雷洛昔芬促进兔下颌骨骨折的愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：雷洛昔芬虽在临床中广泛应用于治疗骨质疏松，但对骨折愈合的影响尚未见报道。
目的：观察雷洛昔芬对兔下颌骨骨折愈合的影响。
方法：取新西兰大耳白兔24只，制备双侧下颌角1.5 mm×10.0 mm骨缺损模型，随机抽签法分为2组，实验组于造模后第2天开始给予7.5 mg/(kg•d)雷洛昔芬至30 d，对照组不作处理。
结果与结论：X射线观察造模后1周两组骨缺损区骨痂形成不明显。3周实验组缺损区模糊，对照组缺损区仍可见；4周实验组骨痂多，髓腔再通；对照组骨痂较多，髓腔未通。造模后1，3，4周实验组骨密度和血清骨源性碱性磷酸酶较对照组明显升高(P < 0.05)，均于第4周时达到高峰；造模后3，4周实验组骨痂中骨形态发生蛋白2的表达强度高于对照组(P < 0.01)。提示雷洛昔芬能够促进成骨细胞分化，加速骨矿物沉积，同时诱导骨形态发生蛋白2表达从而加速骨折的愈合。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 雷洛昔芬, 下颌骨, 骨折愈合, 兔, 骨形态发生蛋白, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Although raloxifene has been widely applied in the treatment of osteoporosis, its influence on fracture healing is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of raloxifene on the healing of mandibular fractures in rabbits.
METHODS: Totally 24 New Zealand white rabbits were collected. Model of bilateral mandibular angle bone defect (1.5 mm×10.0 mm) in rabbits was established. All rabbits were randomly divided into experimental and control groups. The rabbits in the experimental group were performed 7.5 mg/(kg•d) raloxifene at day 2 after modeling for 30 days, while those in the control group had no treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray observation showed that callus formation was not obvious in the two groups after modeling for 1 week. Defect area of the experimental group was indistinct, but that of the control group could be found at week 3. At week 4, callus in the experimental group was increased and medullary cavity passed again. Callus in the control group was more, and medullary cavity did not pass. Compared with control group, bone mineral density and serum bone alkaline phosphatase in the experimental group was increased obviously after modeling for 1, 3 and 4 weeks (P < 0.05), and they both reached the peak. The expression of bone morphogenetic protein 2 in callus was higher than that of the control group after modeling for 3 and 4 weeks (P < 0.01). These results suggest that raloxifene can promote osteoblast differentiation, accelerate bone mineral deposition, and induce bone morphogenetic protein 2 expression at the same time, and thereby accelerate the healing of bone fracture

Key words: tissue construction, bone tissue construction, raloxifene, mandible, fracture healing, rabbits, bone morphogenetic proteins, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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Liu Kai, Shi Chong, Liu Shu-fa, Zhang Hong-kai. Raloxifene promotes the healing of mandibular fractures in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 217-222.

图/表（结果） 7

2.1 动物大体观察及X射线观察两组兔术后均未出现切口感染及坏死。造模后1周：两组骨缺损区骨痂形成不明显。造模后3周：实验组缺损区模糊，对照组缺损区仍可见。造模后4周：实验组骨痂多，髓腔再通；对照组骨痂较多，髓腔未通，见图1，2。

图1 造模后不同时间点给予雷洛芬的实验组动物骨缺损X射线平片表现
Figure 1 X-ray plain film performance of rabbit bone defects in the experimental group at different time points after modeling

图2 造模后不同时间点对照组动物骨缺损X射线平片表现
Figure 2 X-ray plain film performance of rabbit bone defects in the control group at different time points after modeling

2.2 骨密度测定两组骨密度值进行性升高均于第4周时达到高峰，1周时两组值差异无显著性意义 (P > 0.05)，3，4周实验组较对照组明显升高(P < 0.05)，见表1。

2.3 血清骨源性碱性磷酸酶测定实验组血清骨源性碱性磷酸酶均较对照组高，差异有显著性意义(P < 0.05)，造模后4周达峰值，见表2。

2.4 组织学观察结果见图3-5。造模后1周：两侧骨端骨细胞、骨折间隙大量成纤维细胞、成骨细胞及成软骨细胞均呈阳性染色，对照组染色强度弱于实验组。

图3 两组不同时间点骨形态发生蛋白2免疫组织化学灰度值比较
Figure 3 Comparison of gray value of bone morphogenetic protein 2 in the two groups at different time points

造模后3周：骨端的成骨细胞、成纤维细胞以及骨痂的成骨细胞、成软骨细胞成纤维细胞均呈阳性染色，相比下实验组更强。

图4 造模后不同时间点给予雷洛芬的实验组免疫组织化学观察(×100)
Figure 4 Immunohistochemistry observation of the experimental group at different time points after modeling (×100)

造模后4周：骨痂中和骨痂表面成骨细胞呈阳性染色，实验组仍强于对照组。图像分析免疫组织化学染色强度测量结果：两组均在第3周时染色强度最高。统计结果显示，第3，4周实验组染色强度明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)。表明实验组骨痂中骨形态发生蛋白2的表达强度高于对照组，见图3-5。

图5 造模后不同时间点对照组免疫组织化学观察(×100)
Figure 5 Immunohistochemistry observation of the control group at different time points after modeling (×100)

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引言

材料方法

设计：对比观察。

时间及地点：实验于2010年5至9月在佳木斯大学动物实验中心完成。

材料：

实验动物：健康新西兰大耳白兔24只，雌雄不拘，体质量1.9-2.1 kg，由佳木斯大学动物实验中心提供。

方法：

兔下颌骨骨折模型的制备：术前动物禁食(不禁水)12 h，动物腹腔注射10%水合氯醛 (3 mL/kg)麻醉。无菌条件下在一侧下颌骨体部切口，暴露骨面，用高速技工马达在下颌骨体部垂直造成1.5 mm×10.0 mm的部分骨折模型，冲洗伤口后分层对位缝合筋膜、肌肉和皮肤。造模后肌肉注射盐酸庆大霉素4×10⁴U/只，1次/d，连续3 d，分笼饲养。

干预分组：造模后将24只动物随机抽签法分为2组，每组12只。实验组于造模后第2天开始口服雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)，每次观察至雷洛昔芬被完全吞服，共30 d；对照组，不作任何处理。放入标准实验室笼中喂养并允许自由活动。

检测指标：

X射线及骨密度测定：在造模后1，3，4周每组随机抽取家兔4只，行下颌骨正侧位摄片，观察骨折位置及骨痂生成情况。照射范围包括骨折断端在内长1 cm范围。骨密度测定用骨密度扫描仪测定每组动物颌骨骨折断端处骨密度。血清骨源性碱性磷酸酶的检测：造模后1，3，4周分别抽取兔耳缘静脉血送检。

组织学观察：空气栓塞处死后，切取包含骨缺损在内长度为1 cm的骨组织，去除软组织，在4%戊二醛室温固定24 h或48 h，生理盐水洗干净后，放入15% EDTA中性甲醛溶液中，低温约(4 ℃)脱钙2周，常规石蜡包埋，切片，切片厚5 μm，进行免疫组织化学染色。免疫组织化学染色图像处理应用JD801图像分析仪对骨形态发生蛋白2表达结果进行半定量分析，将免疫组织化学染色切片通过显微镜输入计算机分析系统，所有载玻片均应在同一放大倍数(×400)，同一光强度下分析，每个时相点2张玻片，分别测相同的面积。测量指标：平均吸光度=lg225-lgA，A代表测量灰度值。图像表现：背景是灰白色，免疫组织化学的染色是棕红色，之后测定免疫组织化学染色区的吸光度。吸光度值和被染色的颜色深浅度呈正比例，即细胞中骨形态发生蛋白2表达越强，其染色就越深，吸光度值测定就越高。

主要观察指标：两组动物造模后1，3，4周行骨密度和血清骨特异性碱性磷酸酶检测，X射线平片和骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色并观察。

统计学分析：由通讯作者采用SPSS 17.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，采用重复测量的方差分析和完全随机设计的两样本的t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨折愈合是一个影响因素众多、极其复杂的机体结缔组织再生修复的生理过程[6-8]，传统叙述将骨折愈合的组织学分为4个阶段：炎性阶段、软骨痂阶段、硬骨痂阶段和再塑阶段[9-10]，骨组织时刻处于骨重建的动态变化之中，即不间断的骨形成和骨吸收贯穿于生命的始终。骨重建是个非常复杂的过程，受多种因素的交互作用，这些因素包括成骨细胞、破骨细胞、激素、生长因子、细胞因子，最终达到骨结构的稳定。

从X射线结果分析，造模后1周，实验组骨折处骨痂桥接面积较对照组明显增大。造模后3周，实验组骨折断端已桥接，有连续骨痂形成；对照组断端仅开始桥接。造模后4周，各组两骨折断端均已桥接，断端附近骨膜形成密度较高、体积较大的连续骨痂，实验组骨折基本已骨性愈合，骨折线消失，骨痂密度近似于皮质骨，塑形良好并出现部分髓腔再通，且较对照组骨痂体积大、密度高。

生长因子在骨及软骨的形成、骨折愈合、其他组织修复过程中起着重要的作用[11-12]。骨形态发生蛋白2是由成骨细胞分泌具有诱导间充质细胞、骨髓基质细胞、骨膜细胞迁徙、增殖分化为软骨细胞、成骨细胞最终导致新骨形成的成骨活性因子[13-14]，骨形态发生蛋白2是公认的最主要的骨形成调控因子[15-16]，体内外实验都证明其有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力[17-19]。Zhou等[20]研究指出，雌激素替代治疗不仅阻止骨丢失，也增加骨形成，在间充质干细胞中上调成骨基因骨形态发生蛋白2的mRNA表达。骨形态发生蛋白能够诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为成软骨细胞和成骨细胞，导致新骨形成，骨形态发生蛋白的主要生物学作用为诱导间充质细胞分化为成骨细胞，调节细胞外基质的合成和降解[21-23]。骨形态发生蛋白2的水平可反映成骨细胞骨形成能力[24]，实验组在3，4周时骨断端的骨形态发生蛋白2水平均高于对照组，差异有显著性意义，说明雷洛昔芬可以促进骨细胞的骨形成，利于骨折愈合。

骨源性碱性磷酸酶由成骨细胞合成，成骨细胞中含有大量的骨源性碱性磷酸酶，当成骨细胞转化为骨细胞时，骨源性碱性磷酸酶活性逐渐下降、消失。骨源性碱性磷酸酶是骨形成过程必须的催化剂，是反应骨生成速度的最敏感指标，对骨矿化、骨形成有重要作用，对骨钙化障碍的诊断具有重要价值[25]。本实验所用药物能促进成骨细胞的增生活跃，使血清中骨源性碱性磷酸酶升高，对骨折愈合的成骨有促进作用。

雷洛昔芬实验组可以显著增加骨折端骨痂面积、骨小梁密度及成骨细胞数量；显著提高骨折端骨矿物含量、骨密度，促进骨形态发生蛋白2的表达。通过对实验各个阶段组织切片观察实验组较对照组提前机化血肿，纤维、软骨、骨性骨痂的生长情况都优于对照组，髓腔也较后者提前再通。从理论及动物实验上说明有利于骨折愈合。