2.1 成熟大鼠海马神经胶质抗原2阳性神经祖细胞原代培养 应用以前报道的方法原代培养成熟大鼠海马神经胶质抗原2阳性神经祖细胞^[9]。神经胶质抗原2阳性神经祖细胞的纯度在原代培养第7天达90%左右，经1次传代后上升至95%左右，且经多次传代仍保持95%以上。

2.2 脑蛋白水解物注射液对神经元标识蛋白微管相关蛋白2a+2b表达的影响 原代培养细胞在第14天增殖形成集落，95%以上神经胶质抗原2阳性细胞共表达微弱微管相关蛋白2a+2b。相比于对照组，10 μg/L血小板衍生生长因子干预使神经胶质抗原2阳性集落中细胞的形态发生了改变，细胞突起延长，继而集落中细胞密度降低；血小板衍生生长因子还使神经胶质抗原2表达水平降低，但微管相关蛋白2a+2b表达水平未受影响。 10 μg/L脑源性神经营养因子干预使微管相关蛋白2a+2b表达水平增加，特别是在群落周边，但细胞形态、密度和神经胶质抗原2表达水平未受影响。10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预，使血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子单独作用的效果综合，在神经胶质抗原2阳性细胞集落周边可见神经胶质抗原2弱阳性而微管相关蛋白2a+2b强阳性的神经元样细胞，见图1。

体积分数为1%脑蛋白水解物注射液干预使微管相关蛋白2a+2b表达水平(免疫反应阳性面积和强度)增加至与10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预组相近的水平，且与血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预理相似，同时改变了集落中细胞形态。集落中心的许多微管相关蛋白2a+2b阳性细胞呈小圆形，有多条较短突触，而集落周边的细胞突起更长，类似神经元样细胞，见图2。

2.3 脑蛋白水解物注射液对神经元突触标识蛋白突触蛋白Ⅰ表达的影响 对照组神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中突触蛋白Ⅰ表达很微弱；10 μg/L血小板衍生生长因子或10 μg/L脑源性神经营养因子单独干预组， 神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中突触蛋白Ⅰ表达水平与对照组无明显差异；10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预组，偶尔能观察到突触蛋白Ⅰ强阳性细胞，但体积分数为1%脑蛋白水解物注射液干预使神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中突触蛋白Ⅰ表达水平明显增加，见图3。

2.4 脑蛋白水解物注射液对γ-氨基丁酸能细胞标识蛋白γ-氨基丁酸表达的影响 第14天，对照组神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中表达少量γ-氨基丁酸。单一的 10 μg/L血小板衍生生长因子或10 μg/L脑源性神经营养因子干预未使神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中γ-氨基丁酸水平明显改变，但10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预使γ-氨基丁酸表达水平明显增加。体积分数为1% 脑蛋白水解物注射液干预使γ-氨基丁酸表达增加水平与10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预组相近，见图4。

2.5 脑蛋白水解物注射液对γ-氨基丁酸能细胞标识蛋白囊泡γ-氨基丁酸转运体表达的影响 第14天，对照组神经胶质抗原2阳性神经祖细胞只在胞体表达微量囊泡γ-氨基丁酸转运体；10 μg/L血小板衍生生长因子或10 μg/L脑源性神经营养因子单独干预未明显改变神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中囊泡γ-氨基丁酸转运体的水平，体积分数为1% 脑蛋白水解物注射液干预与10 μg/L血小板衍生生长因子和10 μg/L脑源性神经营养因子联合干预组均显著增加囊泡γ-氨基丁酸转运体表达，且水平相近，并使囊泡γ-氨基丁酸转运体分布从胞体扩展到所有突起。囊泡γ-氨基丁酸转运体的表达变化与微管相关蛋白2a+2b相似，更常见于神经胶质抗原2阳性神经祖细胞集落周边部，并伴随神经元样形态学变化，见图5。

2.6 脑蛋白水解物注射液对神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数的影响 第1代传代神经胶质抗原2阳性神经祖细胞纯度高、增殖活跃，用于研究脑蛋白水解物注射液对神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数的影响。细胞活性用乳酸脱氢酶含量测定法测定，其吸光度值与活细胞数量成正比。与对照组相比，在添加体积分数为0.2%，0.5%，1%，2%，5%脑蛋白水解物注射液组吸光度值都明显增加，见图6，说明脑蛋白水解物注射液能显著增加神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数。

2.7 脑蛋白水解物注射液对神经胶质抗原2阳性神经祖细胞凋亡的影响 原代培养神经胶质抗原2阳性神经祖细胞经脑蛋白水解物注射液干预14 d，用TUNEL染色法检测凋亡细胞。与对照组相比，神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中TUNEL染色阳性细胞在体积分数为1%脑蛋白水解物注射液干预组显著减少；对照组凋亡指数(21.53±2.25)与脑蛋白水解物注射液干预组(14.22± 4.70)相比，显著降低(P < 0.05)，提示脑蛋白水解物注射液明显抑制神经胶质抗原2阳性神经祖细胞凋亡，见图7。

2.8 脑蛋白水解物注射液对神经胶质抗原2阳性神经祖细胞分裂新生的影响 原代培养神经胶质抗原2阳性神经祖细胞经脑蛋白水解物注射液干预14 d，掺入BrdU并做BrdU和神经胶质抗原2免疫荧光双重染色。增殖指数(BrdU阳性细胞占神经胶质抗原2阳性神经祖细胞百分比)在对照组与体积分数为0.5%脑蛋白水解物注射液组或体积分数为1%干预组无明显变化，提示脑蛋白水解物注射液对神经胶质抗原2阳性神经祖细胞新生无显著促进，见图8。

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神经胶质抗原2是一种硫酸软骨素多聚糖蛋白，神经胶质抗原2阳性神经祖细胞在中枢神经系统发育过程中持续存在，也是成熟中枢神经系统中最大的增殖细胞群体^[1]。神经胶质抗原2阳性神经祖细胞有多分化潜能且功能多样^[1-2]，除对神经元和突触信号提供生理支持^[3]，在脑修复和再生中也发挥关键作用^[4]，还与精神异常密切相关^[5-6]。脑蛋白水解物注射液能缓解多种神经系统疾病的症状，尤其是阿尔茨海默病或缺血性脑卒中患者的认知能力^[7]。研究显示，脑蛋白水解物注射液具有类似神经生长因子的神经营养和神经保护作用，能调节改善神经元代谢，促进突触形成，诱导神经元分化，保护神经细胞免受缺血和神经毒素损害^[8]。实验即探讨脑蛋白水解物注射液对体外培养的成熟大鼠神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增殖和分化的影响。

设计：体外诱导细胞学实验。
时间及地点：实验于2008年3月至2009年10月在河北医科大学第二医院神经病学河北省重点实验室完成。
材料：
实验动物：健康成年(3-6个月龄)雌性SD大鼠8只，体质量(250±50) g，购自北京维通利华实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2007-001。
主要试剂及仪器：
Main experimental reagents and instruments:

 

 

实验方法：
原代细胞培养：应用于秀军等^[9]报道的方法分离培养原代成年大鼠海马神经胶质抗原2阳性神经祖细胞。大鼠麻醉后冰上快速无菌取双侧海马，切碎(<0.5 mm³)后移入备好的2 g/L木瓜蛋白酶消化液，170 r/min、30 ℃振荡消化30 min。吹打分散组织消化液，静置2 min，上清移至不连续密度梯度离心液(浓度分别为7%，9.4%，11.7%和16.4%的Optiprep)表面，于室温800×g离心15 min。收集在11.7%与16.4%之间分离出的密集组织细胞层悬液，200×g离心5 min后弃上清，细胞团块再悬浮于基础培养液(Neurobasal A+双抗+0.5 mmol/L L-谷氨酰胺+2% B27+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)。以合适密度接种于已包被0.01%多聚赖氨酸的培养皿中，于体积分数为5%CO₂培养箱(37 ℃，饱和湿度)培养，每2 d或3 d更换半量培养液，加全量碱性成纤维细胞生长因子，细胞增殖至70%-90%融合状态时传代。
药物干预：在8孔Biocoat LabTek Chamber中将适当密度(1 500/cm²)的原代分离细胞播种，对照组细胞在基础培养液中连续培养14 d，干预组细胞在第7天添加体积分数为1%脑蛋白水解物注射液(脑蛋白水解物注射液干预组)或添加血小板衍生生长因子或/和脑源性神经营养因子各10 μg/L(P或/和B干预组)继续培养7 d，期间每2 d更换半量培养液，加全量碱性成纤维细胞生长因子和所添加药物，第14天固定后染色。
免疫荧光染色：细胞经固定、渗透化和封闭，以 1∶1 000浓度的一抗于4℃孵育过夜。洗涤后，用 1∶1 000浓度的荧光二抗于室温下避光孵育1 h。为实现核复染色，加入1∶1 000浓度的TO-pro-3碘(642/661)与二抗共同孵育。用共聚焦激光扫描显微镜观察，摄影，并用附带软件定量免疫反应阳性强度(以亮度表示)及面积(以像点数表示)。实验使用的一抗为小鼠抗微管相关蛋白2a+2b、突触蛋白Ⅰ、γ-氨基丁酸和BrdU，兔抗囊泡γ-氨基丁酸转运体，兔和小鼠抗神经胶质抗原2；二抗为568山羊抗兔和小鼠及Alexa Fluor 488山羊抗兔和小鼠IgG抗体。
乳酸脱氢酶分析法测定细胞活性：第1代传代细胞以每孔含1×10⁸ L^-1培养液的浓度播种在包被多聚赖氨酸的96孔培养板。第2天，以基础培养液中分别添加体积分数为0，0.2%，0.5%，1%，2%，5%脑蛋白水解物注射液的新培养液替代原基础培养液，以后每2 d更换半量培养液，加全量碱性成纤维细胞生长因子和脑蛋白水解物注射液。为消除培养液和实验药剂对测定结果的影响，所有步骤同步实施于未播种细胞的空白培养板。第6天用CytoTox 96 Assay试剂盒，测定乳酸脱氢酶含量，其吸光度值与活细胞数量成正比。各种培养条件均设6孔重复，结果取6孔平均值。
TUNEL法检测细胞凋亡：第1代传代细胞以适当密度(3 000/cm²)播种在8孔Biocoat LabTek Chamber。第2天，以基础培养液中分别添加体积分数为0，1%脑蛋白水解物注射液的新培养液替代原基础培养液，以后每2 d更换半量培养液，并加全量碱性成纤维细胞生长因子和脑蛋白水解物注射液。第6天，将细胞固定、渗透化、按说明书TUNEL染色后，免疫荧光复染。在显微镜下，随机选取10倍放大视野20个计数细胞并计算凋亡指数(平均每100个神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中含凋亡细胞个数)。
BrdU掺入与染色：以适当密度(3 000/cm²)将第1代传代细胞播种在8孔Biocoat LabTek Chamber。第2天，以基础培养液中分别添加体积分数为0，0.5%，1% 脑蛋白水解物注射液的新培养液替代原基础培养液，以后每2 d更换半量培养液，并加全量碱性成纤维细胞生长因子和脑蛋白水解物注射液。第6天，加入终质量浓度为50 mg/L BrdU，继续培养6 h后，进行BrdU标记细胞染色。封闭前用2 mol/L HCl 37 ℃变性30 min，其他步骤与免疫荧光染色相同。在显微镜下随机选取10倍放大视野20个计数细胞并计算增殖指数(平均每100个神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中含新生细胞个数)。
主要观察指标：①细胞形态学变化。②细胞免疫荧光染色鉴定。③细胞免疫荧光染色阳性强度变化。④乳酸脱氢酶含量法测定活细胞数量变化。⑤TUNEL染色法检测细胞凋亡变化。⑥BrdU标记染色观察细胞分裂新生状况。
统计学分析：以SPSS 11.0软件分析实验数据，以x(_)±s表示结果，组间比较采用t 检验统计方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

神经胶质抗原2阳性神经祖细胞功能多样，作为中枢神经系统损伤的主要响应神经细胞类型^[4，10]，在脑修复和再生中发挥关键作用^[4]，还对神经元和突触信号提供生理支持^[3]，并参与少突胶质细胞和神经发生^[11]。脑蛋白水解物注射液是健康猪脑经酶水解制成的无菌制剂，主要成分为约25%低分子肽和75%(约16种)游离氨基酸^[8]，作为神经营养和保护药物广泛应用于多种神经系统疾病^[7]。据药理和临床试验表明：脑蛋白水解物注射液有调节改善神经元代谢，促进突触形成，诱导神经元分化，保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素损害的作用。实验证明血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子对神经细胞生存、增殖、分化等起重要作用^[12]。实验以血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子为参照，发现脑蛋白水解物注射液可促进体外培养的成熟大鼠神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增殖并向神经元(特别是γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元)分化。

研究发现，不同浓度脑蛋白水解物注射液干预组细胞数较对照组均明显增加，充分显示脑蛋白水解物注射液有促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数增加的作用。进一步发现，脑蛋白水解物注射液通过抑制细胞凋亡，提高细胞生存率，促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数增加，而未影响细胞分裂新生。

2000年，Jacobs等^[13]提出神经新生异常假说，认为抑郁症的病因之一可能是生理的、持续的海马齿状回神经新生减少。电惊厥疗法对精神分裂症和情感性精神障碍疗效显著，有文献报道，电惊厥疗法使海马和杏仁核神经胶质抗原2阳性细胞数显著增加^[5-6]，表明神经胶质抗原2阳性神经祖细胞可能是其主要治疗靶点之一。实验发现脑蛋白水解物注射液通过抗凋亡促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数增加，提示脑蛋白水解物注射液还可能对神经精神障碍有治疗潜力。

原代培养第14天，神经胶质抗原2阳性神经祖细胞同时表达微弱微管相关蛋白2a+2b，显示其分化成神经元的潜力。血小板衍生生长因子干预使神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向神经元样形态改变，脑源性神经营养因子干预增加了微管相关蛋白2a+2b表达水平，而血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预，使微管相关蛋白2a+2b强阳性神经元样形态细胞出现在神经胶质抗原2阳性集落周边。说明血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子分别以不同机制促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向神经元分化，二者联合起到了协同作用。脑蛋白水解物注射液促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞微管相关蛋白2a+2b表达水平增加和向神经元样形态分化的能力与血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合作用相似。而且脑蛋白水解物注射液使集落中细胞密度增加，有多条较短突触的小圆形微管相关蛋白2a+2b阳性细胞出现在集落中心，进一步显示脑蛋白水解物注射液增加神经胶质抗原2阳性神经祖细胞数的能力。

突触蛋白Ⅰ是最具特异性的突触标记之一，与突触小泡惟一相关^[14]。血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预只能使突触蛋白Ⅰ在神经胶质抗原2阳性神经祖细胞的表达水平轻微增加，而脑蛋白水解物注射液干预明显增加突触蛋白Ⅰ在神经胶质抗原2阳性神经祖细胞的表达水平，说明脑蛋白水解物注射液增强突触蛋白Ⅰ表达水平的能力比血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预更强。

有人认为，内源性神经再生失败是导致阿尔茨海默病、帕金森病和脊髓侧索硬化症等神经退行性病变的原因之一。实验证明阿尔茨海默病患者脑内的神经干细胞不能主动激活，神经元大量破坏、减少，而神经干细胞的基本增殖、迁移和分化显著减弱，神经元无法再生，造成记忆和认知与神经元退变程度一致的减退^[15]。某些外源性药物能诱导神经干细胞增生，并分化成神经元，替代阿尔茨海默病病程中丢失的神经元，从而改善认知功能^[16]。实验发现脑蛋白水解物注射液促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中神经元标识蛋白微管相关蛋白2a+2b和突触蛋白Ⅰ表达水平增加的能力，达到甚至超过血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预的效果，证明脑蛋白水解物注射液能显著促进体外培养的神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向神经元分化。提示脑蛋白水解物注射液改善阿尔茨海默病患者认知功能，可能与其促进神经干细胞增殖和分化，替代阿尔茨海默病病程中丢失的神经元细胞有关。

囊泡γ-氨基丁酸转运体能吸收和储存突触小泡内的γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸能神经末梢和突触的最好标记之一。对照组神经胶质抗原2阳性神经祖细胞只在胞体内表达微量囊泡γ-氨基丁酸转运体，与神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中有少量γ-氨基丁酸表达的发现一致。脑蛋白水解物注射液干预与血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预均使γ-氨基丁酸和囊泡γ-氨基丁酸转运体表达显著增加，且伴随细胞分布和神经元样形态学变化。提示脑蛋白水解物注射液与血小板衍生生长因子和脑源性神经营养因子联合干预相似，能促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向γ-氨基丁酸能中间神经元分化。

研究揭示，γ-氨基丁酸能中间神经元活性受损与神经精神疾病的病理机制密切相关，γ-氨基丁酸能神经元再生缺陷可能造成γ-氨基丁酸能系统功能障碍^[17]。衰老与海马抑制性中间神经元功能和/或数目的减低也密切相关，兴奋和抑制的不平衡可能在高龄伴随的感觉、运动和认知下降中发挥关键作用^[18]。神经胶质抗原2阳性神经祖细胞本身或神经分化后，可能在抑制性神经传导中扮演重要角色。脑蛋白水解物注射液促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元分化，进一步提示其对神经精神障碍和衰老相关症状的治疗潜力。

总之，实验发现脑蛋白水解物注射液在体外能通过抑制凋亡促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增生，且脑蛋白水解物注射液干预与脑源性神经营养因子和血小板衍生生长因子联合干预相似，能使神经胶质抗原2阳性神经祖细胞中微管相关蛋白2a+2b、突触蛋白Ⅰ、γ-氨基丁酸和囊泡γ-氨基丁酸转运体表达水平显著增加，并使细胞向神经元样形态变化，提示脑蛋白水解物注射液有促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向神经元，尤其是γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元分化的潜能，同时提示脑蛋白水解物注射液可能在神经精神障碍和抗衰老的治疗或辅助治疗方面有一定疗效。

基金资助：河北省教育厅科学研究计划项目(2009005)；河北省卫生厅重点科技研究计划(20100085)；河北省自然科学基金(C2011206075)；新华区科学技术研究与发展计划。
作者贡献：实验设计为于秀军，实验实施为于秀军、李奕、温迪，实验评估为于秀军，资料收集为李奕。于秀军成文，于秀军审校，于秀军对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学标准的条例。
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脑蛋白水解物注射液能抑制神经胶质抗原2阳性神经祖细胞凋亡，促进神经胶质抗原2细胞增殖，并能促进神经胶质抗原2阳性神经祖细胞向神经元，特别是γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元的分化。

目前，有关脑蛋白水解物注射液的文章，绝大多数是药物临床疗效观察或不良反应典型病例分析，还有部分关于药物质量和活性测定分析的文章。对脑蛋白水解物注射液在细胞水平作用机制的研究很少看到，脑蛋白水解物注射液对神经干细胞影响的文章更是少之又少。本实验室探索建立了高纯度神经胶质抗原2抗体阳性神经祖细胞培养方法，该细胞在体内和体外均具有神经干细胞特性。本文观察了脑蛋白水解物注射液对体外培养的神经胶质抗原2阳性细胞增殖和分化的影响，从细胞学水平阐述了脑蛋白水解物注射液的又一可能作用机制。

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