Conophylline与尼克酰胺联合诱导脂肪源干细胞为功能性类胰岛细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 1024-1028.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.013

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Conophylline与尼克酰胺联合诱导脂肪源干细胞为功能性类胰岛细胞

杨萍¹，郑勤龙²，王劲峰¹，黄家学¹，³，⁴

1天津大学药物科学与技术学院，天津市 300072
2北欧生物科技(北京)有限公司，北京市 102206
3协和干细胞基因工程有限公司，天津市 300384
4中源协和干细胞生物工程股份公司，天津市 300050

收稿日期:2012-05-23 修回日期:2012-06-27 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 黄家学，教授，协和干细胞基因工程有限公司科学与技术副总裁，中源协和干细胞生物工程股份公司副总经理，国际细胞治疗协会副主席。 jiaxue@gmail.com
作者简介:杨萍★，女，1987年生，汉族，山东省济南市人，天津大学在读硕士，主要从事人体脂肪干细胞的多向分化潜能与临床应用方面的研究。 yangping0531@163.com

Differentiation of adipose-derived stem cells into functional islet-like cells using Conophlline and Nicotinamide

Yang Ping¹, Zheng Qin-long², Wang Jin-feng¹, Huang Jia-xue¹, ³, ⁴

1 School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
2 Nordic Bioscience (Beijing) Ltd., Beijing 102206, China
3 Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd., Tianjin 300384, China
4 Zhongyuan Union Stem Cell Bioengineering Stock Company, Tianjin 30050, China

Received:2012-05-23 Revised:2012-06-27 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Huang Jia-xue, Professor, School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd., Tianjin 300384, China; Zhongyuan Union Stem Cell Bioengineering Stock Company, Tianjin 30050, China jiaxue@gmail.com
About author:Yang Ping★, Candidate for master’s degree of science, School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China yangping0531@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：1型糖尿病的胰岛移植治疗一直面临供体来源不足与免疫排斥两大关键问题，寻找一种自体来源的种子细胞通过组织工程方法制备类胰岛组织可以提供充足新型供体、降低异基因供体移植的不良反应。
目的：分析成人脂肪干细胞体外分化为对葡萄糖敏感、可分泌胰岛素的功能性胰岛样细胞团的能力，探索体外制备类胰岛组织的技术路线。
方法：首先分离纯化人体脂肪干细胞，采用新型植物诱导剂Conophylline与其他诱导因子的不同组合将脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞团，观察不同组合的诱导分化效率，并利用特异性染色、RT-PCR，免疫细胞化学等方法对诱导分化后的细胞团在基因水平与蛋白水平上进行鉴定，最后用ELISA法检测细胞团在不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌情况。
结果与结论：脂肪干细胞具有多能干细胞特性，可诱导分化为具有胰岛素分泌和葡萄糖浓度反应性类胰岛细胞团；Conophylline与尼克酰胺联合诱导可大幅度提高诱导分化效率。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 尼克酰胺, Conophylline, 胰岛样细胞团, 糖尿病, 胰岛素, 分化, 高效诱导, 胰岛分化, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Allogenic islet transplantation for type 1 diabetes is limited by shortage of donor islet cells and immune suppression, bioengineered islet-like clusters developed from autogenic stem cells might benefit diabetic patients by immunorejection free and off-shelf cellular treatment.
OBJECTIVE: To investigate whether adipose tissue from adults have the potential to differentiate into insulin secreting, glucose responsive, functional islet-like clusters and to develop a practical approach for islet bioengineering in vitro.
METHODS: Human adipose stem cells were isolated, cultured and expanded from human subcutaneous adipose tissue. Conophylline, a new plant derived inducer, in combination with other factors were used to induce human adipose stem cells into islet-like clusters and their efficiencies for islet-like clusters generation were compared. Differentiated cells were identified by tissue specific surface marker staining, reverse transcription-PCR and immunocytochemistry at protein and mRNA level. Finally, insulin secretion of cell clusters in different glucose concentrations was tested with enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Multipotential adipose stem cells were cultured and expanded from adult subcutaneous adipose tissues. Those stem cells were conveniently differentiated into glucose responsive and insulin-secreting functional islet-like clusters. Conophylline in combination with Nicotinamide have the best efficiency of differentiating human adipose stem cells into islet cells.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, nicotinamide, conophlline, adipose-derived stem cells, islet-like cells, diabetes, insulin, differentiation, efficient induction, islet differentiation, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

杨萍，郑勤龙，王劲峰，黄家学. Conophylline与尼克酰胺联合诱导脂肪源干细胞为功能性类胰岛细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1024-1028.

Yang Ping, Zheng Qin-long, Wang Jin-feng, Huang Jia-xue. Differentiation of adipose-derived stem cells into functional islet-like cells using Conophlline and Nicotinamide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1024-1028.

图/表（结果） 5

2.1 脂肪干细胞特性 脂肪干细胞(P6)增殖速度较快，六七天细胞长满培养瓶底，呈斡旋状排列，见图1。

2.2 脂肪干细胞分化为功能性胰岛样细胞团 铺板后细胞呈单个细胞悬浮生长，整个诱导过程中，细胞不断聚集形成细胞团，诱导9 d后细胞团边缘渐光滑，直径为50-150 μm，类似于天然胰岛。

诱导9 d后，ELISA法检测5组上清中胰岛素的分泌量，结果显示尼克酰胺、Conophylline、激活素A单独使用及尼克酰胺与激活素A联合诱导时胰岛素分泌量比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，而尼克酰胺与Conophylline联合诱导显著提高了向胰岛样细胞团分化的能力(P < 0.05)，见图2。

免疫细胞化学检测胰岛样细胞团功能蛋白胰岛素的表达，可见细胞团内存在胰岛素阳性细胞，表明诱导分化后已产生具有胰岛素分泌功能的细胞团，见图3。

RT-PCR检测胰岛细胞发育相关基因的表达，结果未分化的脂肪干细胞表达Isl-1，Isl-1是胰岛发育过程中重要的转录调节因子，对胰岛细胞成熟、增殖和分化具有重要作用，经诱导后该基因表达量上调，而胰岛素启动因子Ipf-1仅在诱导后细胞中表达，成熟胰岛细胞的标志基因胰岛素、生长激素抑制激素、胰高血糖素均可在诱导后细胞中检测到，未分化脂肪干细胞中生长激素抑制激素有微弱表达，见图4。

ELISA法检测不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，未在图中反映，而经诱导后的细胞团在5.56 mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经25 mmol/L葡萄糖孵育2 h后胰岛素分泌量明显升高(P < 0.001)，约为低糖条件下2.5倍，由结果可知，诱导后胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外环境糖的调节，见图5。

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引言

糖尿病是一种复杂的代谢类疾病，已成为危害人类健康的隐形杀手。目前外源性胰岛素注射是治疗1型糖尿病的首选方法，但无法从根本上彻底治愈糖尿病，而且易出现低血糖、胰岛素耐受等危及生命的问题^[1]，2000年加拿大Edmonton研究小组的胰岛移植方案在临床试验中取得突破性成功，使7例血糖极不稳定的1型糖尿患者胰岛移植1年后全部停用胰岛素，但供体来源严重不足和免疫排斥问题限制了Edmonton方案的广泛开展^[2-3]，开发新的、没有免疫排斥反应的自体胰岛细胞成为当务之急。

随着干细胞的研究深入，通过自体干细胞诱导分化得到的胰岛细胞不仅可以为胰岛移植提供新的材料来源，同时可避免同种异体移植带来的免疫排斥问题，成为糖尿病治疗最有希望的技术创新领域。胚胎干细胞具有发育的全能性，但存在伦理学上的争论及致瘤性。目前，在许多组织中都发现了成体干细胞，如骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞等，它们具有较强的可塑性，但它们的获得需要经过创伤性手术，具备较大的危险性，会给患者造成痛苦，所以其广泛应用受到限制。2001年，Zuk等^[4-5]从人体脂肪抽取物中成功分离出了脂肪干细胞，它具有与骨髓间充质干细胞类似的特性，可自我更新，具有低免疫原性和多向分化的能力，而且体内分布广，取材方便无痛苦，细胞获取效率高，如果可以用来治疗糖尿病，将解决细胞来源和获取问题^[6]。有研究表明^[7]，人体脂肪干细胞表达与胰腺内分泌细胞形成相关的关键性转录因子Pax-6，可能会有效的分化为胰岛素分泌细胞用于自体移植治疗糖尿病。目前已有众多诱导方法将脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，但诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少、功能低，因此需要寻找一种更有效的诱导方法提高诱导分化效率。

实验采用一步法悬浮诱导方案将人体脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞团，并探索了尼克酰胺联合Conophylline的诱导促进作用，对诱导产物进行形态鉴定和功能检测，从而为糖尿病的细胞治疗提供种子细胞。

材料方法

设计：细胞体外观察试验。
时间及地点：实验于2010年4月至2011年11月在天津大学药物科学与技术学院完成。
材料：人体脂肪组织来源于北京武警总医院健康吸脂者，抽吸部位为腹部，健康志愿者对实验知情同意，并签署知情同意书。
主要试剂、仪器：
Main experimental reagents and instruments:

方法：
脂肪干细胞的分离、培养：无菌条件下取脂肪组织， 0.1% Ⅰ型胶原酶溶液，37 ℃水浴振荡消化1 h。去除上层脂肪细胞与胶原酶溶液，用含体积分数10%FBS的DMEM重悬细胞，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养^[8]，每3 d换液，观察细胞生长及形态变化特征。
体外诱导脂肪干细胞分化为胰岛样细胞团：将P5代脂肪干细胞接种于6孔超低吸附培养板，诱导液成分：高糖DMEM，10 mmol/L尼克酰胺，100 μg/L Conophylline，2 nmol/L激活素A，10 μg/L β细胞调节素，100 pmol/L肝细胞生长因子，2%B-27，1%N-2，按下列分组进行诱导：①尼克酰胺+β细胞调节素+肝细胞生长因子。②尼克酰胺+Conophylline+β细胞调节素+肝细胞生长因子。③Conophylline+β细胞调节素+肝细胞生长因子。④激活素A+β细胞调节素+肝细胞生长因子。⑤尼克酰胺+激活素A+β细胞调节素+肝细胞生长因子。观察细胞形态变化。
免疫细胞化学检测：将胰岛样细胞团转移至包被有多聚赖氨酸的盖玻片培养过夜。40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，0.5% Triton X-100穿透15 min。加入鼠抗人胰岛素(1∶300)抗体，4 ℃过夜，加入羊抗鼠IgG，IgM，Alexafluor488 (1∶800)，37 ℃孵育30 min^[9]。
RT-PCR基因表达分析：应用TRIzol试剂提取脂肪干细胞、诱导后细胞总RNA，取1 μg RNA用反转录试剂盒合成cDNA。进行PCR反应，取PCR扩增产物，2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。所用引物序列，见表1。
葡萄糖刺激胰岛素分泌实验：取诱导9 d的细胞团，用PBS清洗2遍。加入1 mL无糖DMEM预培养3 h，然后以300 μL含5.6 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2 h，37 ℃。收集上清液，用ELISA法检测上清中胰岛素的分泌量。
主要观察指标：脂肪干细胞诱导分化过程中形态学变化，诱导后细胞经免疫细胞化学染色、RT-PCR、ELISA鉴定结果，Conophylline与尼克酰胺对向胰岛样细胞团分化的促进作用。
统计学分析：各组所得计量数据以x(_)±s表示，用SPSS 10.0进行统计学分析，两组间均数比较用t 检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，严重危害人类健康^[10]。胰岛移植是治疗糖尿病的最有效方式，但供体细胞严重不足，需寻找新的胰岛移植替代物。人脂肪组织是临床手术、美容整形的副产品，取材方便，量多，不涉及伦理问题，已有报道称人脂肪组织中富含具有多向分化潜能的干细胞。

目前将成体干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式^[11]。而本实验采用一步法悬浮诱导，利用尼克酰胺与Conophylline联合诱导人脂肪干细胞向胰岛样细胞团分化，以便获得更多的胰岛样细胞团。Conophylline具有诱导胰腺前体细胞模型-AR42J细胞体外分化为胰岛素分泌细胞的能力，并且和激活素A相比，Conophylline相对分子质量小，易于渗透，不会诱导细胞的凋亡，被认为是一种具有良好生物适应性的植物诱导剂^[12]。已有文献报道Conophylline诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率比激活素A更高^[9]。但目前还未研究过尼克酰胺与Conophylline联合诱导的效率，因此实验采用尼克酰胺与Conophylline联合诱导，观察诱导效率。结果两者联合诱导可以显著提高胰岛样细胞团的分化效率，与两者单独诱导及激活素A诱导相比，胰岛素分泌量有显著差异，细胞在诱导9 d左右可以达到最大程度的成熟。

RT-PCR检测到诱导后细胞表达与β细胞发育相关的转录激活子Ipf-1、转录调节因子Isl-1以及胰腺内分泌细胞的标志基因胰岛素，生长激素抑制激素，胰高血糖素。而在未诱导的人脂肪干细胞中，Isl-1与生长激素抑制激素也有微弱表达，其中Isl-1不仅存在于早期胰腺细胞中，而且也参与中央神经系统的发生与成熟。生长激素抑制激素是内分泌胰岛δ细胞的标志基因，同时在神经细胞中也有表达，因此人脂肪干细胞具有分化为神经样细胞的潜能，根据胰腺与神经系统发育的相似性，说明人脂肪干细胞更能有效的分化为胰岛素分泌细胞。诱导后的胰岛样细胞团经免疫细胞化学检测，存在胰岛素阳性细胞。作者用ELISA法检测了不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量，结果表明诱导后的胰岛样细胞团不仅可以分泌胰岛素，而且其分泌量可以随葡萄糖浓度的变化而变化，具有结构与功能的完整性。

以上结果证明，人脂肪干细胞具有分化为功能性胰岛样细胞团的潜能，利用新型植物诱导剂Conophylline与尼克酰胺联合诱导可以显著提高分化效率，它可以作为一种理想的供体细胞来源，解决胰岛移植供体不足与免疫排斥问题，为糖尿病的细胞治疗开辟新的途径。

作者贡献：实验在通讯作者指导下，由第一作者设计、实施，第二、三作者、通讯作者进行评估，均经过系统培训，未使用盲法评估，第一作者成文，通讯作者审校。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：脂肪组织的使用经手术者同意，且得到医院伦理委员会批准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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