以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 86-91.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞

骆玉梅，范勇，陈欣洁，岳磊，黎青，余波澜，何文智，马晓燕，孙筱放

广东省产科重大疾病重点实验室，广东省高校生殖与遗传重点实验室，广州医学院第三附属医院，广东省广州市 510150

收稿日期:2012-02-29 修回日期:2012-05-28 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 孙筱放，硕士，教授，硕士生导师，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150 xiaofangsun@hotmail.com
作者简介:骆玉梅★，女，1983年生，广东省广州市人，汉族，2007年广州医学院毕业，硕士，初级技师，主要从事干细胞与组织工程研究。mei.2002@163.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(31171229)；广东省科技计划项目(2009A030200010)；广东省重大科技专项(2011A080300002)。

Generation of induced pluripotent stem cells from villus cells after induction by four kinds of genes during prenatal diagnosis

Luo Yu-mei, Fan Yong, Chen Xin-jie, Yue Lei, Li Qing, Yu Bo-lan, He Wen-zhi, Ma Xiao-yan, Sun Xiao-fang

Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Received:2012-02-29 Revised:2012-05-28 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Sun Xiao-fang, Master, Professor, Master’s supervisor, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China xiaofangsun@hotmail.com
About author:Luo Yu-mei★, Master, Junior Technician, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China mei.2002@163.com
Supported by:
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 31171229*; Technology Planning Project of Guangdong Province, No. 2009A030200010*; Guangdong Key Science and Technology Program, No. 2011A080300002

摘要/Abstract

摘要：

背景：诱导性多能干细胞因具有多能性特征，可以诱导分化为特定的细胞，包括神经细胞、造血细胞等。
目的：建立产前诊断绒毛细胞来源的诱导性多能干细胞。
方法：运用反转录病毒介导4种基因hOct4、hSox2、hc-Myc、hKlf4诱导产前诊断绒毛细胞，对建立的诱导性多能干细胞进行多能性、体内外分化能力、核型等鉴定。
结果与结论：建立的诱导性多能干细胞能维持自我更新状态，在蛋白和mRNA水平上高表达全能性的标志基因，具有体内、外分化潜能；在体外长期培养能维持正常核型。说明4种全能性基因转入绒毛细胞可获得具有多能性的诱导性多能干细胞，这为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源，为产前诊断疾病机制研究提供很好的细胞模型。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 诱导性多能干细胞, 绒毛细胞, 产前诊断, 自体移植, 模型, 国家自然科学基金, 干细胞图片文

Abstract:

BACKGROUND: Due to pluripotent characteristics, induced pluripotent stem cells can be induced to differentiate into the specific cells, including nerve cells and hematopoietic cells.
OBJECTIVE: To establish the induced pluripotent stem cells generated from villus cells during prenatal diagnosis.
METHODS: The prenatal diagnosis villus cells were induced by retroviral vectors encoding hOct4, hSox2, hKlf4 and hc-Myc. The pluripotency, differentiation ability and karyotype of the induced pluripotent stem cells were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The induced pluripotent stem cells maintained the self-renewal ability with high pluripotent marker gene and protein expression and had in vivo and in vitro differentiation potential. The induced pluripotent stem cells could maintain normal karyotype in vitro after long-term culture. The induced pluripotent stem cells obtained from the prenatal diagnosis villus cells provide an ideal source for autologous cell-replacement therapy in the later life of the fetus, and can be used as a perfect model for the research of mechanism underlying prenatally diagnosed diseases.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, induced pluripotent stem cells, villus cells, prenatal diagnosis, autologus transplantation, models, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

骆玉梅，范勇，陈欣洁，岳磊，黎青，余波澜，何文智，马晓燕，孙筱放. 以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 86-91.

Luo Yu-mei, Fan Yong, Chen Xin-jie, Yue Lei, Li Qing, Yu Bo-lan, He Wen-zhi, Ma Xiao-yan, Sun Xiao-fang. Generation of induced pluripotent stem cells from villus cells after induction by four kinds of genes during prenatal diagnosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 86-91.

图/表（结果） 7

2.1 反转录病毒重编程绒毛细胞 293T细胞转染绿色荧光蛋白质粒后，可见80%-90%的细胞表达强绿色荧光，证实质粒转染入293T细胞，18 h后用包装hOct4、hSox2、hKlf4和hc-Myc 4个基因的反转录病毒感染绒毛细胞，绿色荧光蛋白显示感染效率80%-90%，见图1a，b。感染后第7天胰酶消化传代；感染后第14天可见绒毛细胞形态发生巨大变化，成颗粒状聚集快速生长，见图1c；感染后第18天，可见克隆样生长细胞，紧密排列，边界明显，见图1d。用自制玻璃细针进行机械法切割，细胞在传代过程中始终保持较高的核浆比例、明显的核仁、呈单层紧密排列、边界清晰，见图1e。

图1 绒毛细胞重编程情况(标尺=50 μm)
Figure 1 Reprogram of villus cells (Bar=50 μm)

2.2 诱导性多能干细胞特异性标志物鉴定见图2。
未分化诱导性多能干细胞克隆AP检测均呈强阳性。表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60以及TRA-1-81免疫荧光反应呈现强阳性；NANOG表达阳性，显示未分化状态。

图2 诱导性多能干细胞特异性标志物鉴定(a：碱性磷酸酶染色，b-f：免疫荧光染色，标尺=50 μm)

Figure 2 Identification of the specific markers of induced pluripotent stem cells (a: alkaline phosphatase staining; b-f: immunofluorescence staining; bar=50 μm)

2.3 诱导性多能干细胞多能性相关基因检测诱导性多能干细胞与人胚胎干细胞(FY-HES-1)多能性相关基因Oct4、Sox2、NANOG、REX1，呈高表达，远高于未重编程绒毛细胞；基因Klf4、c-Myc表达含量与未重编程绒毛细胞无明显差异，见图3；

图 3 诱导性多能干细胞与FY-HES-1多能性基因Oct4、Sox2、NANOG、REX1呈高表达
Figure 3 High expression of pluripotent genes (Oct4, Sox2, NANOG and REX1) in induced pluripotent stem cells and FY-of HES-1

诱导性多能干细胞外源性转导基因tgOct4、tgSox2、tgKlf4、tgc-MYC表达基本沉默，见图4。

图4 诱导性多能干细胞转导基因tgOct4、tgSox2、tgKlf4、tgc-Myc表达基本沉默

Figure 4 Expression of transduced genes (tgOct4, tgSox2, tgKlf4 and tgc-Myc) in induced pluripotent stem cells was almost silent

2.4 诱导性多能干细胞染色体核型检测诱导性多能干细胞每隔10代进行一次核型分析，已传至第40代，在传代过程中能维持正常核型46，XY，见图5。

图5 诱导性多能干细胞核型分析，正常核型46，XY

Figure 5 Induced pluripotent stem cells showed normal karyotype 46, XY

2.5 诱导性多能干细胞分化能力检测

体外分化潜能：诱导性多能干细胞在悬浮液中培养第3天形成拟胚体，见图6a，第7天形成囊性拟胚体，见图6b。贴壁分化后3个胚层特异性标记物表达阳性，内胚层-AFP(alpha fetoprotein)、中胚层-心肌抗原(cardiac troponin)、外胚层图(nestin)，见图6。

图6 诱导性多能干细胞的体内外分化检测(免疫荧光染色，
标尺=50 μm)

Figure 6 Differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo (immunofluorescence staining: scale bar=50 μm)

体内分化潜能：诱导性多能干细胞接种到联合重症免疫缺陷小鼠腹股沟皮下6周左右，出现肿块；处死小鼠，摘除肿块，做病理切片染色分析可见3个胚层的组织，包括神经管样细胞(外胚层)、脂肪细胞(中胚层)以及肠腺上皮细胞(内胚层)，见图7。

图7 诱导性多能干细胞的体内外分化检测(苏木精-伊红染色，标尺=50 μm)

Figure 7 Differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo (hematoxylin-eosin staining; scale bar=50 μm)

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：2011年3至9月于广州医学院第三附属医院广东省产科重大疾病重点实验室与广东省高校生殖与遗传重点实验室完成。

材料：经捐助夫妇知情同意及广州医学院第三附属医院伦理委员会批准，取广州医学院第三附属医院产前诊断中心绒毛组织用于实验；293T细胞购于中国科学院广州生物医药和健康研究院。6周龄重症联合免疫缺陷小鼠购于南方医科大学，许可证号：SCXK(粤)：2010-0015。

方法：

绒毛细胞收集传代：无菌条件B超引导下抽取绒毛组织，用眼科剪将组织尽量剪碎，胶原酶Ⅳ37 ℃消化30 min。消化后，吸管吹打，1 000 r/min离心4 min，去上清，用AmnioMAX-TM-II(GIBCO)培养基重悬沉淀细胞，接种于提前用0.1%明胶处理的60 cm培养皿中，放于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱培养，3-9 d可见细胞长出，细胞汇合度达到70%-80%后，用0.05%胰酶消化传代，冷冻。

绒毛细胞的感染：用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染试剂盒将pMx-hOct4、hSox2、hKlf4、hc-Myc、绿色荧光蛋白及pCL包装质粒转染至293T细胞，于48 h和72 h后收集病毒液，在8 mg/L的polybrene条件下感染绒毛细胞。

诱导性多能干细胞的原代培养：感染后第7天，用0.05%胰酶消化被感染的细胞并计数，将2×10⁵个细胞接种到经丝裂霉素C处理的10 cm培养皿的小鼠胚胎成纤维细胞中，更换为诱导性多能干细胞培养液：knockout-Dulbecco (DMEM，Gibco，USA)添加15%血清替代物(SR，Gibco)，体积分数5%胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)，2 mmol/L谷氨酰胺(Gibco)，0.1 mmol/L β-巯基乙醇(Gibco)， 0.1 mmol/L非必需氨基酸(NEAAs，Gibco)，100 U/mL青霉素(Gibco)，100 mg/L链霉素(Gibco)，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)。挑选边界清晰、核仁明显集落状生长的细胞接种至新的小鼠胚胎成纤维细胞上。

诱导性多能干细胞的传代：37 ℃，体积分数5%CO₂培养至第四五天后，用自制的玻璃细针轻轻将细胞切割成两三块，转到新鲜制备的小鼠胚胎成纤维细胞上。在开始5代之内用机械切割法传代。第5代以后，用1 g/L胶原酶Ⅳ(Gibco，USA)消化传代，每天换液，每隔四五传代1次。

诱导性多能干细胞碱性磷酸酶检测：诱导性多能干细胞用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗3次，加入碱性磷酸酶孵育液(武汉博士德生物工程有限公司)，避光，室温孵育30 min，PBS冲洗1次，光镜下观察结果。

诱导性多能干细胞免疫荧光染色：诱导性多能干细胞用PBS洗2次，每次10 min；40 g/L的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次；体积分数0.2%Triton X 100室温作用30 min；0.3%-0.5%山羊血清封闭30 min；弃去血清，一抗(SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，NANOG，1∶100稀释)，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次10 min；二抗室温孵育一两个小时；PBS洗3次，每次10 min；1 g/mL Hoechst33342 复染细胞核，荧光显微镜下观察拍照。

绒毛细胞及诱导性多能干细胞多能性基因检测：Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA。20 μL PCR反应体系：1 μL cDNA样品，250 nmol/L引物，200 μmol/L dNTP，1 U Taq DNA酶；每个样品以GAPDH为内参。放至ABI PRISM 7500中检测。预变性：95 ℃，10 s；PCR反应95 ℃，60 ℃，34 s，反应结束后确认Real time PCR的扩增曲线与熔解曲线。

诱导性多能干细胞体外分化能力检测：1 g/L的胶原酶Ⅳ处理细胞吹散后，离心去上清，用诱导性多能干细胞拟胚体培养液中没有添加碱性成纤维生长因子)重悬，接种在Petri培养皿中。培养7 d后，将胚体转移到0.1%明胶包被的4孔板中继续培养，一两周后作免疫荧光染色。分别采用内胚层-AFP(alpha fetoprotein)、中胚层-心肌抗原(cardiac troponin)、外胚层(nestin)(1∶100稀释)鉴定胚体中三胚层来源细胞。

诱导性多能干细胞体内分化潜能的检测：1 g/L胶原酶Ⅳ处理细胞吹散后，将300-400个小克隆接种到6周龄重症联合免疫缺陷小鼠腹股沟皮下。4周后观察肿瘤生长，8周后处死小鼠，摘除肿块，用体积分数10%甲醛固定4-8 h，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，高倍镜下观察组织三胚层分化情况。

诱导性多能干细胞核型分析：细胞传代后，生长两三天，用0.25 mg/L秋水仙素处理3 h，消化细胞，1 000- 1 500 r/min离心8-10 min，弃上清收集细胞；加入0.4%枸橼酸钠与0.4%氯化钠(1∶1)的低渗液，用吸管吹打均匀，37 ℃水浴箱中静置5 min；然后用固定液(甲醇与冰醋酸为3∶1)固定3次；G带显色后，高倍镜下观察至少20个分裂中期细胞染色体。

主要观察指标：观察细胞重编程后的多能性，主要包括指标有碱性磷酸酶、免疫荧光染色、多能性基因、体外分化能力、体内分化潜能、核型。

讨论

自2006年诱导性多能干细胞已成为细胞生物学乃至生命科学领域最受关注的研究之。目前应用于诱导性多能干细胞研究的细胞有皮肤成纤维细胞、神经干细胞、角质细胞、血液细胞、羊水细胞、脐血干细胞等^[6-11]。不同组织体细胞诱导重编程的水平不同，形成诱导性多能干细胞的速度与效率也不同, 诱导性多能干细胞克隆出现的时间从15-30 d不等^[13-15]。诱导性多能干细胞因具有多能性特征，可以诱导分化为特定的细胞，包括神经细胞、造血细胞等^[16-17]。从尿液中提取细胞进行诱导性多能干细胞诱导的成功，使该项技术得到更广阔的应用^[18]。各种疾病模型的诱导性多能干细胞的建立，更为疾病机制的研究提供广阔的空间^[15^，^19]。

反转录病毒主要感染分裂期细胞，病毒包装的质量和感染时细胞培养的状态对细胞的重编程过程影响很大。实验中应选择汇合度约60%的293T细胞进行转染，密度太稀，转染试剂的细胞毒性易导致293T细胞大量死亡；如果密度太高，细胞增殖减慢会导致转染率降低。为保证细胞重编程的成功率，应选取前3代的处于生长指数期的绒毛细胞用于重编程实验，绒毛细胞接种的汇合度约为70%。研究指出，在培养基中添加Vitamin C可以显著提高诱导性多能干细胞的诱导效率^[20]。本实验建立产前诊断绒毛细胞来源的诱导性多能干细胞，经鉴定具有与正常人胚胎干细胞相同的多能性特征。

绒毛细胞诱导性多能干细胞的建立，为产前诊断遗传性疾病机制研究，诊断及个体化治疗方面提供了良好的工具^[21]。产前诊断中羊水细胞要到18周才能进行抽取检测培养，而绒毛细胞在第9周就可以抽取，比羊水细胞更早更容易获取；而相对于胎儿皮肤成纤维细胞，它不用对胎儿产生伤害，更具有安全性和可取性。用产前诊断绒毛细胞进行诱导，在时间上可以更早获得，从而减少了胎儿的细胞自体移植治疗的时间，因此其在应用前景中有不可替代的优势。诱导性多能干细胞具有分化成各个胚层细胞的能力，因此将其直接进行诱导分化后进行自体移植，可以减少移植所存在的排斥反映问题，为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源。

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延伸阅读

国内外同类研究比较：

已发表文献：国际心血管病杂志,2011.38(6):365-368。

主要观察指标：诱导性多能干细胞可以从各种不同动物的不同体细胞转化而来，它可以分化为心房肌、心室肌、血管以及传导系统的细胞。

结论：通过诱导性多能干细胞技术建立细胞模型可研究长QT综合征(LQTs)、Brugada综合征、致右室心律失常性心肌病(ARVC)等遗传性心脏病的发病机制。

已发表文献：实验与检验医学，2011.29(1):3-5。

主要观察指标：观察人诱导性多能干细胞向神经干细胞定向分化过程中相关microRNA的变化。

结论：在诱导性多能干细胞向神经干细胞定向分化的过程中，mir-34a、mir-9、mir-200b均明显增高，提示mir-34a、mir-9、mir-200b在诱导性多能干细胞向神经于细胞分化过程中起重要作用。

已发表文献：中国组织工程研究与临床康复。,2011.15(32): 205975-5978

主要观察指标：分离人胎儿真皮间充质干细胞,检测其全能性相关转录因子的表达。

结论：胎儿真皮间充质干细胞高表达Oct4和C-myc、中度表达Sox2，是形成诱导性多能干细胞较好的体细胞。

已发表文献：Human Molecular Genetics, 2012, 21(1):32–45

主要观察指标：建立特纳综合症，8号三体，13号三体等疾病iPS细胞的建立。

结论：建立多种疾病的诱导性多能干细胞具有多向分化的潜能，可以分化为神经细胞，肝细胞及心肌细胞。

拟发表文献：《中国组织工程研究》杂志。

主要观察指标：建立产前诊断绒毛细胞来源的诱导性多能干细胞。

结论：4种全能性基因转入绒毛细胞可获得具有多能性的诱导性多能干细胞，这为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源，为产前诊断疾病机制研究提供很好的细胞模型。

以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞

Generation of induced pluripotent stem cells from villus cells after induction by four kinds of genes during prenatal diagnosis

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