糖尿病对内皮祖细胞移植促血管新生作用的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.016

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 1044-1048.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.016

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糖尿病对内皮祖细胞移植促血管新生作用的影响

周晨光¹，宫经新²，马跃²，周亚茹³，栾锋⁴，杨彦²，孟建波²

1河北工程大学附属医院血液内科，河北省邯郸市 056000
2河北医科大学第三医院血液内科，河北省石家庄市 050051
3河北医科大学第三医院内分泌科，河北省石家庄市 050051
4河北医科大学第三医院五官科，河北省石家庄市 050051

收稿日期:2012-05-05 修回日期:2012-06-03 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 孟建波，博士，副教授，河北医科大学第三医院血液内科，河北省石家庄市 050051 mjb1972@tom.com
作者简介:周晨光★，男，1975年生，河北省邯郸市人，汉族，2010年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事血液肿瘤和干细胞移植工作。 mjb1972@tom.com

Does diabetes mellitus influence angiogenesis-promoting effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation?

Zhou Chen-guang¹, Gong Jing-xin², Ma Yue², Zhou Ya-ru³, Luan Feng⁴, Yang Yan², Meng Jian-bo²

1 Department of Hematology, Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering, Handan 056000, Hebei Province, China
2 Department of Hematology, Third Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
3 Department of Endocrinology, Third Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
4 Department of Otorhinolaryngology, Third Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Received:2012-05-05 Revised:2012-06-03 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Meng Jian-bo, M.D., Associate professor, Department of Hematology, Third Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China mjb1972@tom.com
About author:Zhou Chen-guang★, Master, Attending physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering, Handan 056000, Hebei Province, China mjb1972@tom.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：内皮祖细胞为血管新生的前体细胞，通过促血管新生作用治疗糖尿病血管病变有着良好的前景。
目的：探讨糖尿病对内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病过程中促血管新生作用的影响。
方法：制备糖尿病大鼠模型，提取糖尿病和正常大鼠供体骨髓单个核细胞体外定向培养为内皮祖细胞。同时建立糖尿病及正常大鼠下肢缺血模型，并于缺血病变部位局部移植糖尿病或正常大鼠内皮祖细胞或PBS进行对照。移植后定期应用ELISA方法检测病变部位血管内皮生长因子含量，应用免疫组化方法计数病变部位微血管密度。
结果与结论：①受体相同，移植物不同时：移植糖尿病大鼠来源或正常大鼠来源内皮组细胞后，下肢缺血组织中血管内皮生长因子水平及微血管密度比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。②移植物相同，受体不同时：正常大鼠移植内皮祖细胞后下肢缺血组织中血管内皮细胞生长因子含量和微血管密度均高于糖尿病组。说明在体外定向培养和病变部位局部注射条件下，糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植促血管新生作用无明显影响，而对血管新生所处的病变部位微环境有明显影响。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 内皮祖细胞, 移植, 糖尿病, 下肢缺血, 血管新生, 血管内皮细胞生长因子, 微血管密度

Abstract:

BACKGROUND: As an angiogenic precursor cells, endothelial progenitor cells have a good prospect in the treatment of diabetic vascular disease by promotion of angiogenesis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of diabetes mellitus on the promotion of angiogenesis in the ischemic lower limb by transplantation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells.
METHODS: Rat models of diabetes mellitus were developed. Bone marrow mononuclear cells from the diabetes mellitus and normal rats were extracted and in vitro cultured towards endothelial progenitor cells. At the same time, diabetes mellitus and normal rat models of ischemic lower limb were established and received local transplantation of diabetes mellitus or normal rat endothelial progenitor cells or PBS into the ischemic region. After transplantation, vascular endothelial growth factor content and microvessel density in the lesion region were determined by ELISA and immunohistochemistry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When the recipients were the same, there were no significant differences in vascular endothelial growth factor content and microvessel density in the ischemic tissue between different donors after transplantation of endothelial progenitor cells from diabetes mellitus or normal rats (P > 0.05). (2) When the donors were the same, vascular endothelial growth factor content and microvessel density in the ischemic tissue were significantly greater in the normal rats than those in the diabetes mellitus rats. These findings suggest that diabetes mellitus exhibits no effects on the promotion of angiogenesis by local transplantation of the in vitro cultured endothelial progenitor cells but it greatly impacts the microenvironment of the lesion regions where angiogenesis occurs.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, endothelial progenitor cells, transplantation, diabetes mellitus, lower limb ischemia, angiogenesis, vascular endothelial growth factor, microvascular density

中图分类号:

R394.2

周晨光，宫经新，马跃，周亚茹，栾锋，杨彦，孟建波. 糖尿病对内皮祖细胞移植促血管新生作用的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1044-1048.

Zhou Chen-guang, Gong Jing-xin, Ma Yue, Zhou Ya-ru, Luan Feng, Yang Yan, Meng Jian-bo. Does diabetes mellitus influence angiogenesis-promoting effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation?[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1044-1048.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：分组样本对比观察。
时间及地点：于2009年7月至2011年3月在河北医科大学第三医院实验中心完成。
材料：健康6周龄封闭群Wistar大鼠120只，体质量160-180 g，雌性，清洁级，由河北省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，合格证编号：909120。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
主要试剂与仪器：
Main experimental reagents and instruments:

方法：
糖尿病大鼠模型的制备：取60只封闭群Wistar大鼠禁食不禁水12 h后，将10 g/L的链脲佐菌素(STZ)溶液按65 mg/kg对大鼠行腹腔注射。注射后24 h血糖≥16.7 mmol/L，稳定5 d，糖尿病大鼠模型即造模成功^[3-4]。
内皮祖细胞的培养及鉴定：大鼠糖尿病造模成功后1周，取24只糖尿病大鼠和24只正常大鼠颈椎脱臼法处死后取出双下肢股骨和胫骨，冲出骨髓洗涤后淋巴细胞分离液离心，取白膜层，PBS洗涤后计数，分别按1×10⁶/cm²浓度加入添加体积分数10%进口胎牛血清和细胞因子(血管内皮细胞生长因子2 mg/L，碱性成纤维细胞生长因子10 mg/L，胰岛素样生长因子1 5 mg/L)的α-MEM培养液中，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，48 h半量换液，以后每3 d半量换液1次。第7天应用0.25%胰酶及EDTA消化后，调整细胞密度为4×10⁵ L^-1准备移植，并取适量细胞爬片后经免疫组化CD34、CD133、Flk-1鉴定为内皮祖细胞^[5]。
糖尿病及正常大鼠下肢缺血模型的制备^[6]：取造模成功并稳定1周后的糖尿病大鼠和正常大鼠各36只，1%的戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔注射麻醉。将双侧下肢切开、分离、将股动脉及其大的分支结扎后离断，逐层缝合。
分组并移植：两组大鼠后肢缺血模型造模成功后7 d，全身麻醉并固定四肢后，选取治疗位点，以大鼠缺血下肢伤口近端0.5 cm处为起点，沿伤口方向向肢体远端，每0.5 cm为一个移植部位，双侧共取10个位点。分别将糖尿病下肢缺血组及正常下肢缺血组各36只大鼠随机均分为3组，分别注射糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞悬液，细胞总量为4×10⁵个；等量的正常大鼠内皮祖细胞混悬液以及注射PBS作为对照。每个部位注射0.1 mL，共计1 mL液体。
血管内皮细胞生长因子测定：移植1周后，每组取6只大鼠颈椎脱臼法处死大鼠后，切取双侧下肢腓肠肌组织，称取100 mg，剪碎放入匀浆器中，加入PBS溶液 1 mL(混合后浓度为10%)，置冰上研磨匀浆。4 ℃离心 2 000 r/min，取上清液，应用测定血管内皮细胞生长因子的ELISA试剂盒按试剂盒说明书操作后，酶标仪测定血管内皮细胞生长因子水平。
微血管密度计数：移植后第28天，将所有大鼠全麻后切取大鼠双侧注射部位肌肉，分别40 g/L多聚甲醛固定，免疫组化Ⅷ染色，高倍镜下计数测微血管密度。
统计学分析：应用SAS 8.0统计软件进行分析，各组数据用x(_)±s表示，相同受体各组间的比较采用随机区组设计的ANOVA方差分析，各组与组之间的比较采用Q检验，设P < 0.05差别有显著性意义，相同移植物各组间的比较采用两样本的t 检验，设P < 0.05差别有显著性意义。

讨论

内皮祖细胞是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞^[7]，目前普遍认为内皮祖细胞来源于中胚层造血/成血管细胞，不仅在胚胎期参与血管生成，而且在出生后也参与血管新生过程^[8]，具有促进组织器官，尤其是缺血组织器官内皮细胞修复、建立侧支循环和恢复血供的作用^[9-12]。内皮祖细胞功能的发挥除与其可直接转化形成血管内皮细胞生成新的血管外，也可通过分泌血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等多种细胞因子的自分泌、旁分泌作用促进血管新生^[13-14]。目前多将同时具有CD34，CD133，Flk-1三种表面标志的细胞定义为内皮祖细胞^[15]。内皮祖细胞主要定居于骨髓，在骨髓、脐血和外周血三者含量之比约为15∶10∶1^[16]。内皮祖细胞在体内的数量很少，在骨髓和外周血中内皮祖细胞的比例也只有0.01%，但有研究表明新生血管中25%的内皮细胞是由内皮祖细胞分化而来的^[17]。内皮祖细胞血管新生的过程包括内皮祖细胞的动员、迁移、归巢和分化等一系列发展衍化过程^[18]。

由于内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，内皮祖细胞移植有希望成为治疗血管性疾病的理想方法^[19]，临床上已有内皮祖细胞移植成功治疗心肌梗死、脑梗死、糖尿病足的少量报道^[20-22]。内皮祖细胞移植成功与否决定于内皮祖细胞本身质量和移植后促血管新生所处的微环境，就像植物生长需要优良的种子和肥沃的土壤一样。糖尿病是损害全身多器官的代谢性疾病，其对内皮祖细胞和移植后血管新生所处的微环境的影响决定了移植的成败。McClung等^[23]报道2型糖尿病患者外周血中内皮祖细胞数目比健康人平均降低约40%。Loomans^等[24]发现1型糖尿病患者同样存在外周血内皮祖细胞功能异常。Kuki^等[25]发现，高血糖通过p38丝裂原活化蛋白激酶的激活而促进内皮祖细胞的衰老和凋亡，暴露在高糖环境下内皮祖细胞的p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化增加,与葡萄糖剂量呈正相关,而且加入p38丝裂原活化蛋白激酶的抑制剂SB203580后此过程可以被显著的抑制。本实验比较了糖尿病和正常大鼠的骨髓来源内皮祖细胞移植后的促血管新生作用，发现二者没有显著差异，究其原因，可能是本实验采用骨髓来源的内皮祖细胞经体外培养后直接局部注射的方法，骨髓作为内皮祖细胞的主要来源和主要储存部位，骨髓来源的内皮祖细胞在体外定向培养后，其促血管新生活性未受外周血高血糖及氧化应激等因素的影响^[26]，而直接局部注射又避免了内皮祖细胞从骨髓释放到外周后长期暴露在高糖、高脂等不利环境下，同时使更多的内皮祖细胞集中在缺血部位有利于其旁分泌作用的发挥，更有利于其发挥募集作用和血管新生作用。本实验结果提示糖尿病患者骨髓内有足够数量和质量的内皮祖细胞以供体外培养后移植来治疗自身糖尿病血管病变，不必要采取异体内皮祖细胞移植，从而避免异体移植带来的不良反应。

实验也通过比较移植相同内皮祖细胞(即供体相同)情况下，糖尿病下肢缺血大鼠与非糖尿病下肢缺血大鼠血管新生的差别，证实患糖尿病内皮祖细胞移植后微环境影响了血管新生，可能机制是糖尿病血管病变局部影响了内皮祖细胞血管新生所必须的基质细胞和细胞因子。结果提示在内皮祖细胞移植前糖尿病患者的选择和患肢局部条件的改善是必须的。

综上所述，选择合适的糖尿病患者和移植时机，将自体骨髓来源体外培养的内皮祖细胞病变部位注射移植可能是促进糖尿病患者下肢缺血血管新生的一种很有潜力的治疗方法。

作者贡献：第一作者和通讯作者进行实验设计，实验实施为第一作者，实验评估为通讯作者，资料收集为第二、三作者，第一作者成文，通讯作者审校，第一作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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