2.1 骨髓间充质干细胞的培养结果 由于造血干细胞不贴壁生长, 经过数次换液, 悬浮的造血干细胞逐渐被清除。贴壁细胞经3次传代后，第3代细胞形态均一、成纤维细胞样生长。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 第3代细胞成脂、成骨诱导2周后，油红O染色、Von Kossa’s染色均呈阳性反应，具有成骨成脂肪等多向分化潜能(成骨分化、成脂肪分化)，见图1。流式细胞术分析培养的细胞免疫表型，结果表明细胞骨髓间充质干细胞低表达CD34、CD45；高表达CD90、CD29，符合公认的骨髓间充质干细胞免疫表型，见图2；RT-PCR显示骨髓间充质干细胞表达基质细胞衍生因子1，见图3。

2.3 骨髓间充质干细胞Western blotting结果 骨髓间充质干细胞条件培养基增加了H9C2细胞缺氧复氧时磷酸化Akt蛋白的水平，见图4。

2.4 H9C2细胞凋亡结果 AnnexinV/PI双标法流式细胞术分析结果显示：间充质干细胞条件培养基降低了H9C2细胞缺氧复氧时的细胞凋亡，CXCR4阻断剂AMD3100能够有效地阻断间充质干细胞条件培养基所介导的H9C2细胞抗凋亡效应，PI3K/Akt阻断剂LY294002能够有效地阻断间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞的保护效应，见图5。

设计：细胞水平实验。
时间及地点：于2009年1月至2011年12月在湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所完成。
材料：
实验动物：健康SD大鼠3只，雄性，体质量(40±5) g，SPF级，由湖北医药学院验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(鄂)-2010-0008；实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)-2009- 0021。动物在屏障系统环境下，用专用的饲料(购自湖北省实验动物中心)和灭菌水分笼饲养。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
骨髓间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1保护心肌细胞实验的主要试剂、仪器：
Main experimental reagents and equipment:

实验方法：
骨髓间充质干细胞的培养：采用全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞[6]，给予大鼠腹腔注射肝素5 000 U，15 min后断颈处死，收集双侧胫股骨中全骨髓。按1× 10⁹ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶，24 h后换液，去除未贴壁的细胞。以后三四天完全换液1次，12-14 d后细胞密度达80%-90%，用2.5 g/L 的胰酶消化后1∶3传代，记为P1代细胞(P1MSC)。随后按上述方法传代培养。
骨髓间充质干细胞的鉴定：
成骨诱导：取第3代细胞培养至90%融合后6孔板加入成骨诱导液(体积分数15% FBS-DMEM，含地塞米松4×10^-6 g/L、β-磷酸甘油1 g/L、维生素C 0.5 g/L)，每 72 h换液，诱导2周。Von Kossa’s染色鉴定矿化结节。
成脂肪诱导：取第3代细胞培养至90%融合后6孔加入成脂肪诱导液(10 mg/L胰岛素)，每72 h换液。诱导2周，苏丹Ⅲ染色鉴定脂肪细胞。
流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表面标记特征：用1 mL注射器将10⁷ L^-1骨髓间充质干细胞吹打混匀后，取 600 μL，至少含有2×10⁶细胞等分为4份，分别加入4个Eppendorf管中，a管为标准对照，加入8 μL山羊IgG1-FITC；b管加入4 μL CD34 mAB(一抗)；c管加入4 μL CD45 mAB(一抗)；d管加入4 μL CD90 mAB(一抗)；e管加入4 μL CD29 mAB(一抗)，4 ℃下避光孵育60 min，洗涤液离心1 000 r/min，5 min，离心半径 12.5 cm，用PBS洗一两次。在b、c、d、e管中加入8 μL山羊IgG1-FITC(荧光二抗)，4 ℃下避光孵育30 min。洗涤液洗2次。加入固定液1 mL，细胞仪(Beckman Coulter)检测表面标志，应用Cotfit软件分析结果^[7]。
骨髓间充质干细胞条件培养基的收集：取第3代骨髓间充质干细胞培养，待其融合生长达到80%时，更换新的含体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基，培养48 h后，收集细胞培养基，离心，祛除细胞碎片，即为间充质干细胞条件培养基。收集后以备后续试验用。
建立缺氧复氧损伤模型：将H9c2细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，待细胞融合生长达到70%时，更换培养基，PBS洗3遍，加入含体积分数2%胎牛血清的低糖DMEM培养基，随后将其放置于缺氧复氧的培养箱中，缺氧21 h后，将其取出，分别再将培养基更换为含体积分数15%胎牛血清的DMEM液。然后再将各组细胞置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中复氧6 h^[3]。在建立上述细胞缺氧复氧损伤模型的基础上，再将按上述方法培养的H9c2细胞，更换加入含体积分数2%胎牛血清的低糖DMEM培养基10 μmol/L为对照组；加入10 μmol/L骨髓间充质干细胞条件培养基，即为间充质干细胞组；为观察间充质干细胞条件培养基是否通过经基质细胞衍生因子1/CXCR4轴发挥作用，先行CXCR4阻断剂AMD3100(5 g/L)处理1 h，后再加骨髓间充质干细胞条件培养基，即为AMD3100处理组；为观察间充质干细胞条件培养基保护心肌细胞与PI3-K/Akt途径的关系，先行PI3-K/Akt阻断剂LY294002(10 μmol/L) 处理1 h，后再加入骨髓间充质干细胞条件培养基，即为PI3-K/Akt阻断组。后续实验的处理与上述类似。
Annexin V/PI双染法流式细胞术分析细胞凋亡：缺氧复氧处理后，收集细胞，各组用4 ℃预冷的PBS洗2次，每组取细胞总数约为1×10⁹ L^-1上机检测，按Annexin V/PI双染法说明书进行流式细胞术分析细胞凋亡。
Western blot检测凋亡蛋白磷酸化Akt蛋白的表达：H9C2细胞缺氧复氧处理后，收集各组细胞，分别加入400 μL RIPA，用枪头反复吹打均匀，室温放置10 min，离心半径12.5 cm，15 000 r/min离心5 min，收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。制作蛋白浓度曲线，调整各组蛋白浓度为同一水平行SDS-PAGE电泳，经SDS-PAGE分离后把凝胶电转印至硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂牛奶封闭2 h，1∶1 000稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗3次，每次8 min，按1∶5 000稀释的二抗，室温振摇2 h。TBS-T漂洗3次后加1 mL ECL化学发光剂，使用BIO-RAD-ChemiDOC显影。用ImageJ软件进行灰度分析。抗小鼠α-tubulin(sigma，1∶10 000)作为内参^[8]。
RT-PCR分析基质细胞衍生因子1的表达：按试剂盒说明书方法抽提RNA，反转录制备cDNA，随后按RT-PCR试剂盒方法扩增检测基质细胞衍生因子1。引物如下：基质细胞衍生因子1(225 bp)正义链：5’TTG CCA GCA CAA AGA CAC TCC 3’；反义链：5’-GAC ATA AGC CAA ACG AAA CCT C-3’；GAPDH (623 bp)正义链：5’CCA AAA GGG TCA TCA TCT CC’3，反义链：5’GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC’3。扩增体系为20 μL，参数为：95 ℃，4 min，30循环，变性温度：94 ℃，45 s，退火温度：58 ℃，40 s，延长温度：72 ℃，40 s^[9-10]。
主要观察指标：主要通过检测调亡指标(AnnexinV/PI)观察间充质干细胞条件培养基对心肌细胞的保护作用及可能分子机制。
统计学分析：所有指标以x(_)±s表示，组间计量资料采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

1  已有的研究表明基质细胞衍生因子1不仅可以通过促进干细胞迁移到心肌梗死部位再生心肌和血管而修复心脏，也有大量实验报道基质细胞衍生因子1的动员迁移的CXCR4阳性细胞参与了心肌和血管的再生。实验初步验证了间充质干细胞表达基质细胞衍生因子1并重点观察了其对心肌细胞的幸存能力的影响，体外实验发现基质细胞衍生因子1明显减少了心肌细胞的凋亡。

2  实验结果发现间充质干细胞表达的基质细胞衍生因子1激活了心肌细胞pAkt，心肌细胞凋亡数目明显减少，体外实验进一步发现CXCR4阻断剂AMD3100阻断了间充质干细胞条件培养基的抗心肌细胞凋亡作用；同时PI3-K特异性阻断剂LY294002也阻断了间充质干细胞条件培养基所介导的抗心肌细胞凋亡作用。因此，间充质干细胞条件培养基通过分泌的基质细胞衍生因子1作用于CXCR4激活PI3-K/Akt信号途径发挥对心肌细胞的保护作用。

已发表杂志：Cell Transplantation, 2007，16（8）：879-886.

主要观察指标：心肌梗死后移植过表达SDF-1的MSC两周和五周后,观察心肌细胞及干细胞极性特征,connexin 43和connexin的表达以及心脏内源性干细胞特征

结论：BMSC过表达SDF-1能够心肌梗死部位获得心脏内源干细胞的补充,并且这些能够去极化表现出增强的收缩能力。


已发表杂志：中华器官移植杂志，2009，6：362-365。

主要观察指标：将BMSC分别与10和100μg／L的SDF-1作用24h后，在无氧、无血清条件下培养6h，流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡率；利用大鼠急性心肌梗死模型，将经100μg／LSDF-1预处理的BMSC和未经处理的BMSC植入大鼠梗死心肌周边，2周后采用超声心动图观察心脏功能的变化。

结论：用SDF-1预处理大鼠BMSC能抑制其在无氧和无血清条件下的凋亡。用SDF-1预处理BMSC能增强其移植后治疗大鼠急性心肌梗死的效果。


已发表杂志：The FASEB Journal,2007,21(12):3197-3207.

主要观察指标：心肌梗死后移植过表达SDF-1的MSC后24小时和48小时,观察梗死区域及周边区域的心肌细胞的幸存数目,以及处理后5周心功能变化.

结论：心功能获得改善; 梗死区域及周边区域的心肌细胞的幸存率明显增加;表明移植的过表达SDF-1的MSC 通过营养效应保护心肌.但是具体分子机制不明.


已发表杂志：Cardiovascular research, 2011;91(3):402-11.

主要观察指标：心肌梗死后移植过表达VEGF的MSC后7 天,观察梗死区域及周边区域的心脏干细胞的特征以及SDF-1 表达特征;并检测处理后4周心功能变.

结论：心功能获得改善; 梗死区域及周边区域的心脏干细胞的数目明显增加;SDF-1的水平明显增加，其中一部分来自于心肌细胞。这些作用能被 SDF-1α-RNAi及其受体阻断剂 AMD3100所取消。表明MSC分泌的VEGF及SDF-1 通过交互作用调节心脏干细胞而修复心肌梗死。


拟发表杂志：《中国组织工程研究》。

主要观察指标：RT-PCR检测MSC表达，Western blot检测心肌细胞在MSC条件培养基及AMD310或LY294002处理后Akt蛋白的表达;细胞凋亡利用AnnexinV/PI双标法流式细胞术分析。

结论：间充质干细胞表达基质细胞衍生因子-1。间充质干细胞条件培养基明显降低了H9C2细胞缺氧复氧的凋亡，且这种抗凋亡作用能被CXCR4阻断剂AMD3100或PI3-K/Akt途径阻断剂LY294002所阻断。表明间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子-1通过激活PI3-K/Akt途径保护H9C2细胞，增加H9C2细胞的幸存能力。