突变型Cdh1基因真核表达质粒的构建及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.023

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 315-319.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.023

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突变型Cdh1基因真核表达质粒的构建及鉴定

李立，石小云，张登文，张传汉，姚文龙

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2012-05-09 修回日期:2012-05-20 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 姚文龙，主治医师，华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北省武汉市 430030 wlyao82@126.com
作者简介:李立☆，女， 1981年生，湖北省武汉市人，汉族，华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系在读博士，主要从事神经发育与再生研究。lily81630@126.com
基金资助:
国家自然科学基金(81000476)。

Construction and identification of a mutated-Cdh1 eukaryotic expressing vector

Li Li, Shi Xiao-yun, Zhang Deng-wen, Zhang Chuan-han, Yao Wen-long

Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2012-05-09 Revised:2012-05-20 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Yao Wen-long, Attending physician, Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China wlyao82@126.com
About author:Li Li☆, Studying for doctorate, Department of pathophysiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China lily81630@126.com
Supported by:
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 81000476

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞周期末期促进复合物调节亚基Cdh1的活性受到磷酸化调节，磷酸化的Cdh1不能与细胞周期末期促进复合物结合，从而抑制细胞周期末期促进复合物的活性。
目的：构建突变型Cdh1基因真核表达质粒及鉴定。
方法：采用RT-PCR方法，从大鼠海马组织扩增出Cdh1基因编码序列。通过限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR回收产物和pBluescript质粒将Cdh1基因克隆到pBluescript质粒上。根据定点突变技术原理，以含Cdh1编码序列的pBluescript-Cdh1质粒为模版，针对Cdh1第40、151、163位丝氨酸(S)和第121位苏氨酸(T)设计4对突变引物，将4个氨基酸位点全部突变为丙氨酸(A)。最后通过测序鉴定。
结果与结论：经电泳鉴定PCR扩增产物大小约为1 500 bp，包括Cdh1基因完整的编码序列、编码序
列两端引入的酶切位点以及KOZAK序列，与预期相符。重组质粒pBluescript-Cdh1经EcoRⅠ和XbaⅠ
双酶切鉴定与预期结果符合。DNA测序比对发现Cdh1(BC162059.1)编码序列第930位碱基A在重组
质粒pBluescript-Cdh1上突变为G，但氨基酸无变化，为同义突变，其他DNA序列无突变。经测序鉴
定pBluescript-Cdh1-4A40、121、151、163突变质粒第40、121、151、163位氨基酸全部突变为丙氨酸。提
示实验成功构建磷酸化位点突变型Cdh1基因真核表达质粒。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 细胞周期末期促进复合物, Cdh1, 定点突变, 聚合酶联反应, 真核表达质粒, 神经系统, 发育, 神经损伤修复, 基因治疗, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The activity of anaphase promoting complex-Cdh1 is regulated by phosphorylation.
Phosphorylated Cdh1 cannot be combined with anaphase promoting complex, thereby inhibiting the activity
of the anaphase promoting complex.
OBJECTIVE: To construct and identify a mutated-Cdh1 eukaryotic expressing vector.
METHODS: The entire coding sequence of the Cdh1 gene was amplified from rat hippocampal mRNA by reverse transcription-PCR. Then the PCR product of Cdh1 was cloned into pBluescript plasmid by double digestion with restriction endonucleases EcoR1 and Xba1, and ligation. Based on site-directed mutagenesis, the pBluescript-Cdh1 plasmid containing Cdh1 coding sequence was used as a template. The 40, 151, 163 serine (S) and 121 threonine (T) in Cdh1 gene was mutated to alanine (A) by multiple PCR with four pairs of mutated primers. The mutated Cdh1 vector was identified by DNA sequencing.
RESULTS AND CONCLUSION: The PCR product was about 1 500 bp by electrophoresis, including the entire coding sequence of Cdh1, restriction sites at both ends of Cdh1 and KOZAK sequence. The recombinant pBluescript-Cdh1 plasmid was identified by digestion with restriction endonuclease EcoR1 and Xba1, which was consistent with the expected results. DNA sequencing showed that A at the 930th base of Cdh1 (BC162059.1) coding sequence was mutated to G in the recombinant plasmid of pBluescript-Cdh1. But the sequence of amino acids was not affected. The 40, 121, 151, 163 amino acids in pBluescript-Cdh1-4A40, 121, 151, 163 mutant plasmids were all mutated to alanine. The mutated Cdh1 gene expressing plasmid at phosphorylation site was successfully constructed, which provides a good foundation for further studies of Cdh1 gene function.

Key words: tissue construction, cytological experiments of tissue construction, anaphase promoting complex, Cdh1, site-directed mutagenesis, PCR, eukaryotic expression plasmid, nervous system, development, nerve repair, gene therapy, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

李立，石小云，张登文，张传汉，姚文龙. 突变型Cdh1基因真核表达质粒的构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 315-319.

Li Li, Shi Xiao-yun, Zhang Deng-wen, Zhang Chuan-han, Yao Wen-long. Construction and identification of a mutated-Cdh1 eukaryotic expressing vector[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 315-319.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：实验于2011年3至12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室地点完成。

材料：

实验动物：出生24 h内SD乳鼠，体质量5-10 g，雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

方法：

Cdh1基因的扩增：根据GenBank中Cdh1 mRNA序列(BC162059.1)设计引物，上游引物：5’-AAA TCT AGA GCC ACC ATG GAC CAG GAC TAT GAG CG-3’，下游引物：5’-AAA GAA TTC CTA TCG GAT CCG GGT AAA G-3’。上游引物包含XbaⅠ酶切位点和kozak序列，下游引物包含EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物工程有限公司合成。根据TRIzol试剂说明，从出生24 h SD乳鼠的海马组织中提取总RNA，并反转录成cDNA，以此cDNA为模板扩增Cdh1基因编码区序列。取cDNA 1 μL，加入5 μL 10×反应缓冲液，2.4 μL MgSO_{4 ，5 μL dNTP混合物(2 mmol/L)，1 μL KOD-plus聚合酶，上游引物、下游引物各1.5 μL，加ddH₂O至总体积50 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 15 s，63 ℃ 20 s，68 ℃ 90 s，30个循环；最后68 ℃延伸5 min。PCR预期产物大小为1 506 bp。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，切胶回收。}(25 mmol/L)

pBluescript-Cdh1质粒构建：限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR回收产物和pBluescript质粒，1%琼脂糖凝胶电泳酶切产物并割胶回收。在T₄ DNA连接酶作用下，将Cdh1回收片段和pBluescript载体片段连接。连接产物转化入DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落培养，提取重组质粒，酶切并测序鉴定。

pBluescript-Cdh1-4A⁴⁰^、¹²¹^、¹⁵¹^、¹⁶³突变质粒构建：根据氨基酸密码子特点，针对Cdh1第40、151、163位丝氨酸(S)和第121位苏氨酸(T)通过点突变将4个氨基酸位点全部突变为丙氨酸(A)，见表1。根据定点突变技术原理，设计4对突变引物，见表2。

首先以含Cdh1编码序列的pBluescript-Cdh1质粒为模版，利用S40A-F/R引物进行PCR扩增。PCR反应体系：5 μL 10×反应缓冲液，2.4 μL MgSO₄(25mmol/L)，5 μL dNTP混合物(2 mmol/L)，1 μL KOD-plus聚合酶，上游引物、下游引物各1.5 μL，模板20 ng，加ddH₂O至总体积50 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 15 s，68 ℃ 5 min 45 s，10个循环；最后68 ℃延伸 6 min。取PCR产物5 μL经1%琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，然后在PCR产物中加入1 μL DpnⅠ限制性内切酶，消化甲基化及半甲基化的模板DNA(37 ℃ 1 h)，转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落培养，提取重组质粒pBluescript-Cdh1-1A⁴⁰，测序鉴定Cdh1基因第40位丝氨酸(S)是否突变为丙氨酸(A)；再以pBluescript-Cdh1-1A⁴⁰质粒为模板，用引物T121A-F/R进行第2轮PCR扩增，DpnⅠ限制性内切酶处理PCR产物，转化，挑取单克隆菌落培养，提取重组质粒pBluescript-Cdh1-2A⁴⁰^、¹²¹进行测序鉴定；以此类推，分别用S151A-F/R和S163D-F/R引物进行第3轮和第4轮PCR，最终得到pBluescript-Cdh1-4A⁴⁰^、¹²¹^、¹⁵¹^、¹⁶³突变质粒，测序鉴定第40、121、151、163位氨基酸是否全部突变为丙氨酸(A)。

主要观察指标：Cdh1 PCR扩增产物大小，重组质粒pBluescript-Cdh1大小及测序结果，pBluescript- Cdh1-4A⁴⁰^{、121、151、163}突变质粒测序结果。

讨论

APC及其调节亚基Cdh1是细胞内泛素蛋白酶小体系统中一种泛素连接酶E3，在细胞周期调控中发挥着重要作用^[11]。1999年Gieffers等^[12]首次发现APC-Cdh1在哺乳动物终分化神经元中有大量表达，开启了Cdh1-APC在神经生物学领域的研究，近年来Cdh1在神经系统中的作用越来越受到关注^[13,14]。在前期研究中课题组通过构建Cdh1 RNAi载体下调APC-Cdh1的活性^[15]，为了进一步研究Cdh1的作用，实验构建Cdh1表达载体。

细胞周期中Cdh1-APC的活性调节是个严密调控的过程^[16]。Cdh1受细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)的调节。G₁期、有丝分裂晚期Cdh1处于低磷酸化水平，可激活APC。S期、G₂期、有丝分裂早期Cdh1处于高磷酸化水平，APC活性被抑制^[17]。磷酸酶Cdc14可使Cdh1去磷酸化，从而激活APC^[18]。Cdh1的磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸等位点，磷酸化的Cdh1出细胞核，不能与APC结合，从而APC的活性被抑制^[19]。因此，为了避免细胞周期蛋白依赖性激酶对Cdh1的磷酸化，实验构建磷酸化位点突变型的Cdh1真核表达载体。

定点突变技术是指通过PCR等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验中所采用的定点突变技术就是基于DpnⅠ的点突变方法^[20]。采用成功构建的pBluescript-Cdh1质粒为模板，通过PCR引物引入突变位点，在高保真DNA聚合酶作用下进行PCR反应得到含有预期突变位点的双链质粒。甲基化酶DpnⅠ能够识别甲基化位点并将其酶切。实验用的模板是从大肠杆菌里提出来的质粒，受到甲基化修饰，而PCR扩增的质粒不会被甲基化，因此DpnⅠ酶能够特异性地切割模板(质粒)而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。将Dpn Ⅰ处理过的产物转化后，质粒中有2个nick位点可以被大肠杆菌修复，从而得到含有预期的突变质粒。

实验首先采用RT-PCR方法从SD大鼠海马组织中扩增得到Cdh1基因序列，再通过定点突变技术将Cdh1的4个磷酸化位点(丝氨酸与苏氨酸)全部突变为丙氨酸，经测序鉴定成功构建磷酸化位点突变型的Cdh1真核表达载体，为后续进一步研究Cdh1功能奠定了实验基础。

突变型Cdh1基因真核表达质粒的构建及鉴定

Construction and identification of a mutated-Cdh1 eukaryotic expressing vector

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