利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 957-962.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.002

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利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验

康凯¹，曲辉²，汤继权³，贾智博¹，张宇南¹，张春风¹，吴华¹，李仁科¹，蒋树林¹

1哈尔滨医科大学附属二院心血管外科，“心肌缺血机理与诊疗技术”省部共建教育部重点实验室，黑龙江省哈尔滨市 150086
2哈尔滨医科大学附属二院儿内科，黑龙江省哈尔滨市 150086
3鸡西市人民医院胸心外科，黑龙江省鸡西市 158100

收稿日期:2012-04-09 修回日期:2012-06-19 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 曲辉，博士，主治医师，哈尔滨医科大学附属二院儿内科，黑龙江省哈尔滨市 150086 fdquhui@163.com
作者简介:康凯☆，男，1975年生，黑龙江省大庆市人，汉族，2012年哈尔滨医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事组织工程心脏瓣膜及心肌补片的研究。 kangkai1975@sina.com

Reconstruction of tissue-engineered heart valve with human bone marrow stromal stem cells in vitro

Kang Kai¹, Qu Hui², Tang Ji-quan³, Jia Zhi-bo¹, Zhang Yu-nan¹, Zhang Chun-feng¹, Wu Hua¹, Li Ren-ke¹, Jiang Shu-lin¹

1 Department of Cardiovascular Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of “Myocardial Ischemia Mechanism and Treatment” of Ministry of Education, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
2 Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
3 Department of Cardio-thoracic Surgery, Jixi People’s Hospital, Jixi 158100, Heilongjiang Province, China

Received:2012-04-09 Revised:2012-06-19 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Qu Hui, Doctor, Attending physician, Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China fdquhui@163.com
About author:Kang Kai☆, Doctor, Attending physician, Department of Cardiovascular Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of “Myocardial Ischemia Mechanism and Treatment” of Ministry of Education, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China kangkai1975@sina.com

摘要/Abstract

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓来源干细胞, 脱细胞猪主动脉瓣支架, 脱细胞, 主动脉瓣, 猪, 支架, 骨髓基质干细胞, 人, 心脏瓣膜, 组织工程, 再生医学, 省级基金\干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, mechanical or biological valve recipients used in the clinic are still at the risk of infection, hemorrhage, thrombosis and reoperation owing to valve stenosis. Tissue-engineered heart valve with biological activity can overcome the disadvantages above. While, the optimal choice of scaffolds and seeding cells remains disputable.
OBJECTIVE: To explore the feasibility to construct tissue-engineered heart valve with acellularized porcine aortic valve scaffold and human bone marrow stromal stem cells in vitro.
METHODS: The porcine aortic valves were decellularized with the detergent and enzymatic extraction process to remove the cellular components. Human bone marrow stromal stem cells were aspirated from sternum of the patients with simple congenital heart malformation, and then the cells were seeded on the acellularized porcine aortic valve scaffold and cultured for 5 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry identified that the characteristics of surface antigen of the inoculated seed cells were in line with those of human bone marrow stromal stem cells. Light microscopy and electron microscopy confirmed that the cellular components in the porcine aortic valves could be removed to obtain the complete acellular fiber mesh stent. There was no significant difference in biomechanical property between before and after acellularization. The human bone marrow stromal stem cells implanted on the acellularized porcine aortic valve scaffold could form a continuous cell layer on the surfaces of the scaffold. The inoculated bone marrow stromal stem cells could be differentiated into fibroblasts. The implantation of human bone marrow stromal stem cells on the acellularized porcine aortic valve scaffold can construct the tissue-engineered heart valve.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, acellularized porcine aortic valve scaffold, acellular, aortic valve, porcine, scaffold, bone marrow stromal stem cells, human, heart valve, tissue engineering, regenerative medicine, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R349.2

康凯，曲辉，汤继权，贾智博，张宇南，张春风，吴华，李仁科，蒋树林. 利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 957-962.

Kang Kai1, Qu Hui2, Tang Ji-quan, Jia Zhi-bo, Zhang Yu-nan, Zhang Chun-feng, Wu Hua, Li Ren-ke, Jiang Shu-lin. Reconstruction of tissue-engineered heart valve with human bone marrow stromal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 957-962.

图/表（结果） 4

2.1 新鲜瓣叶与去细胞支架的形态学观察 常规苏木精-伊红染色，光镜下可见新鲜瓣膜细胞成分呈三维存在，广泛分布于瓣膜表面及中间，见图1A；而脱细胞支架细胞成分已基本消失，胶原结构完整，呈波浪状存在，见图1B。透射电镜观察可见原瓣膜细胞脱除后残存的空隙及构成瓣膜支架的胶原纤维的横纵切面，见图1C。

2.2 新鲜瓣叶与去细胞支架的机械力学测定 生物力学检测证明，脱细胞猪主动脉瓣支架与新鲜瓣叶在断裂强度[(626.7±74.2) g/mm2比(649.4±92.6) g/mm2]、断裂伸长率[(64±10.8)%比(55.5±9.3)%]上差异无显著性意义，见图2。

2.3 种子细胞的鉴定 荧光倒置显微镜下观察见贴壁的第3代细胞呈典型的长梭形，大小一致，胞浆内含特征性的颗粒结构，胞核较大。细胞间融合成片，沿胞体长轴呈螺旋状或旋涡状排列，可见散在的集落形成，见图3A。

透射电镜显示胞核类圆形或不规则形，核/浆比例大，核仁明显，核膜清晰，染色质较疏松，排列于核膜周围，胞浆内细胞器不发达，表现出未分化原始细胞的特征，见图3B，C。

流式细胞分选显示贴壁的第3代细胞均一表达CD29，CD90，CD105均达90%以上，而淋巴细胞干细胞的标志性抗原CD45和造血干细胞系表面抗原CD34，CD133仅微量表达(< 1%)，见图3D。

上述贴壁细胞形态特征及表面抗原均证明分离出的第3代细胞为人骨髓基质干细胞。

2.4 细胞种植后瓣膜情况 瓣膜行常规石蜡包埋后行苏木精-伊红染色，可见瓣膜表面有一层细胞贴附生长，连续性好，但未向瓣叶基质内部长入，见图4A。

免疫荧光检查，SMA(+)，见图4B，vWFⅧ(-)(结果未显示)。扫描电镜下可见瓣叶表面细胞被覆均匀，但细胞排列杂乱，无一定方向性，见图4C。透射电镜可见再植细胞间的紧密连接，见图4D。

参考文献

[1] Dainese L, Guarino A, Burba I,et al. Heart valve engineering: decellularized aortic homograft seeded with human cardiac stromal cells. J Heart Valve Dis. 2012;21(1):125-134.

[2] Jordan JE, Williams JK, Lee SJ, et al. Bioengineered self-seeding heart valves. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012; 143(1):201-208.

[3] Weber B, Scherman J, Emmert MY,et al. Injectable living marrow stromal cell-based autologous tissue engineered heart valves: first experiences with a one-step intervention in primates. Eur Heart J. 2011;32(22):2830-2840.

[4] Kang K,Tan Z,Jiang SL,et al. Zhongguo Xiong Xin Xueguan Waike Zazhi. 2005;12(5): 339-342. 康凯,谭震,蒋树林,等.去细胞猪主动脉瓣支架及兔骨髓干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究[J].中国胸心血管外科临床杂志,2005,12(5): 339-342.

[5] Zhao GR, Zhang HM, Ye TX,et al. Characterization of the radical scavenging and antioxidant activities of danshensu and salvianolic acid B. Food Chem Toxicol. 2008;46(1):73-81.

[6] Ma JB,Zhong H,Han SX,et al. Zhonghua Xiong Xin Xueguan Waike Zazhi. 2009 ;25(4): 257-259. 马金本,钟竑,韩绍先,等.叠氮钠对脱细胞组织工程心脏瓣膜形态学及生物力学的影响[J].中华胸心血管外科杂志,2009 ,25(4): 257-259.

[7] Xie JQ,Wei XF,Yi DH. Zhonghua Xiong Xin Xueguan Waike Zazhi. 2009;25(5): 289-291. 谢甲琦,魏旭峰,易定华.心脏瓣膜的结构——构建组织工程心脏瓣膜的蓝图[J].中华胸心血管外科杂志,2009,25(5): 289-291.

[8] Cebotari S, Lichtenberg A, Tudorache I,et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 2006;114(1 Suppl): I132-137.

[9] Weber B, Emmert MY, Behr L,et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 2012;33(16):4031-4043.

[10] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.Science. 1997;276(5309):71-74.

[11] Xiao YF, Min JY, Morgan JP. Immunosuppression and xenotransplantation of cells for cardiac repair. Ann Thorac Surg. 2004;77(2):737-744.

[12] Roy A, Brand NJ, Yacoub MH. Molecular characterization of interstitial cells isolated from human heart valves. J Heart Valve Dis. 2000;9(3):459-465.

[13] Oswald J, Boxberger S, Jørgensen B,et al. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 2004;22(3):377-384.

[14] Beitnes JO, Lunde K, Brinchmann JE,et al. Stem cells for cardiac repair in acute myocardial infarction.Expert Rev Cardiovasc Ther. 2011;9(8):1015-1025.

[15] Halimu•Kelimu,Wang L,Qi H. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(34):6432-6435. 哈里木•克里木,王磊,齐海.组织工程心脏瓣膜支架材料的选择与应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(34): 6432-6435.

[16] Zhou JL,Zou MH,Hu XJ,et al. Zhongguo Linchuang Yishi Zazhi. 2011;5(10):2890-2895. 周建良,邹明晖,胡行健,等.血管内皮细胞生长因子修饰的聚乙二醇化去细胞瓣构建心脏瓣膜复合支架[J].中华临床医师杂志:电子版, 2011,5(10): 2890-2895.

[17] Flanagan TC, Cornelissen C, Koch S,et al. The in vitro development of autologous fibrin-based tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning. Biomaterials. 2007;28(23):3388-3397.

[18] Wang P,Li C,Tan L,et al. Shandong Yiyao. 2009;49(26): 34-35. 王鹏,李超,谈磊,等.三种去细胞组织工程异种瓣膜支架制备方法比较[J].山东医药,2009,49(26):34-35.

[19] Engelmayr GC Jr, Sales VL, Mayer JE Jr,et al. Cyclic flexure and laminar flow synergistically accelerate mesenchymal stem cell-mediated engineered tissue formation: Implications for engineered heart valve tissues. Biomaterials. 2006;27(36): 6083-6095.

[20] Syedain ZH, Weinberg JS, Tranquillo RT. Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(18):6537-6742.

引言

材料方法

设计：组织工程心脏瓣膜的体外构建及组织学和生物力学的性能测定。
时间及地点：于2010年10月至2011年10月在哈尔滨医科大学附属第二医院“心肌缺血机理与诊疗技术”省部共建教育部重点实验室完成。
材料：种子细胞取自签署知情同意书的非紫绀性先心病患儿(3-8岁)的胸骨骨髓；瓣膜支架取自在哈尔滨肉联厂屠宰，热缺血1 h以内的猪主动脉瓣。
主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
猪主动脉瓣脱细胞支架的制备：详见参考文献[4]。取热缺血1 h以内的猪主动脉瓣，生理盐水冲净后，置入4 ℃ Hank’s液带回实验室。仔细修剪切取瓣叶共45片。20片新鲜瓣叶保存于4 ℃ PBS内做对照组，余25片放入1%Triton-X100(pH 8.0)中，4 ℃振荡24 h，间隔8 h换液1次，随后转入1%Triton-X100+1.5 mol/L KCl(pH 8.0)中，4 ℃振荡24 h，间隔8 h换液1次；后移入0.01 mol/L Tris-cl(pH 7.4)中，4 ℃振荡，每15 min更换新鲜清洗液1次，第4次更换清洗液时振荡30 min；后移入含Dnase Ⅰ(10 mg/L)和Rnase A(1 mg/L)的工作液中，37 ℃振荡3 h，按上述方法清洗，再用含酶工作液处理1次，清洗后移入新鲜储存液中(pH 7.4)，12 000 Gy的γ射线照射，彻底消毒后，4 ℃条件下保存备用。
生物力学测定：将新鲜和脱细胞主动脉瓣修成1.0 cm× 0.5 cm的条索状，每组10片，在生物力学测定仪上行单轴横向拉伸，机械参数测定由一22 N的测压传感器完成。牵拉速度及标测距离分别设为1.0 mm/min及7 mm。牵拉至瓣叶完全破裂为止，测定断裂强度及断裂拉伸率。
人骨髓基质干细胞的采集、分离与培养：取非紫绀性先心病患儿(3-8岁)的胸骨，经梯度密度离心法分离出单个核细胞层置于含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中，于温箱内培养(37 ℃，体积分数为5%CO2)，2 d后换培养液，待细胞融合至80%左右，0.25%胰酶消化传代，取第3代细胞作种子细胞。
种子细胞的鉴定：光学显微镜及透射电镜下观察第3代细胞的大体及超微结构形态特征。消化第3代细胞制作细胞悬液，分别行骨髓基质细胞特征性表面抗原CD29，CD90，CD105，淋巴干细胞的标志性抗原CD45和造血干细胞标志性抗原CD34，CD133染色，流式细胞分选技术确定各系细胞比例从而判定种子细胞种类。
种子细胞的种植与培养：将去细胞的猪主动脉瓣支架置于烧杯中，DMEM浸泡24 h，继以胎牛血清浸泡12 h，表面涂以纤连蛋白凝胶，取第3代生长良好的人骨髓基质细胞，胰酶消化后制成浓度为4×10⁹L^-1的细胞悬液，均匀接种于整个瓣膜上，置于体积分数为5% CO2，37 ℃的孵箱中培养2.5 h，然后移入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM中，培养24 h。如此反复接种3次，再培养 5 d，共8 d。将瓣膜固定，行苏木精-伊红染色及扫描、透射电子显微镜检查，同时做vWFⅧ和SMA免疫组化鉴定，观察细胞在瓣膜及瓣叶上的生长情况。统计学分析：采用Graphpad 5.0统计软件进行统计学处理，所有数值均以x_±s显示。两组各指标比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[3]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[4]	李大地, 朱梁, 郑力, 赵凤朝. 全膝关节置换疗效及患者满意度与人格特征的关联性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1346-1350.
[5]	陈俊名, 岳辰, 何沛霖, 张俊涛, 孙墨渊, 刘又文. 髋关节置换与股骨近端防旋髓内钉内固定修复高龄股骨转子间骨折效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1452-1457.
[6]	王永生, 吴旸, 李燕春. 急性大强度运动对成年人食欲激素影响的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1305-1312.
[7]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[8]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[9]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[10]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[11]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[12]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[13]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[14]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[15]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.