超脉冲CO2点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕的原位再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 228-234.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.008

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超脉冲CO₂点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕的原位再生

谭军，雷颖，李高峰，欧阳华伟，朱轶，李波

湖南师范大学第一附属医院整形激光美容科(湖南省人民医院整形&激光美容外科)，湖南省长沙市 410005

收稿日期:2012-02-01 修回日期:2012-05-18 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 雷颖，硕士，医师，湖南师范大学第一附属医院整形激光美容科(湖南省人民医院整形&激光美容外科)，湖南省长沙市 410005 doctorleiying@163.com
作者简介:谭军，男，1963年生，湖南省长沙市人，汉族，1985年衡阳医学院毕业，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事瘢痕的激光再生修复，皮肤激光美容，面部整形美容的研究。

Ultrapulse CO₂ fractional laser intervens in situ superficial scar regeneration in a rabbit ear

Tan Jun, Lei Ying, Li Gao-feng, Ouyang Hua-wei, Zhu Yi, Li Bo

Department of Plastic and Cosmetic Surgery, the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University (Hunan Provincial People’s Hospital), Changsha 410005, Hunan Province, China

Received:2012-02-01 Revised:2012-05-18 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Lei Ying, Master, Physician, Department of Plastic and Cosmetic Surgery, the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University (Hunan Provincial People’s Hospital), Changsha 410005, Hunan Province, China doctorleiying@163.com
About author:Tan Jun, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Plastic and Cosmetic Surgery, the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University (Hunan Provincial People’s Hospital), Changsha 410005, Hunan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床上超脉冲CO2点阵激光治疗浅表性瘢痕的效果优良，但机制不清。
目的：进一步验证超脉冲CO2点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕的效果，并探讨创面原位再生修复的相关机制。
方法：用超脉冲CO2点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕，传统络合碘治疗和湿润烧伤膏治疗两种修复方法对创面进行修复。
结果与结论：湿润烧伤膏组创面愈合显著短于络合碘组(P < 0.01)。超脉冲CO2点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕后即刻创缘无表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白表达，24 h后细胞角蛋白19、P63蛋白表达。湿润烧伤膏组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白开始增多，第7天达到高峰，第14天逐渐减少；络合碘组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白达高峰，第7天和第14天减少。湿润烧伤膏组细胞角蛋白19、P63蛋白强阳性表达率显著高于络合碘组(P < 0.05)。提示超脉冲CO2点阵激光结合湿润暴露疗法治疗兔耳浅表性瘢痕，能更好地启动和保护表皮干细胞，促进创面原位再生修复。

关键词: 组织构建, 皮肤组织构建, 超脉冲CO2激光, 点阵激光, 浅表性瘢痕, 表皮干细胞, 细胞角蛋白19, P63蛋白, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The ultrapulse CO2 fractional laser has a good effect on the treatment of superficial scars, but the mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrapulse CO2 fractional laser on the treatment of superficial scars in rabbit ear and to explore mechanism of wound in situ regeneration and repair.
METHODS: The superficial scars in rabbit ear were induced with ultrapulse CO2 fractional laser, then traditional iodophor treatment and moist exposed burn ointment treatment methods were used for repairing the wound.
RESULTS AND CONCLUSION: The wound healing time of moist exposed burn ointment group was shorter than that of iodophor group (P < 0.01). The epidermal stem cells emerged after the superficial scars induced with ultrapulse CO2 fractional laser, and the expression of cytokeratin 19 and P63 protein was observed after induced for 24 hours. The number of cytokeratin 19 and P63 protein in the moist exposed burn ointment was increased after induced for 4 days and reached peak at 7 days and then decreased at 14 days. While the number of cytokeratin 19 and P63 protein in the iodophor group was increased after induced for 4 days, and then decreased after induced for 7 and 14 days. The expression of cytokeratin 19 and P63 protein in the moist exposed burn ointment group was significantly higher than that in the iodophor group (P < 0.05). Ultrapulse CO2 fractional laser combined with moist exposed burn ointment for the treatment of superficial scar in rabbit ear can better activate and protect the epidermal stem cells, and promote wound repair and in situ regeneration.

Key words: tissue construction, skin tissue construction, ultrapulse CO2 laser, fractional laser, superficial scar, epidermal stem cells, cytokeratin 19, P63 protein, provincial grants-supported paper, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

谭军，雷颖，李高峰，欧阳华伟，朱轶，李波. 超脉冲CO₂点阵激光干预兔耳浅表性瘢痕的原位再生[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 228-234.

Tan Jun, Lei Ying, Li Gao-feng, Ouyang Hua-wei, Zhu Yi, Li Bo. Ultrapulse CO₂ fractional laser intervens in situ superficial scar regeneration in a rabbit ear[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 228-234.

图/表（结果） 7

2.1 动物实验数量分析实验选用大白兔20只大白兔，分为2组，无脱失，全部进入结果分析。
2.2 两组创面大体观察结果络合碘组创面愈合时间为(13.7±0.65) d，湿润烧伤膏组创面愈合时间为(10.4±0.80) d，组间差异有显著性意义(t=10.12，P < 0.01)。
2.3 兔耳创面组织病理学观察结果免疫组织化学染色显示瘢痕组织中细胞成分较少,胶原纤维等细胞外基质成分较多，表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白阳性细胞的表达呈单层片状、散在分布于表皮基底层，且P63蛋白阳性表达较细胞角蛋白19更为显著。说明兔耳瘢痕中存在表皮干细胞的表达，见图1。

图1 兔耳创面组织病理学观察结果
Figure 1 Pathological observation of wound tissue in the rabbit ear

2.4 两组兔耳瘢痕组织表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白表达利用超脉冲CO₂点阵激光干预兔耳瘢痕，治疗后即刻创缘无表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白表达，24 h后表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白开始出现。湿润烧伤膏组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白开始增多，第7天达到高峰，棘细胞层或颗粒层出现多个散在阳性细胞，越接近创面这些阳性细胞越密集，第14天逐渐减少，且细胞角蛋白19、P63蛋白阳性细胞的表达又回复到表皮基底层；络合碘组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白达高峰，但数量明显少于美宝湿润暴露治疗组，第7天和第14天逐渐减少，随创面上皮化愈合后，这些阳性细胞逐渐减少。湿润烧伤膏组细胞角蛋白19、P63蛋白强阳性表达率(70%，70%)明显高于络合碘组(40%、42.5%)，组间差异有显著性意义(t=7.27，6.15，P < 0.05)。见图2-7。

图2 络合碘组治疗后细胞角蛋白19及P63蛋白变化(×100)
Figure 2 Changes of cytokeratin 19 and P63 protein in the iodophor group (×100)

图3 络合碘组治疗后细胞角蛋白19变化(×400)
Figure 3 Changes of cytokeratin 19 in the iodophor group (×400)

图4 络合碘组治疗后P63蛋白变化(×400)
Figure 4 Changes of P63 protein in the iodophor group (×400)

图5 湿润烧伤膏组治疗后细胞角蛋白19及P63蛋白变化(×100)
Figure 5 Changes of cytokeratin 19 and P63 protein in the moist exposed burn ointment group (×100)

图6 湿润烧伤膏组治疗后细胞角蛋白19变化(×400)
Figure 6 Changes of cytokeratin 19 after treatment in the moist exposed burn ointment (×400)

图7 湿润烧伤膏组治疗后P63蛋白变化(×400)
Figure 7 Changes of P63 protein after treatment in the moist exposed burn ointment (×400)

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引言

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：实验于2010年4至8月在湖南省人民医院临床研究所实验室完成。

材料：清洁级新西兰大耳白兔20只，雌雄不拘，体质量2.0-2.5 kg，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，合格证号：SCXK(湘)2009-2012。

实验方法：

动物模型的建立：兔耳浅表性瘢痕模型参照Morris 等^[6]和李荟元等^[7]的方法并加以改进。兔耳缘静脉注射氯胺酮15 mg/kg麻醉后，在严格无菌操作技术下，避开耳腹面可见血管，每耳做两个1.5 cm²正方形、间隔1 cm的全层皮肤缺损创面，去除皮肤、皮下及软骨膜，20只兔双耳共80个创面。建模后创面暴露，待其自行愈合，建模后60 d所形成的瘢痕开始变软，色泽变淡，略高出平面，表面平整，触之质软，建立兔耳浅表性瘢痕模型。

超脉冲CO₂点阵激光：造模成功后，用超脉冲CO₂点阵激光：SP模式：175 mJ，40 Hz；FP模式：175 mJ，40 Hz，1-6-9 CPG分别对80个浅表性瘢痕创面进行治疗，治疗后创面分为传统络合碘治疗组和湿润烧伤膏治疗组对创面进行修复，络合碘治疗组予以换药1次/d，湿润烧伤膏治疗组每三四个小时予以换药1次，换药前将残留在创面上的药物及液化物拭去，涂抹厚度薄于 1 mm，共换药2周。

标本提取及主要观察指标：①大体观察：随机法选取其中10只兔子，20只兔耳，40个创面，每天观察创面的愈合情况，以创面完成上皮化为标准，记录每个创面的愈合时间。②组织病理学观察：用另10只兔子沿瘢痕边缘于治疗前、治疗后即刻、治疗后24 h、治疗后4，7，14 d横行切取0.3 cm兔耳治疗创面瘢痕组织。标本即刻体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋，垂直于激光治疗孔纵行切片，每张切片厚3 μm，切片行苏木精-伊红染色和Elivision两步法免疫组织化学染色，观察皮肤干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白的表达变化，具体操作按照试剂盒说明书进行。细胞角蛋白19、细胞核P63蛋白呈棕黄色着色为表达阳性，计算强阳性细胞百分率，即强阳性表达率。均以出现棕黄色着色为表达阳性。

主要观察指标：①两组创面大体观察。②兔耳创面组织病理学观察。③两组兔耳瘢痕组织细胞角蛋白19、P63蛋白表达。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析和处理。创面愈合时间检测数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.01为差异有显著性意义。强阳性表达率采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

瘢痕是人体创伤修复过程中的一种产物，是真皮组织损伤后异常修复的结果，对瘢痕的防治，是整形科的重点和难点。瘢痕的主要病理特点是：成纤维细胞的过度增生，毛细血管异常增多，胶原等结缔组织基质的过度沉积，而且相互影响。以往对瘢痕的治疗有两大策略：抑制成纤维细胞的过度增生，减少胶原合成和促进降解；抑制瘢痕中血管的生成[8-11]。而对于瘢痕治疗创面中皮肤附属器官的再生修复重建重视不够，忽视了残存组织的再生修复。付小兵等[12]在瘢痕组织中汗腺的分布特征以及瘢痕对汗腺再生影响的实验研究中发现：严重的烧伤后创面存在汗腺再生的生物学基础和潜力。谢举临等[13]在观察烫伤大鼠不同深度创面组织中表皮干细胞的分布情况时发现：残存的表皮干细胞可能是创伤修复过程中再上皮化的细胞来源。周鹏翔等[14]认为：在皮肤创伤修复过程中可能存在优势假说，在皮肤创伤修复过程中，当创面微环境有利于表皮生长且表皮的生长占优势时，创面愈合就朝生理性愈合方向发展，最终，缺损组织完全再生，相反则缺损组织不完全再生。

表皮干细胞是皮肤修复、重塑的关键性源泉[15]。表皮干细胞主要位于表皮基底层和毛囊外根鞘膨凸部，这里富含血管和神经，为表皮干细胞的生长提供必要的环境和丰富的营养[16]。Alonsoh 等[17]用组织学和同位素示踪法观察到毛囊外鞘中段、皮脂下方有一特殊结构(隆突)，以多能干细胞团的形式存在于此结构中，隆突内的干细胞向上形成皮脂腺，并源源不断地为表皮基底层提供干细胞，向下可至毛囊根部补充毛囊干细胞。Oshima等[18]采用转基因技术将Rose 26转基因小鼠的毛囊隆突部取代野生鼠的隆突部然后移植到裸鼠肾包膜下，产生嵌合型毛囊，进一步确认了干细胞在毛囊隆突部，隆突部的细胞不但形成了毛囊分化的所有细胞系，而且可形成皮脂腺细胞及毛囊间表皮细胞。1995年Michel等[19]首先采用双标记法证明毛囊里的细胞角蛋白19表达阳性细胞正是[3H]胸腺嘧啶核苷标记滞留细胞，因此细胞角蛋白19单克隆抗体就被广泛应用于检测表皮干细胞。P63蛋白是近年发现的P53家族成员之一，其主要在各种上皮组织的发育、分化和形态发生上起重要作用，P63蛋白是目前所知基因中惟一确定的表皮干细胞特异性标志物，对维持表皮干细胞的生存具有重要作用[20-21]。

目前，随着激光设备及CO2激光的发展，新一代超脉冲CO2点阵激光已经应用。临床上有报道用超脉冲CO2点阵激光治疗浅表性瘢痕以及其治疗创面采用MEBO湿润暴露疗法修复，临床观察表明患者痛苦小，创面愈合快，并发症少，外观改善大，患者满意率高。MEBO在创面修复中有保护创面、充分引流、止痛、减轻瘢痕等作用[22-23]。在国外，利用超脉冲CO2点阵激光Deep FX模式(微点阵)具有的较小光斑直径、更深的穿透和更低的治疗密度，同时能提供快速的恢复和良好的组织收缩治疗瘢痕，创面使用含有水、甘油、积雪甘草精华等成分的润肤膏护理，以保持创面湿润、促进创面愈合[24-25]。Jordan等[26]认为CO2点阵激光一次扫描可产生类似Ⅱ度烧伤的创面。

表皮干细胞可能在超脉冲CO2点阵激光治疗浅表性瘢痕创面修复中发挥极其重要的作用，如何有效启动、保护表皮干细胞，发挥表皮干细胞的作用可能直接影响浅表性瘢痕的修复效果。因此，作者通过制作兔耳浅表性瘢痕模型，用超脉冲CO2点阵激光治疗兔耳浅表性瘢痕的方法，同时用传统络合碘治疗方法和美宝湿润暴露治疗法对其治疗创面进行修复，通过大体观察创面愈合情况，络合碘组创面干燥、结痂，痂皮脱落后，创面上皮化愈合。湿润烧伤膏组创面湿润、不结痂，创面上皮覆盖均匀。湿润烧伤膏组在创面愈合时间上短于传统络合碘治疗组(P < 0.01)，且可使创面在生理性湿润的环境中愈合，同时改善局部微循环，湿润烧伤膏中营养成分被残存于皮肤基底层中的潜能表皮干细胞细胞吸收，并在原位分化成各种皮肤细胞，生理性修复创面，减轻瘢痕。

兔耳瘢痕苏木精-伊红染色显示大量胶原纤维呈不规则排列，成纤维细胞数量增多，大量胶原组织沉淀，胶原纤维由增生期漩涡状排列变成结节状排列，瘢痕内大部分毛细血管已闭合。有研究发现瘢痕组织中存在表皮干细胞，且瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞少于健康皮肤[27-28]。通过免疫组织化学染色显示兔耳瘢痕组织中细胞成分较少，胶原纤维等细胞外基质成分较多，表皮干细胞标志分子细胞角蛋白19、P63蛋白阳性细胞的表达呈单层片状、散在分布于表皮基底层，且P63蛋白阳性表达较细胞角蛋白19更为显著，说明兔耳瘢痕中存在表皮干细胞的表达。利用超脉冲点阵CO2激光干预兔耳瘢痕，治疗后即刻创缘无细胞角蛋白19、P63蛋白表达，24 h后细胞角蛋白19、P63蛋白开始出现，且呈片状散在分布于表皮基底层；美宝湿润暴露治疗组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白开始增多，第7天达到高峰，棘细胞层或颗粒层出现多个散在阳性细胞，出现表皮干细胞异位现象，越接近创面这些阳性细胞越密集，第14天逐渐减少，且细胞角蛋白19、P63蛋白阳性细胞的表达仅存在表皮基底层，说明随着机体创面修复信号的启动，表皮干细胞快速地向表皮上层迁移，参与创面的修复；络合碘治疗组治疗后第4天细胞角蛋白19、P63蛋白达高峰，其棘细胞层和颗粒层亦可见散在阳性细胞的表达，但数量明显少于美宝湿润暴露治疗组，第7天和第14天逐渐减少。美宝湿润暴露治疗组细胞角蛋白19、P63蛋白表达强阳性率明显高于络合碘治疗组(P < 0.05)。结合两组创面修复时间的对比，皮肤干细胞被激活后在表皮存留时间越长、越多，创面修复就越快。

实验结果表明，超脉冲CO2点阵激光治疗浅表性瘢痕，能够启动和激活表皮干细胞，结合美宝湿润暴露治疗创面，保护表皮干细胞并在原位分化成各种皮肤细胞，促进创面原位再生修复，为临床治疗效果提供了新的理论依据。但超脉冲CO2点阵激光对细胞的光生物学效应、对细胞器(如线粒体、高尔基体、内质网等)能量代谢的影响，超脉冲CO2点阵激光治疗的精确性，如建立超脉冲CO2点阵激光的量效关系和根据瘢痕的厚度变化即瘢痕“地形图”设定治疗参数，以准确地决定激光穿透深度和热弥散范围，真正实现激光的“精确治疗”，还有待进一步研究。

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