人角质形成细胞Notch信号通路与转化生长因子β调控受体蛋白的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.020

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 296-300.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.020

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人角质形成细胞Notch信号通路与转化生长因子β调控受体蛋白的作用

薛斯亮¹，王晓珊²，李东川³，张珏^{4, 5}

1 四川大学华西医院皮肤科，四川省成都市 610041
2 四川省医学科学院四川省人民医院肿瘤科四川省成都市 610041
3 成都市363医院妇产科，四川省成都市 610041
4 遵义医药高等专科学校，贵州省遵义市 563000
5 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室，四川省成都市 610041

收稿日期:2012-04-13 修回日期:2012-05-21 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 张珏，硕士，讲师，遵义医药高等专科学校，贵州省遵义市563000；四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室，四川省成都市 610041 zhangjue25@163.com
作者简介:薛斯亮☆，男，1980年生，汉族，四川省成都市人，2010年四川大学华西临床医学院毕业，博士，主要从事皮肤抗衰老与皮肤肿瘤方面的研究。xuesiliang@163.com

Notch signal pathway effect on receptor protein regulation by transforming growth factor beta in primary human keratinocytes

Xue Si-liang¹, Wang Xiao-shan², Li Dong-chuan³, Zhang Jue^{4, 5}

1 Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
2 Department of Oncology, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China
3 Department of Obstetrics and Gynecology, the 363 Hospital of Chengdu City, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
4 Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
5 Division of Stem Cell and Tissue Engineering, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2012-04-13 Revised:2012-05-21 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Zhang Jue, Master, Lecturer, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Division of Stem Cell and Tissue Engineering, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China zhangjue25@163.com
About author:Xue Si-liang☆, Doctor, Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China xuesiliang@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：在皮肤中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控至关重要，而转化生长因子β似乎是其调控的上游因子，既然Notch信号和转化生长因子β信号通道如此相关，那么Notch是不是也参加了转化生长因子β信号对受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控呢？
目的：探讨Notch信号通道在人角质形成细胞中对转化生长因子β调控受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的作用的影响。
方法：在分别用Jagged-1激活和用Γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号通道后，加入转化生长因子β，同时设立对照组，用Real-time PCR测试人角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa mRNA表达量。
结果与结论：覆盖率为40%的角质形成细胞在加入了转化生长因子β后，受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa mRNA量在各时间点均高于对照组。在用Jagged-1激活Notch通道的角质形成细胞中，单独加入Jagged-1、转化生长因子β及两者都加入时均高于对照组(P < 0.05，P < 0.01)。在用γ-分泌酶抑制剂抑制Notch通道的角质形成细胞中，只加入转化生长因子β显著高于对照组(P < 0.01)，只加入γ-分泌酶抑制剂和两者均加入时与对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。说明加入转化生长因子β导致角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达增加，而分别对Notch信号进行激活和抑制后发现，受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa信号分别显著增加和显著被抑制。所以在转化生长因子β升高受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达过程中Notch信号通道是非常重要且不可或缺的。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 转化生长因子β, 受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa, 人角质形成细胞, Notch, NICD

Abstract:

BACKGROUND: Regulation of the receptor protein tyrosine phosphatase kappa (RPTP-κ) in the skin is essential, while transforming growth factor beta (TGF-β) appears to be an upstream factor of its regulation. As Notch signaling pathway is similar to TGF-β signaling pathway, whether Notch participates in the regulation of RPTP-κ transcription by TGF-β signaling?
OBJECTIVE: To find out the role of Notch signal in regulation of RPTP-κ transcription by TGF-β.
METHODS: Jagged-1 and gamma-secretase inhibitors (GSI) were use respectively to activate and inhibit Notch signal followed by addition of TGF-β. Simultaneously, control group was set. Real-time PCR was used to determine RPTP-k mRNA expression in human keratinocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: After adding TGF-β into 40% confluent keratinocytes, the RPTP-κ mRNA expression was higher at different time as compared with the control group. Following Jagged-1 activated Notch signaling pathway, the mRNA expression of RPTP-κ in the keratinocytes was higher when Jagged-1, TGF-β or their combination was added into the cells as compared with the control group (P < 0.05, P < 0.01). Following GSI inhibited Notch signaling pathway, the mRNA expression of RPTP-κ in the keratinocytes was higher only when TGF-β was added into the cells as compared with the control group (P < 0.01), and no significant difference was seen when GSI alone or combination of TGF-β and GSI was added into the cells as compared with the control group (P > 0.05). These findings indicate that the mRNA expression of RPTP-κ in the keratinocytes was increased after TGF-β was added, and following activation or inhibition of Notch signaling, the mRNA expression of RPTP-κ was significantly increased or suppressed. Therefore, Notch signaling is very important and indispensable in the regulation of RPTP-κ by TGF-β.

Key words: tissue construction, cytological experiments of tissue construction, transforming growth factor beta, receptor protein tyrosine phosphatase kappa, human keratinocytes, Notch, NICD

中图分类号:

R318

薛斯亮，王晓珊，李东川，张珏. 人角质形成细胞Notch信号通路与转化生长因子β调控受体蛋白的作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 296-300.

Xue Si-liang, Wang Xiao-shan, Li Dong-chuan, Zhang Jue. Notch signal pathway effect on receptor protein regulation by transforming growth factor beta in primary human keratinocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 296-300.

图/表（结果） 3

2.1 角质形成细胞培养角质形成细胞贴壁成典型铺路石样外观，每四五天可传1代。

2.2 转化生长因子β对角质形成细胞RPTP-κ mRNA表达的影响覆盖率为40%的角质形成细胞在加入了转化生长因子β后，RPTP-κ mRNA量在1，3，8，24，48 h分别为对照组的1.2倍(P > 0.05，n=3)、2.4，4.0，5.5，7.5倍(P < 0.01，n=3)。见图1。

图1 转化生长因子β作用下人角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa mRNA表达量

Figure 1 Transforming growth factor β induces receptor protein tyrosine phosphates kappa (RPTP-κ) mRNA expression in human primary keratinocytes

2.3 Notch在转化生长因子β提高RPTP-κ mRNA表达中的作用在用Jagged-1激活Notch通道的角质形成细胞中，只加入Jagged-1组为对照1.5倍(P < 0.05，n=3)，只加入转化生长因子β者为对照组2.4倍(P < 0.01，n=3)，两者都加入者为对照组的4.3倍(P < 0.01，n=3)，见图2。

图2 Jagged-1和转化生长因子β分别加入人角质形成细胞后使受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达

Figure 2 Jagged-1 peptide increases transforming growth factor beta (TGF-β) induced receptor protein tyrosine phosphates kappa (RPTP-κ) mRNA expression in primary human keratinocytes

在用γ-分泌酶抑制剂抑制Notch通道的角质形成细胞中，RPTP-κ mRNA只加入转化生长因子β者为对照组的4.1倍(P < 0.01，n=3)，只加γ-分泌酶抑制剂者为对照组的0.4(P > 0.05，n=3)倍，两者都加者为对照组的0.7(P > 0.05，n=3)倍，见图3。

图3 加入γ-分泌酶抑制剂抑制转化生长因子β对受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa mRNA的升高作用

Figure 3 Inhibition of transforming growth factor beta (TGF-β) induced receptor protein tyrosine phosphates kappa (RPTP-κ) mRNA expression by gamma- secretase inhibitors in human

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引言

Notch信号通道和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通道之间有着共同的信号通路或者细胞因子，从而相互影响^[1]。Notch基因首次发现于1917年，其突变可造成果蝇的残翅，1983年Artavanis Tsakonas研究组首次克隆了该基因^[2]。Notch受体可影响细胞分化和发育，尤其是在胚胎的发育过程中Notch信号途径更是不可缺的^[3]。Notch信号通道的活化过程主要是经过3次蛋白质水解的步骤。最后被γ-分泌酶切割为胞内片段(NICD)，NICD是Notch在细胞内的真正活性形式^[4-6]。精确调节Notch通路对组织的分化发育相当重要，通路中任何一个环节出现异常都可能导致病理状态的发生^[7]。转化生长因子β家族是在无脊椎动物和脊椎动物都具有的一种高度保守细胞因子，其成员参与调节细胞增殖、分化、凋亡、黏附、发育、炎症

反应及创伤愈合等多种生命活动^[8]。Smad家族成员则是转化生长因子β信号的传递者，其中Smad2和Smad3作为受体激活的Smads介导转化生长因子β和激活素信号的细胞内信号^[9]。在最近的研究中却发现，转化生长因子β和Notch信号通道可以共同作用于Notch信号通道的目的基因，产生调控作用，抑制成肌分化和内皮细胞的迁移^[9-12]。Blokzijl等^[11]发现Notch信号通道的目的基因Hes-1，同时也是转化生长因子β通道的直接目的基因。转化生长因子β信号对Hes-1等基因转录增加时，活性CSL和NICD是必不可少的。由此可见Notch和转化生长因子β两个信号通道是即独立又相互作用的。

受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa(receptor protein tyrosine phosphates，RPTPκ)在皮肤科学的研究主要集中在其对EGFR信号通路的影响上。RPTP-κ胞外结构由3个黏附分子样片段构成，可以和临近细胞同类抗原的分子结合，从而使RPTP-κ稳定表达，其催化的去磷酸化过程使EGFR处于非激活状态。阻断EGFR信号通道或者过量表达PPTP-κ都可以抑制细胞的生长^[13]。而转化生长因子β对表皮的生长抑制作用也正是通过RPTP-κ来实现的。RPTP-κ对表皮生长的抑制作用正是皮肤肿瘤的形成，皮肤老化，皮肤慢性炎症等现象的重要调控机制^[14]。

所以在皮肤中RPTP-κ的调控至关重要，而转化生长因子β似乎是其调控的上游因子，但既然Notch信号和转化生长因子β信号通道如此的息息相关，那么Notch是不是也参加了转化生长因子β信号对RPTP-κ的调控，从而在皮肤肿瘤的形成等过程中扮演重要的角色呢？实验正是基于以上疑问而开展。

材料方法

设计：组织构建细胞学实验。

时间及地点：于2009年8月至2010年3月在密歇根大学皮肤科实验室完成。

材料：成人角质形成细胞细胞株购于Cascade Biologics公司(Portland，OR)；角质形成细胞生长培养基、角质形成细胞基础培养基购于Epilife，美国；人重组转化生长因子β1购于R&D System，美国；Jagged1 肽段购于AnaSpec，美国；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒、RT-PCR(Taqman)试剂盒购于Applied Biosystems，美国；Trizol、胰蛋白酶中和液(TN)、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸溶液(TE)、双抗、PBS 购于invitrogen，美国；γ-分泌酶抑制剂(GSI)、引物合成及探针修饰购于美国密歇根大学皮肤科实验室。

方法：

人角质形成细胞的培养和传代：人细胞到80%的覆盖率可以用于传代。移走培养皿中所有培养液，加入3 mL TE液，消化细胞，5 min后镜下观察细胞，80%细胞漂浮时加入7 mL TN液，吹打剩余贴壁细胞，并吹打混匀为单细胞悬液。将细胞悬液移入离心管中， 1 200 r/min，5 min离心。吸出上清，并用5 mL角质形成细胞生长培养基重悬为细胞悬液，1∶5传代。细胞悬液轻摇后放入培养箱，37 ℃，体积分数5%CO₂培养。

转化生长因子β对角质形成细胞RPTP-κ表达的影响：取覆盖率为40%的角质形成细胞6孔板。将六孔板中培养基用真空移液器吸出。在每孔中加入1 mL 角质形成细胞基础培养基，放入培养箱30 min。再加入2.5 µL转化生长因子β，轻柔振摇培养板后，分别放入培养箱0，1，3，8，24，48 h。时间到后拿出Trizol法提取总RNA。按试剂盒说明进行RT-PCR。人类RPTP-k引物设计：上游引物：5’-ACA GAG TGG TGA AAA TAG CAG GAA-3’，下游引物：5’-TGA CAA CTA GGA GAA GGA GGA TGA-3’。实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)反应参数：94 ℃×10 min，94 ℃×20 s，60 ℃× 30 s，72 ℃×30 s，45个循环。以不加转化生长因子β的角质形成细胞为对照。

加入Jagged-1激活Notch对转化生长因子β升高RPTP-κmRNA的作用：取覆盖率为40%的角质形成细胞6孔板，移除培养基后在每孔中加入1 mL 角质形成细胞基础培养基，放入培养箱30 min，加入Jagged-1 4 µL，振摇，放入培养箱4 h。吸去培养液。每孔加入1 mL 角质形成细胞基础培养基后，加入转化生长因子β 2.5 µL，放入培养箱4 h。并只加转化生长因子β或γ-分泌酶抑制剂和不加干扰项作为对照。每个时间点分别mRNA抽提、反转录和Real-time PCR检测。

加γ-分泌酶抑制剂Notch对转化生长因子β升高RPTP-κmRNA的作用：取覆盖率为40%的角质形成细胞6孔板，移除培养基后在每孔中加入1 mL 角质形成细胞基础培养基，放入培养箱30 min后加入γ-分泌酶抑制剂2 µL，振摇后，放入培养箱24 h。吸去培养液，每孔加入1 mL 角质形成细胞基础培养基后，再加入转化生长因子β 2.5 µL，放入培养箱4 h。并只加转化生长因子β或γ-分泌酶抑制剂和不加干扰项作为对照。每个时间点分别mRNA抽提、反转录和Real-time PCR检测。

主要观察指标：Notch信号通道在转化生长因子β对RPTP-κmRNA调控过程中起到的作用。

统计学分析：由第三作者采用SPSS17.0，使用配对t 检验进行统计，统计学软件来源为第一作者所在研究室购得。

讨论

RPTP-κ胞外结构由3个黏附分子样片段构成，可以和临近细胞的同类抗原分子结合，和其它RPTP一样，它可以使EGFR处于非激活状态^[14]，但RPTP-κ的作用是所有RPTP中最强的。RPTP-κ将使EGFR被氧化物激活的酪氨酸磷酸化作用降低5倍，从而减少表皮肿瘤形成的可能性^[15]。本实验中发现Notch通道对RPTP-κ的重要作用，让课题组对Notch在皮肤抗衰老和皮肤肿瘤的研究和应用前景充满了期待。而转化生长因子β的控制细胞增生作用在RPTP-κ不表达的情况下无效^[13]，这说明后者是前者在抑制细胞生长作用的下游效应因子。Blokzijl等^[11]发现Notch信号通道的目的基因Hes-1，同时也是转化生长因子β通道的直接目的基因。这说明转化生长因子β和Notch信号通道在RPTP-κ的作用上关系密切。

Lowell等^[16]发现，Notch信号通道对表皮角质形成细胞的生长抑制和分化作用主要是通过增加配体表达，从而使临近同样表达有Notch受体的细胞生长周期延长，整合素水平下降。敲除Notch的小鼠表皮可出现毛囊间表皮增生，表皮基底细胞层与马尔匹基层细胞中角蛋白异常增多，基底层以上整合素增多。可表现为表皮角化过度，脱毛和表皮囊肿。其原理可能是在Notch受体与配体结合后，增强了转化生长因子β信号，从而提高了RPTP-κ的表达，阻止EGFR酪氨酸磷酸化，控制表皮细胞的生长。

在本实验中，为了证明Notch信号与转化生长因子β，RPTP-κ有直接联系，在人角质形成细胞中加入Notch配体Jagged-1，发现细胞中Hes-1和RPTP-κ都有明显增加。Jagged-1在激活Notch信号的同时激活了转化生长因子β，增加了RPTP-κ的表达量。所以说Notch与两者确有直接联系。而将Notch信号抑制剂加入高覆盖率的人角质形成细胞后，本该升高的RPTP反而不高，甚至略低于低覆盖率的细胞，所以RPTP-κ的表达似乎确需依赖于Notch信号通道。为了找出Notch在转化生长因子β使是RPTP-κ升高的过程中的角色，作者先使用Jaaged-1激活人角质形成细胞的Notch信号通路，再加入转化生长因子β，RPTP-κ的mRNA表达量显著的高于只有转化生长因子β作用的细胞。也就是说Notch信号的激活可以显著提高转化生长因子β上调RPTP-κ的作用。而当将Notch抑制酶先处理过角质形成细胞后，再加入转化生长因子β，RPTP-κmRNA量几乎没有变化。这说明了Notch信号在转化生长因子β提高RPTP-κ mRNA的这一过程是必需且不可或缺的。

在基底细胞癌和表现为表皮角化过度的肿瘤中Notch信号都明显减少，而Notch的肿瘤抑制作用可以受转化生长因子β调节，RPTP-κ则有可能是其原理的重要因素。EGFR在其他多种肿瘤的形成中起着至关重要的作用，目前多种抗肿瘤药物以EGFR作为治疗靶点。比如西妥昔单抗，作用于EGFR胞外区的IgG单克隆抗体，通过使肿瘤细胞进入G₀/G₁期而达到抑制肿瘤生长的目的；吉非替尼和厄洛替尼通过竞争性抑制EGFR的ATP结合位点而阻断下游EGFR信号通道的激活。所以对EGFR起着抑制作用的RPTP-κ和Notch信号通路完全有可能成为新的治疗靶点和研究方向。

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