大，细胞贴壁需要时间较长。但两种分选方法对细胞的生长周期均无明显影响，因此，混合法较胶原酶Ⅰ法有更大的优势，这可成为分选子宫内膜干细胞的高效、方便的方法。由于子宫内膜干细胞尚未发现特异性的表面标志物，所以其鉴定问题多数的学者仍是依靠在造血、神经、表皮或其他系统中的干细胞标记去研究子宫内膜干细胞。本实验采用了目前较常用的干细胞的主要标志物CD90和CD117[19-20]，应用免疫细胞化学方法和RT-PCR法均检测到两种标记物在子宫内膜细胞中的表达，提示这些细胞具有干细胞特性，而在子宫肌层组织中不表达。这些实验结果均为后续的人子宫内膜干细胞的研究奠定了基础。