骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 980-984.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.006

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骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的建立

杨春露¹，赵勇²，陈建庭²

1武警辽宁省总队医院骨科，辽宁省沈阳市 110034
2 南方医科大学南方医院脊柱外科，广东省广州市 510515

收稿日期:2012-06-29 修回日期:2012-07-15 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 陈建庭，硕士，教授，博士生导师，南方医科大学南方医院脊柱外科，广东省广州市 501515 chenjt99@sina.com
作者简介:杨春露☆，男，1971年生，辽宁省鞍山市人，汉族，博士，副主任医师，主要从事脊柱外科与及干细胞、生物材料方面的研究。 ycl_2002@163.com

Construction of a co-culture system for human bone marrow stromal cells-osteoblasts in vitro

Yang Chun-lu¹, Zhao Yong², Chen Jian-ting²

1 Department of Orthopedics, Liaoning Provincial Armed Police Corps Hospital, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
2 Department of Spinal Surgery, Southern Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2012-06-29 Revised:2012-07-15 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Chen Jian-ting, Master, Professor, Doctoral supervisor, Department of Spinal Surgery, Southern Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China chenjt99@sina.com
About author:Yang Chun-lu☆, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Liaoning Provincial Armed Police Corps Hospital, Shenyang 110034, Liaoning Province, China ycl_2002@163.com.

摘要/Abstract

摘要：

背景：在骨修复和重建过程中，成骨细胞和骨髓基质细胞是主要功能细胞，二者存在着密切的功能联系。
目的：通过骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系的建立，观察共育体系中两种细胞之间的功能影响及生物学特点。
方法：原代分离人骨髓基质细胞和人成骨细胞，将2种细胞置于Transwell共育环境中共同培养，建立人骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系。分别采用MTT、丫啶橙染色、碱性磷酸酶活性检测等方法初步评价共育体系中两种细胞增殖、凋亡及功能改变情况。
结果与结论：在复合培养体系中，骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系能够促进成骨细胞的增殖与碱性磷酸酶的活性，同时抑制骨髓基质细胞的凋亡，促进骨髓基质细胞的趋化聚集。结果提示在复合培养体系中, 骨髓基质细胞能够加速成骨细胞的增殖及成骨活性，另外成骨细胞也可减少骨髓基质细胞的凋亡，并加强其成骨性分化的作用。两者之间具有较为紧密的影响和功能联系。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓基质细胞, 成骨细胞, 共育培养, 骨修复, 骨再生, 增殖, 凋亡, 骨组织工程, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stromal cells and osteoblasts play a major role during bone repair and reconstruction and the two are closely associated with each other functionally.
OBJECTIVE: To establish a co-culture system for bone marrow stromal cells-osteoblasts in vitro so as to investigate the features of both kinds of cells in one system.
METHODS: Human bone marrow stromal cells and osteoblasts were primary isolated and these two kinds of cells were co-cultured in a Transwell system to establish a co-culture system for human bone marrow stromal cells-osteoblasts. The proliferation, apoptosis and other features of human bone marrow stromal cells and osteoblasts were determined by MTT assay, acridine orange staining and alkaline phosphatase activities.
RESULTS AND CONCLUSION: The co-culture system for human bone marrow stromal cells and osteoblasts promoted the proliferation of osteoblasts, increased alkaline phosphatase expression, inhibited apoptosis of bone marrow stromal cells and promoted the aggregation of bone marrow stromal cells. These results indicate that in the co-culture system for human bone marrow stromal cells and osteoblasts, bone marrow stromal cells can increase the osteogenic ability of osteoblasts by accelerating their proliferation; in addition, osteoblasts can lower the apoptosis of bone marrow stromal cells and strengthen their osteogenic differentiation. These findings suggest a close functional association between human bone marrow stromal cells and osteoblasts.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow stromal cells, osteoblasts, co-culture, bone repair, bone regeneration, proliferation, apoptosis, bone tissue engineering, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

杨春露，赵勇，陈建庭. 骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的建立[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 980-984.

Yang Chun-lu, Zhao Yong, Chen Jian-ting. Construction of a co-culture system for human bone marrow stromal cells-osteoblasts in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 980-984.

图/表（结果） 3

2.1 共育体系对成骨细胞增殖的作用 共育体系能够使成骨的增殖加快，培养7 d后，共育体系中的成骨细胞增殖MTT A值(0.734±0.054)明显高于单独培养组MTT A值(0.419±0.012)，差异有显著性意义(P=0.000)。表明在共育体系中，其生长环境能够加速成骨细胞增殖。见表1。

2.2 共育体系对成骨细胞碱性磷酸酶活性的作用 在同等培养条件下，共育体系中的成骨细胞碱性磷酸酶活性(13.97±1.45)与单独培养组(12.74±0.92)比较，明显增高(F=106.153，P=0.016)。由此推断，共育体系能够提高成骨细胞碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞的分化成熟。

2.3 共育体系对人骨髓基质细胞趋化聚集的影响 细胞接种5 d，共育组中的骨髓基质细胞开始呈现集落样的聚集生长，单独培养的对照组细胞则正常生长。随着培养时间延长，共育培养组的细胞聚集来越明显。到18 d，共育培养组随着细胞数量增加，细胞聚集成数个较大的片状集落，而对照组细胞则无此现象，见图2。

以上表明共育培养组中的成骨细胞可能分泌某些因子，也可能由于成骨细胞分泌的生长因子作用于骨髓基质细胞，通过细胞自分泌作用，产生某些集落刺激因子，最终使骨髓基质细胞出现聚集性生长现象，人骨髓基质细胞的聚集性生长可能有助于细胞之间的信息传递，加速其向成骨细胞分化及矿化过程，这对于骨髓基质细胞的成骨性分化具有一定的积极意义。

2.4 共育体系对骨髓基质细胞凋亡的影响 骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系中，骨髓基质细胞凋亡数量(4.02±0.82)个与单独培养条件下(5.00±0.61) 个比较，明显减少，差异具有显著性意义(t =3.036，P=0.007)。充分表明共育体系能够有效维持骨髓基质细胞生存，抑制骨髓基质细胞的凋亡。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。
时间及地点：2006年10月至2009年12月在南方医科大学南方医院实验室完成。
材料：6个月意外流产胎儿取材来源于南方医院产科门诊，经患者同意授权并补偿部分费用，符合医学伦理标准。上下式细胞共育培养板(美国Corning公司，0.45 μm半透膜）；荧光染色相关试剂：吖啶橙(AO，美国Sigma公司)；DMEM细胞培养液为美国hyclone公司产品；本实验所用细胞由南方医院外科实验室提供。
主要仪器和设备：CO2细胞培养箱Nu3500E购于奥地利；高速低温离心机购于日本Hitachi公司；GL-16低速离心机购于珠海Hema公司；细胞培养板和培养瓶购于美国Corning 公司；OLYMPUS BXDX光学显微镜、OLYMPUS光学显微照相系统购于日本OLYMPUS公司；倒置相差显微镜购于日本Canon公司；NIKON E600荧光显微镜购于NIKON公司。
实验方法：
人骨髓基质细胞的分离培养：骨髓基质细胞取材来自于6个月意外流产胎儿。注射器内预置肝素液0.2 mL (3 000 U/mL)，无菌抽取骨髓约3 mL。将冲洗液以 1 000 r/min离心8 min，共2遍。获得沉淀加入DMEM低糖培养基进行培养，调整使有核细胞数为5×10⁷L^-1，接种至50 mL细胞培养瓶内，室温条件下常规培养。48 h后全量换液并持续培养，每3 d进行换液1次。原代细胞生长增殖80%-90%后，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA进行消化传代，取第3代细胞用于实验研究。
成骨细胞的分离与培养：取6月龄意外引产胎儿的颅骨，改良胰酶-胶原酶消化法分离培养胎儿颅骨成骨细胞[5]。对于培养细胞进行形态学、Ⅰ型胶原免疫组织化学及碱性磷酸酶活性等检测鉴定，取传代至第3代的细胞进行实验。利用苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行成骨细胞表型鉴定确认。
建立骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系：采用Transwell上下复合式培养体系。第3代骨髓基质细胞与第3代成骨细胞分别制备细胞悬液，接种。见图1。

实验分组：分2组进行观察，骨髓基质细胞培养组：单纯骨髓基质细胞培养；细胞共育组：成骨细胞和人骨髓基质细胞共同培育，接种6孔板，每组6个孔。
共育体系对成骨细胞增殖的影响：上述两种细胞分别用无血清培养基制成细胞悬液，接种数量为5×10⁴/孔。无血清培养基培养24 h后去掉无血清培养基，加入体积分数2%的FBS，7 d后采用MTT方法检测各组成骨细胞增殖情况。
共育体系对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响：同样培养体系，利用含体积分数5%FBS的DMEM培养基制备细胞悬液。接种至12孔板，接种细胞数量为5×10⁴/孔，培养24 h后弃原培养基，加入体积分数5%FBS的DMEM。培养7 d，0.25%胰酶消化，离心后收集细胞去上清，每个样品加0.5%Triton x-100裂解液0.5 mL，4 ℃振动裂解12 h，再次离心后取上清液测定碱性磷酸酶活性。520 nm波长比色，测吸光度值，依据测定管与标准管A吸光度值的比值换算出碱性磷酸酶的活性(金氏单位)。
共育培养体系对骨髓基质细胞凋亡的影响：同样方法将两种细胞用培养基制成细胞悬液，细胞接种数量为8×10⁴/孔，7 d后丫啶橙(AO)染色检测各组骨髓基质细胞凋亡情况。用PBS制成1×10¹⁰ L^-1活细胞悬液，分别取95 μL细胞悬液加5 μL的丫啶橙(AO)染色，490 nm绿色激发荧光下观察细胞凋亡状态。活细胞细胞核被染成绿色，坏死细胞的细胞核则染成红色。随机计数10个高倍视野中的凋亡细胞数量，取其平均值，作为一个标本的凋亡细胞数进行对比研究。
共育培养体系对骨髓基质细胞趋化聚集的影响：同样方法制备两种细胞单细胞悬液，细胞共育培养组分别在培养板上下层加入骨髓基质细胞和成骨细胞；骨髓基质细胞组只加入一种细胞。光镜观察骨髓基质细胞生长状态。
主要观察指标：①成骨细胞增殖。②碱性磷酸酶活性。③骨髓基质细胞凋亡。④骨髓基质细胞趋化聚集等项目。
统计学分析：采用SPSS 13.0软件处理相关实验数据，α=0.05，双侧检验。

讨论

3.1 骨髓基质细胞-成骨细胞共育培养模型更能体现体内两种细胞之间的功能联系 现有研究提示，骨髓基质细胞作为成骨细胞的主要前体细胞，与成骨细胞的功能活动有密切联系，两种细胞之间的相互调节及联系是骨组织代谢的关键调节因素之一。作为两种重要的种子细胞，成骨细胞与骨髓基质细胞在骨组织工程研究中较为受到关注^[6-7]。以往的研究多数采用单一的培养体系，分别观察成骨细胞或是骨髓基质细胞的生物学特性，两者的功能状态有机结合在一起并没有深入研究，因此获得的实验结论一些体内实际情况差别较多。目前，成骨细胞的培养技术已经十分成熟，但破骨细胞的培养还存在一定难度，随着细胞复合培养系统的出现及应用，开展体外模拟研究两种甚至更多种细胞之间功能的规律已成为可能，成骨细胞-破骨细胞共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究，此复合培养体系已取得了较好的成果并获得了较多的肯定^[8]。

目前细胞共育系统有多种，但主要都是通过半透膜实现细胞间的信息传递^[9]。实验研究的成骨细胞和骨髓基质细胞的直径都在30 μm以上，而细胞之间以0.45 μm的半透膜相隔，可使细胞分离不造成混合，而细胞培养液能够得到充分交流。因此实验采取了上下两层的培养模式，两层接触面积大，同时通过边缘的孔隙观察下层细胞的生长情况，但由于上层细胞收集有些困难，所以选择一种细胞为主要研究对象进行观察。

3.2 共育体系中两种细胞的相互作用 共育培养体系能够促进成骨细胞增殖及碱性磷酸酶表达；降低骨髓基质细胞凋亡并促使骨髓基质细胞集落样生长和聚集。共育体系能够提高骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2^[10-13]、转化生长因子β1、 Cbfα-1三种基因的表达水平。以上结论提示，骨髓基质细胞能够加速成骨细胞的增殖及成骨活性，另外成骨细胞也可减少骨髓基质细胞的凋亡，并加强其成骨性分化的作用。两者之间具有较为紧密的影响和功能联系。众所周知，体内成骨细胞主要来自于骨髓基质细胞^[14-16]，从成骨分化过程来看，两种存在着密切的相互作用及功能联系，而本实验证实了此种功能联系，作用机制可能是两种细胞之间通过远距离通讯产生相互影响。骨髓基质细胞产生的生长因子，如骨形态发生蛋白、集落刺激因子等，能够加速成骨细胞的生长分化、集落化及最终骨化；而成骨细胞分泌的生长因子，如表皮生长因子、转化生长因子β等能够激活并促进骨髓基质细胞的成骨性分化的作用^[17-20]。同时，加速骨髓基质细胞成骨分化，同时骨髓基质细胞分泌的集落刺激因子等则可加速成骨细胞的骨化过程。成骨过程结束后，上述相应的生长因子也会减少分泌，由此可推出结论，两种细胞之间的相互影响能对骨代谢过程进行精确的调控，维持两种细胞之间的动态平衡^[21]。实验成功建立成骨细胞-骨髓基质细胞复合培养体系，两种细胞之间在骨代谢过程中具有一定的互相影响和促进的功能联系，为骨修复与再生研究提供了一个新的组织工程细胞模型。

致谢：感谢南方医科大学南方医院外科实验室提供的帮助。
基金资助：国家自然科学基金(30271231)，课题名称：珍珠层人工骨成骨机理实验研究。
作者贡献：第一、二作者进行实验设计、实施及相关测试，第三作者为实验指导与评估。第一作者成文，第三作者审校，第一、三作者对本文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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