人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.010

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9174-9178.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.010

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人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

邢宏运¹^，²，卞铁荣³，刘霆¹，龚玉萍¹

¹四川大学华西医院血液内科，四川省成都市
610041；泸州医学院附属医院， ²血液内科，³医学分子实验中心，四川省泸州市

646000

收稿日期:2012-03-31 修回日期:2012-05-12 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-05-12
通讯作者: 龚玉萍，博士，教授，四川大学华西医院血液内科，四川省成都市 610041gongyuping@hotmail.com
作者简介:邢宏运☆，男，1974年生，陕西省合阳县人，汉族，2010年四川大学华西临床医学院毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞基础及临床的研究。xinghy52003@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金(30770912)；四川省科技厅社会公益项目(2008SZ0017)；教育部回国留学人员启动金(20071108-18-4)。

Differentiation of human embryonic stem cells HuES17 into hematopoietic stem cells

Xing Hong-yun^{1, 2}, Bian Tie-rong³, Liu Ting¹, Gong Yu-ping¹

¹Department of Hematology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ²Department of Hematology, ³Experiment Center of Molecular Medicine, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2012-03-31 Revised:2012-05-12 Online:2012-12-02 Published:2012-05-12
Contact: Gong Yu-ping, Doctor, Professor, Department of Hematology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China gongyuping@hotmail.com
About author:Xing Hong-yun☆, Doctor, Attending physician, Department of Hematology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Hematology, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China xinghy52003@yahoo.com.cn
Supported by:
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30770912*; Social Welfare Programs of Sichuan Provincial Science and Technology Department, No. 2008SZ0017*

摘要/Abstract

摘要：

背景：人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团，能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态，且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。
目的：进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。
方法：人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养，采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。
结果与结论：人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9) 二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化，很快死亡；可以观察到人胚胎干细胞分化，然而，随着OP9细胞死亡，分化的人胚胎干细胞亦死亡，不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化，或向造血干细胞分化的能力较低。

关键词: 人胚胎干细胞, 造血干细胞, 诱导分化, 包皮成纤维细胞, 骨髓基质细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Human embryonic stem cells are derived from inner cell mass of the human blastocyst. The human embryonic stem cells are capable of the unlimited proliferation and maintain the undifferentiated state in long-term culturing in vitro, and can be differentiated into all kinds of cell types of the human body organizations.
OBJECTIVE: To study the hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells HuES17 cell line.
METHODS: Human embryonic stem cells HuES17 were co-cultured with human foreskin fibroblast cells, and the human embryonic stem cells were induced to differentiate into hematopoietic stem cells by co-culturing with bone marrow stromal cells in mice (OP9 cells).
RESULTS AND CONCLUSION: When human embryonic stem cells co-cultured with OP9 cells for 5-6 days, the OP9 cells began to aging, and soon died; the differentiation of human embryonic stem cells could be observed. However, with the OP9 cells death, the differentiated human embryonic stem cells were also dead, and could not induce the human embryonic stem cells to differentiate into hematopoietic stem cells. Human embryonic stem cells HuES17 cells line showed little inclination to differentiate into hematopoietic stem cells, or may not be induced to differentiate into hematopoietic stem cells.

中图分类号:

R394.2

邢宏运，卞铁荣，刘霆，龚玉萍. 人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9174-9178.

Xing Hong-yun, Bian Tie-rong, Liu Ting, Gong Yu-ping. Differentiation of human embryonic stem cells HuES17 into hematopoietic stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9174-9178.

图/表（结果） 4

2.1 人包皮成纤维细胞生长形态人包皮成纤维细胞为贴壁生长型细胞，细胞呈长梭形或条带状，细胞质中央为卵圆形核，周边向外伸出纤维状伪足，见图1，细胞生长迅速，3-5 d细胞即铺满皿底。50 Gy放射源照射后，人包皮成纤维细胞失去有丝分裂活性。人胚胎干细胞传代前日复苏，三四个小时贴壁，人包皮成纤维细胞占皿底60%-80%时用作饲养层培养人胚胎干细胞效果最佳。传代后第2天即可见许多小集落，集落逐渐增大，中央逐渐隆起。人胚胎干细胞稳定增殖了4个月，传代20代。

Figure 1 Morphology of human foreskin fibroblast cells (×40)

图1 人包皮成纤维细胞形态(×40)

2.2 生长在人包皮成纤维细胞上未分化的人胚胎干细胞形态见图2。

生长在人包皮成纤维细胞上未分化的人胚胎干细胞呈典型集落状生长，集落形态呈扁平状。集落内细胞界限清楚、核大、核仁清晰，细胞核/细胞浆比例高。集落周边与 MFE饲养层界限清楚，无分化迹象。一般四五天后饲养层上即可布满大量的集落，此时需传代培养。

传代后第2天即可见许多小集落，集落逐渐增大，中央逐渐隆起。人胚胎干细胞稳定增殖了4个月，传代20代。

Figure 2 Morphology of the undifferentiated human embryonic stem cells (×40)

图2 未分化的人胚胎干细胞形态(×40)

2.3　OP9细胞生长形态 OP9细胞贴壁生长，细胞呈三角形或长梭形，细胞质偏向一侧为圆形核，周边向外伸出纤维状伪足，见图3，细胞生长迅速，3-5 d细胞即铺满皿底。

Figure 3 Morphology of bone marrow stromal cells in mice (OP9 cells)(×40)

图3 小鼠骨髓基质细胞，OP9细胞形态(×40)

2.4 人胚胎干细胞同OP9细胞共培养结果见图4。

人胚胎干细胞接种到预先铺好OP9细胞的6孔板中，培养24 h后可以看到小的人胚胎干细胞细胞集落生长，培养48 h后看到集落逐渐长大，培养72 h后发现共培养的OP9细胞状态变差，人胚胎干细胞集落继续长大，中间出现分化的细胞，周围为一圈隆起的细胞团包绕。培养96 h后人胚胎干细胞集落继续长大，OP9细胞状态更差，胞质中出现许多黑色沉淀物。培养120 h后发现，OP9细胞已经死亡，人胚胎干细胞集落中间出现细胞死亡脱落。培养144 h后细胞全部死亡，分化集落的细胞大部分脱落。经过反复多次实验，均获得相同结果。

Figure 4 Human embryonic stem cells (hESCs) differentiated into hematopoietic stem cells by co-culturing with OP9 cells 图4 人胚胎干细胞同OP9细胞共培养造血干细胞分化图

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2008年1月至2009年12月，在四川大学华西临床医学院、生物治疗国家重点实验室(干细胞生物学研究室)完成。

材料：

细胞：HuES-17人胚胎干细胞，美国哈佛大学HUES Cell Facility / Melton 实验室馈赠，由美国哈佛大学Dr. Douglas. Melton教授建立[3]，符合美国国立卫生研究院(NIH)的标准，并得到国际公认。

人包皮成纤维细胞：由中国科学院上海生命科学院健康科学研究所李春亮博士馈赠。

小鼠骨髓基质OP9细胞：购自美国ATCC (American type culture collection，ATCC)。

试剂和培养基：

人胚胎干细胞培养基：80% KnockOut DMEM，20% KnockOut血清替代品及2 mmo/L 左旋谷氨酰胺，0.1 mmol/L β2巯基乙醇，1%非必需氨基酸，4 μg/L重组人类碱性成纤维细胞生长因子；人包皮成纤维细胞培养基：90%高糖型DMEM，体积分数10%胎牛血清， 2 mmo/L左旋谷氨酰胺，0.1 mmol/L β2巯基乙醇，1%非必需氨基酸；小鼠骨髓基质OP9细胞培养基：α-MEM培养基，体积分数20%胎牛血清(未灭活)(购自HYCLONE公司)；OP9细胞诱导胚胎干细胞分化培养基：α-MEM培养基，体积分数10%胎牛血清(未灭活)，100 μmol/L硫代甘油(MTG)。1 g/L Ⅳ型胶原酶、2.5 g/L胰酶、0.1%明胶。以上试剂除胎牛血清外，均购自invitrogen公司。

实验方法：

人成纤维细胞的培养和饲养层的制备：人成纤维细胞按照常规细胞培养，每3-5 d传代，待扩增至足够数量细胞后，采用2.5 g/L胰酶消化后，收集细胞。

取5代内的人包皮成纤维细胞作为饲养层细胞，使用50 Gy射线灭活，冻存于液氮中备用。使用前1 d将灭活的人包皮成纤维细胞以1.5×108 L-1浓度接种到预铺了明胶的6孔培养板中，临用前换液。

OP9细胞的培养：OP9细胞的按照常规细胞培养方法培养，每3-5 d传代，取22代以内的OP9细胞，冻存于液氮中备用。使用前1 d将冻存的OP9细胞，以1.5×108 L-1浓度接种到预铺了明胶的6孔培养板中，临用前换OP9细胞诱导胚胎干细胞分化培养液。

人胚胎干细胞的培养：前1 d将灭活的人包皮成纤维细胞以1.5×108 L-1的浓度接种到预铺了明胶的 6 孔培养板中备用。传代后5-7 d的人胚胎干细胞加入1 g/L Ⅳ型胶原酶，37 ℃孵育30 min，用5 mL一次性移液管轻轻将人胚胎干细胞刮下，自然沉淀5 min，去掉上清，加入2 mL新鲜人胚胎干细胞细胞培养液重悬，加入已铺好人包皮成纤维细胞的6孔板培养，48 h后换液。

人胚胎干细胞的诱导分化：参照Vodyanik等[4]及NSCB(National Stem Cell Bank，NSCB)的方案，使用前1 d将冻存的OP9细胞，以1.5×108 L-1细胞浓度接种到，预铺了明胶的 6 孔培养板中，第2天按照人胚胎干细胞传代的方法，300×g ×5 min离心，倒掉上清液，用新鲜的OP9细胞诱导胚胎干细胞分化培养液2 mL重悬后，接种于已经预先有OP9细胞的6孔板中，放入37 ℃孵箱培养。

人胚胎干细胞的诱导分化结果分析：光学显微镜观察人胚胎干细胞克隆在发育分化过程中组织结构发展的形态学变化，第1-14天；第8天原位免疫荧光染色定位造血/血管内皮系统特异谱系抗原在分化过程中表达及位置分布；第10天流式细胞仪检测细胞造血/血管内皮特异谱系抗原的表达如CD34、CD45及抗原之间的关系。甲基纤维素半固体培养造血细胞集落形成。

主要观察指标：①人包皮成纤维细胞生长形态。②生长在人包皮成纤维细胞上未分化的人胚胎干细胞形态。③OP9细胞生长形态。④人胚胎干细胞同OP9细胞共培养结果。

讨论

人胚胎干细胞属于全能干细胞，具有自我更新及自由分化的的能力，具有向各种组织及细胞分化的能力。最近人胚胎干细胞向造血分化的能力已经被证实：首先使人胚胎干细胞形成拟胚体，紧接着同S17骨髓基质细胞共培养，胚胎干细胞能分化成具有血液血管干细胞性质的内皮细胞和集落形成细胞^[5-8]。但是在形成拟胚体的过程中需要加入多种细胞因子和骨形态发生蛋白4^[7]。利用OP9细胞同鼠或人胚胎干细胞共培养，也已经被证明能够诱导胚胎干细胞分化成造血祖细胞，而且这种方法具有两个很重要的优势：分化所需的时间短，仅需八九天；分化过程中无需添加细胞因子，即可产生能够用磁珠分选的大量的CD34⁺细胞。故本实验采用人胚胎干细胞细胞HUES-17同OP9细胞共培养的方法诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化，实验试剂、材料及方法完全按照Vodyanik等^[4]的方法及参考WICELL提供的方案。实验结果证明人胚胎干细胞同OP9细胞共培养约 3 d后，OP9细胞就出现明显老化，细胞内颗粒增多，细胞轮廓逐渐消失，约5 d全部死亡，进而导致分化的人胚胎干细胞死亡。反复多次实验，均无法使OP9细胞维持人胚胎干细胞造血分化超过5 d，无法分化成功造血干细胞。

究其原因，推测不同的胚胎干细胞其分化能力及分化趋势可能是不同的，国内研究报道显示^[9-11]：自发造血分化或相同条件下造血诱导分化，不同的人胚胎干细胞造血分化潜能明显不同；在自发向造血细胞分化的过程中，经历了3个阶段：人胚胎干细胞向胚层特异性细胞分化(前6-8 d)，造血干祖细胞扩增期(第8-12天)，成熟血细胞大量出现期(第15天以后)，且鼠胚胎干细胞造血分化同人胚胎干细胞相时间相似。国外学者比较了哈佛大学所建立的17(HUES1-17)株人胚胎干细胞自然分化及定向诱导分化的能力，结果发现不同的胚胎干细胞株其分化能力及分化趋势有很大差别，甚至达到100倍的差距，其中HUES17细胞株具有向脂肪组织和肝脏细胞分化的优势^[12]，而本结果证明HUES17细胞株向造血细胞分化的能力非常弱，与其研究结果一致。Chang等^[13]学者比较了NIH认证的H1，hSF6，BG01， BG02和BG03五种细胞株造血分化能力，结果发现H1和BG02细胞株具有较高的造血分化倾向，其余3株胚胎干细胞均分化失败，结果同本实验结果。其潜在的原因可能与胚胎干细胞细胞株固有的特性相关，而与细胞代数及核型的不同无关。Melichar等^[14]研究对于HuES8、HuES14、HuES15、H1、H9和HSF-8五株人胚胎干细胞造血分化能力对比研究以显示不同胚胎干细胞株之间存在明显差异；甚至人胚胎干细胞同诱导的多能干细胞及其之间造血分化能力也有很大差别^[15-16]。

因此，人胚胎干细胞造血分化的能力取决于细胞固有的内在特性，将人胚胎干细胞应用于临床前，鉴定其固有的造血分化特性及影响造血分化的外源性因素是非常重要的。

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

Differentiation of human embryonic stem cells HuES17 into hematopoietic stem cells

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