人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.011

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9179-9185.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.011

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人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制

梁硕¹^，²，焦红亮³，迟连凯¹，史辛艺¹，梁阿铭³，田毅³，韩娇玲¹，马姗姗¹，杨波³，关方霞¹^，⁴

¹郑州大学生物工程系，河南省郑州市 450001；²河南科技大学第一附属医院生物治疗中心，河南省洛阳市 471003； ³郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052；⁴河南省医学科学院，河南省郑州市 450003

收稿日期:2012-03-13 修回日期:2012-05-21 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-05-21
通讯作者: 关方霞，博士，教授，博士生导师，郑州大学生物工程系，河南省郑州市450001；河南省医学科学院，河南省郑州市450003 guanfangxia@126.com
作者简介:梁硕★，女，1986年生，河南省洛阳市人，汉族，郑州大学生物工程系毕业，硕士，现在河南科技大学第一附属医院生物治疗中心工作，主要从事间充质干细胞和肿瘤方面的研究。shuoguo005@126.com

Human umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit glioma growth

Liang Shuo^{1, 2}, Jiao Hong-liang ³, Chi Lian-kai¹, Shi Xin-yi¹, Liang A-ming³, Tian Yi³, Han Jiao-ling¹,
Ma Shan-shan¹, Yang Bo³, Guan Fang-xia^{1, 4}

¹Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China; ²Biotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan Province, China; ³Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China; ⁴Henan Academy of Medical Sciences, Zhengzhou 450003, Henan Province, China

Received:2012-03-13 Revised:2012-05-21 Online:2012-12-02 Published:2012-05-21
Contact: Guan Fang-xia, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001
About author:Liang Shuo★, Master, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China; Biotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan Province, China shuoguo005@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：关于亚低温运用到神经损伤修复领域的研究已有一些报道，但亚低温对神经干细胞在脑内移植迁移的影响还不太清楚。

目的：观察亚低温对移植入脑缺血大鼠侧脑室的骨髓间充质干细胞迁移及脑梗死体积的影响。

方法：采用Longa法永久性闭塞SD大鼠大脑中动脉制作局灶性脑缺血损伤模型，50只大鼠随机摸球法分为亚低温组、对照组、假手术组。亚低温组于移植前应用亚低温处理大鼠急性脑缺血损伤，对照组于移植前应用常温处理大鼠急性脑缺血损伤；假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈内总动脉。亚低温组和对照组在造模后24 h，在脑立体定向下经侧脑室注射移植用5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞。经过5，14，21 d后用免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织BrdU阳性细胞数。

结果与结论：骨髓间充质干细胞移植第14天多数标记的骨髓间充质干细胞已经迁移至梗死灶周围，移植后亚低温组各时间点梗死灶周边皮质的BrdU阳性细胞数明显多于对照组(P < 0.05)。与对照组比较，亚低温组在移植前后各个时间点脑梗死体积均显著减小(P < 0.05)。提示移植前宿主亚低温处理可以促进骨髓间充质细胞的定向迁移，且脑梗死体积显著减小。

关键词: 人脐带, 间充质干细胞, 胶质瘤, 抑制, Dickkopf-1, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Wnt signaling pathway is a key to occurrence and development of tumor. Several studies have demonstrated that Dickkopf-1 can block intracellular Wnt signalling transmission.

OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effect and underlying mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells on C6 glioma growth by a co-culture system in vitro.

METHODS: C6 glioma cells were cultured with human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium under different concentrations. Cell Counting Kit-8 and ?ow cytometry analysis were performed to investigate cell proliferation and cell cycle status. Western blotting was used to detect the expression of β-catenin and c-Myc in C6 cells treated with human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium. Enzyme-linked immunosorbent assay was adopted to examine the level of Dickkopf-1 secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells. Dickkopf-1 in human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium was neutralized by anti-Dickkopf-1 antibody. The effects of antibody neutralization were also determined by the above methods.

RESULTS AND CONCLUSION: Human umbilical cord mesenchymal stem cells could inhibit C6 cell expansion and arrest the cell cycle in G0-G1 phase. The expression levels of β-catenin and c-Myc were down-regulated in C6 cells after treatment with human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium. The levels of secreted protein Dickkopf-1 were positively correlated with concentrations of human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium. The inhibitory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on C6 cell proliferation was enhanced as the concentration of Dickkopf-1 in human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium increased. When Dickkopf-1wasneutralized by anti-Dickkopf-1 antibody, the suppressing effect was attenuated. It demonstrated that human umbilical cord mesenchymal stem cells could inhibit glioma cell growth via secreting the soluble factors, such as Dickkopf-1.

中图分类号:

R394.2

梁硕，焦红亮，迟连凯，史辛艺，梁阿铭，田毅，韩娇玲，马姗姗，杨波，关方霞，. 人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9179-9185.

Liang Shuo, Jiao Hong-liang,Chi Lian-kai, Shi Xin-yi, Liang A-ming, Tian Yi, Han Jiao-ling, . Human umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit glioma growth[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9179-9185.

图/表（结果） 6

2.1 hUC-MSCs的培养和扩增结果组织块贴壁5 d后可见到单个的梭形或三角形的贴壁细胞，细胞围绕着组织块逐渐繁殖呈射线状，2周后贴壁细胞形成典型的成纤维样细胞，并达到80%-90%融合时收获，见图1a。细胞传代后形态多为梭形或三角形，见图1b，c。随着培养时间的增长，细胞由松散变为密集，细胞形态也变为均一的纺锤体形，呈平行排列生长或旋涡状生长，见图1d。

Figure 1 Growth morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells

图1 人脐带间充质干细胞的生长形态

hUC-MSCs免疫表型鉴定流式分析显示第4代 hUC-MSCs 高表达CD29和CD44；低表达HLA-ABC；不表达CD34、CD45和HLA-DR。
2.3 hUC-MSCs抑制C6细胞增殖的时效性为了确定hUC-MSCs诱导的胶质瘤细胞增殖抑制效应是由可溶性因子引起的，采用CCK-8法检测分别培养在浓度为25%，50%和100% hUCMSCs-CM中C6细胞的增殖情况。结果发现，hUCMSCs-CM对C6细胞增殖的抑制表现出浓度依赖性，48 h时有明显的抑制作用，72 h时达到最佳抑制效果，见图2。

Figure 2 The inhibitory effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on C6 cell proliferation. Results are shown as the mean inhibitory rate ± SD of three independent experiments

图 2 人脐带间充质干细胞对 C6细胞增殖的抑制效应

2.4 hUC-MSCs对C6细胞周期的效应为了明确hUCMSCs-CM中可溶性因子对胶质瘤细胞周期的作用，本文使用流式细胞仪检测了不同浓度条件培养液作用下C6的细胞周期。与对照组相比，25%CM组、50%CM组和100%CM组的C6细胞在G0/G1期的百分比由55.24%分别增加到60.49%、67.21%和71.17%，同时伴随着S期百分比的减少，见图3。随着条件培养液浓度的增加，G0/G1期的百分比逐渐上升，而S期的百分比逐渐下降。尽管这个过程中G2-M期百分比有减小的趋势，但变化较小。结果说明hUC-MSCs分泌的可溶性因子能够抑制胶质瘤的生长，将细胞周期阻滞在G0/G1期。

Figure 3 Effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium (CM) on the cell cycle distribution of C6 cells. The results were the means (±SD) of three independent experiments

图3 人脐带间充质干细胞对C6细胞周期的效应

2.5 hUC-MSCs对C6细胞Wnt/β-连环蛋白信号通路蛋白表达的影响 Wnt/β-连环蛋白信号转导途径在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用[19-20]。Western blotting结果显示，在hUC-MSCs条件培养液作用下，C6细胞中β-连环蛋白和c-Myc蛋白表达水平下调，见图 4。尽管25%CM组β-连环蛋白和c-Myc表达水平有减小的趋势，但与对照组相比没有明显的变化。然而，随着条件培养液浓度的增加，50%和100% CM组中β-连环蛋白和c-Myc蛋白表达明显下降。因此，结果说明，hUC-MSCs条件培养液中的一些可溶性因子可能参与了抑制C6细胞中Wnt信号途径的过程。

Figure 4 Effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells-conditioned media on Wnt signaling of C6 cells in vitro

图4 人脐带间充质干细胞条件培养液体外作用于C6细胞

对Wnt信号的影响

2.6 ELISA结果现已证明，骨髓间充质干细胞分泌的Dickkopf-1分子对肿瘤细胞具有抑制作用[25]。而不同间充质干细胞分泌Dickkopf-1因子的含量并不相同，所以作者应用ELISA试剂盒检测了hUC-MSCs不同浓度条件培养液中Dickkopf-1的分泌水平，并分析对照组与25%、50%和100%条件培养液组中分泌蛋白Dickkopf-1的水平差异，见图5。

Figure 5 Detection of Dickkopf-1 secretion in different concentrations of human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium (CM) by ELISA assay

图 5 ELISA检测不同浓度条件培养液中Dickkopf-1的分泌水平

结果显示，Dickkopf-1蛋白的分泌水平与hUC-MSCs条件培养液的浓度呈正相关。随着条件培养液浓度的增加，Dickkopf-1的分泌量逐渐增多。 2.7 抗体中和效应见图6。为了进一步证实Dickkopf-1是间充质干细胞抑制细胞增殖的一个关键因子，实验使用了抗Dickkopf-1的抗体来中和hUCMSCs-CM，然后用于处理C6细胞。结果发现，用兔抗人Dickkopf-1多克隆抗体预处理的hUCMSCs-CM失去了下调C6细胞中β-连环蛋白和 c-Myc表达水平的能力，见图6A。同时，CCK-8结果显示，Dickkopf-1中和部分地减弱了hUCMSCs-CM抑制C6细胞增殖的能力，见图6B。流式细胞仪结果显示用hUCMSCs-CM处理的C6细胞在G0/G1期的百分比由54.37%增加到66.48%，见图6C。然而，当Dickkopf-1的活性被抗Dickkopf-1的抗体部分中和后，C6细胞在G0/G1期的百分比由66.48%减少到60.06%，见图6C。这些数据说明，Dickkopf-1的中和作用部分地减弱了hUCMSCs-CM对C6细胞生长的抑制作用，提示了hUCMSCs-CM中的Dickkopf-1具有抑制C6细胞生长的作用。

Figure 6 Effects of Dicckopf-1 antibody neutralized human umbilical cord mesenchymal stem cells

图6 Dickkopf-1的抗体中和后对C6胶质瘤细胞的作用

参考文献

[1] Donato V, Papaleo A, Castrichino A, et al. Prognostic implication of clinical and pathologic features in patients with glioblastoma multiforme treated with concomitant radiation plus temozolomide. Tumori. 2007;93(3):248-256.

[2] Kang SG, Kim JH, Nam DH,et al. Clinical and radiological prognostic factors of anaplastic oligodendroglioma treated by combined therapy. Neurol Med Chir (Tokyo). 2005; 45(5): 232-238.

[3] Scheda A, Finjap JK, Tuettenberg J, et al. Ef?cacy of different regimens of adjuvant radiochemotherapy for treatment of glioblastoma. Tumori.2007; 93(1):31-36.

[4] Fagioli F, Berger M, Braeh del Preyer A, et al.Regression of metastatic oateosmcoma following non-myeloab]ative stem cell transplantation.Haenmtologiea. 2003; 88(5):16.

[5] Omuro Y, Matsumote G, Sasaki T, et al.Regression of nunresectable pancreatic tumor following nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation.Bone Marrow Transplant.2003; 31(10):943-945.

[6] Kim S K, Cargioll TG, Machluf Mt, et al.PEX-Producing human neural stem cells inhibit tumor growth in a mouse g1ioma model．Clin Cancer Res. 2005; 11(16):5965-5970.

[7] Khakoo AY, Pati S, Anderson SA, et al. Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi’s sarcoma.J Exp Med.2006; 203(5):1235-1247.

[8] Jiao HL, Guan FX, Yang B,et al. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells inhibit C6 glioma via downregulation of cyclin D1. Neurology India.2011; 59(2): 241-247.

[9] Yang F, Zeng Q, Yu G,et al．Wnt/beta-catenin signaling inhibits death receptor-mediated apoptosis and promotes invasive growth of HNSCC. Cell Signal.2006; 18(2):679-687.

[10] Baek SH, Kioussi C, Briata P. Regulated subset of G1 growth-control genes in response to derepression by the Wnt pathway. Proc Natl Acad USA.2003;100(6): 3245-3250.

[11] Brott BK, Sokol SY. Regulation of Wnt/LRP signaling by distinct domains of Dickkopf proteins. Mol Cell Biol.2002; 22(17):6100-6110.

[12] Chen G, Shukeir N, Potti A, et al. Up-regulation of Wnt-1 and beta-catenin production in patients with advanced metastatic prostate carcinoma: potential pathogenetic and prognosticimplications. Cancer. 2004; 101(6):1345-1356.

[13] Byun T, Karimi M, Marsh JL, et al. Expression of secreted Wnt antagonists in gastrointestinal tissues: potential role in stem cell homeostasis. J Clin Pathol. 2005; 58(5):515-519.

[14] Mao B, Wu W, Li Y, et al. LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins. Nature.2001; 411(6835): 321-325.

[15] Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E, et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. Stem Cells.2007; 25(2) :319-331.

[16] Livraghi T, Meloni F, Frosi A, et al. Treatment with stem cell differentiation stage factors of intermediate-advanced hepatocellular carcinoma. Oncol Res. 2005;15(7/8):399-408.

[17] Lu YR, Yuan Y, Wang XJ,et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther. 2008; 7(2):245-251.

[18] Qiao L, Xu ZL, Zhao TJ,et al. Dkk-1 secreted by mesenchymal stem cells inhibits growth of breast cancer cells via depression of Wnt signaling. Cancer Lett. 2008; 269(1): 67-77.

[19] Moon RT, Kohn AD, De Ferrari GV,et al. Wnt and β-catenin signalling: diseases and therapies.Nat Rev Genet. 2004; 5(9): 691-701.

[20] Fodde R, Brabletz T. Wnt/beta-catenin signaling in cancer stemness and malignant behavior. Curr Opin Cell Biol. 2007; 19(2):150-158.

[21] Glennie S, Soeiro I, Dyson PJ,et al. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells. Blood. 2005; 105(7): 2821-2827.

[22] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. Blood. 2006; 107(1): 367-372.

[23] Sotiropoulou PA, Perez SA, Gritzapis AD,et al. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells. Stem Cells.2006; 24(1): 74-85.

[24] Zhu Y, Sun Z, Han Q, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 2009; 23(5):925-933.

[25] Meisel R, Zibert A, Laryea M,et al. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2, 3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation. Blood.2004; 103(12): 4619-4621.

[26] Qiao L, Xu ZL, Zhao TJ, et al. Suppression of tumorigenesis by human mesenchymal stem cells in a hepatoma model. Cell Res. 2008;18(12): 500-507.

[27] Ramasamy R, Lam EF, Soeiro I, et al. Mesenchymal stem cells inhibit proliferation and apoptosis of tumor cells: impact on in vivo tumor growth. Leukemia.2007; 21(2):304–310.

[28] Zhu W, Xu W, Jiang R, et al. Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo. Exp Mol Pathol.2006; 80(3): 267-274.

[29] Ma Y, Hao XM, Zhang S,et al. The in vitro and in vivo effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the growth of breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat.2011; 80(1): 267-274.

[30] Studeny M, Marini FC, Dembinski JL.Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents, J. Natl. Cancer Inst.2004; 96 (21):1593–1603.

引言

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，约占脑肿瘤半数以上，具有高复发率和高死亡率的特点。临床主要治疗方法是手术，辅加放疗和化疗，但疗效欠佳[1-3]。近年来，干细胞在肿瘤研究领域受到了极大关注。研究表明，干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性[4-5]，如神经干细胞可发生迁移，并靶向杀伤肿瘤细胞，抑制小鼠神经胶质瘤的生长[6]。间充质干细胞可以向Kaposi’s肉瘤定向移动并抑制其生长[7]。人脐血间充质干细胞能够减少裸鼠体内周期素D1蛋白的表达，抑制胶质瘤的生长[8]，表明间充质干细胞具有抑制肿瘤细胞生长的作用。

Wnt信号通路是决定肿瘤发生发展的关键通路，它在肿瘤细胞的生长、迁移、凋亡及转化过程中发挥着重要作用[9-10]。Wnt 信号通路的异常激活可导致肿瘤发生，而Wnt信号途径异常的核心机制是游离的β-连环蛋白在细胞内积累并进入细胞核与T细胞因子/淋巴样增强因子1形成复合体，能特异性地结合靶基因 c-Myc、Bcl-2和Survivin等的启动子，最终引发特异靶基因的表达[11-12]。Wnt通路的经典途径是Wnt/β-连环蛋白途径，非经典途径包括细胞极性途径及Ca离子振荡途径。Wnt拮抗剂包括分泌型卷曲蛋白相关蛋白、Wnt 抑制因子1、Dickkopf蛋白[13-14]，其中分泌型卷曲蛋白相关蛋白、Wnt抑制因子1与FZD家族受体结合，Dkk家族与LRP受体结合。而经典Wnt信号受体包括FZD家族及LRP受体，非经典Wnt信号受体包括FZD家族。因此，分泌型卷曲蛋白相关蛋白、Wnt 抑制因子1既可以抑制经典途径，又可以抑制非经典途径，而Dkk家族只能抑制经典途径。Dickkopf-1是一种分泌蛋白，与Wnt受体LRP5/6及穿膜蛋白Kremen1/2结合形成三聚体，诱导快速的细胞内吞，减少了细胞膜上的LRP5/6，由此阻断了Wnt信号向胞内的传递。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)作为一种新型的干细胞，具有组织来源可靠，增殖速度快，传代稳定及高度的可塑性等优点，是细胞移植和组织工程种子细胞的理想材料[15]。研究发现，间充质干细胞能分泌Dickkopf-1等可溶性细胞因子[16]。根据这一特性，实验将通过间接共培养体外观察hUC-MSCs条件培养液(hUCMSCs- conditioned medium，hUCMSCs-CM)对C6细胞生长抑制的时效性，采用Wnt信号通路的主要拮抗剂Dickkopf-1的抗体中和后，分析C6细胞生长、细胞周期、β-连环蛋白及其下游靶基因c-Myc的表达变化，拟探讨hUC-MSCs对胶质瘤生长的抑制作用及其相关机制，以期为临床应用和基础研究提供相关依据。

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2010年6月至2011年12月在郑州大学第一附属医学院和生物工程系完成。

材料：正常剖宫产的健康产妇志愿捐献的胎盘10份，孕38周，检测乙肝5项、HCV、HIV、梅毒等其他相关传染性指标均呈阴性，均来自郑州大学第一附属医院妇产科。C6细胞为本实验室储备。

实验方法：

C6细胞的培养：将C6细胞置于含1%青/链霉素和体积分数10%FBS的DF-12培养基中，在37 ℃、体积分数5% CO₂饱和湿度培养箱中培养，选择处于对数生长期的细胞消化后重悬备用。细胞贴壁生长良好，平均每2至3 d传代1次。

hUC-MSCs的分离、培养和鉴定：无菌条件下取脐带标本，剥离脐动脉和脐静脉之后，分离出沃顿胶Wharton’s jelly，PBS充分冲洗，并将其剪碎至1.0-2.0 mm³大小的组织块，接种于含5 mL完全培养基(含有10 μg/L的bFGF、1%青/链霉素和体积分数为10% FBS的DMEM/F12)的T25培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂的饱和湿度培养箱中卧式培养。每隔两三天更换完全培养基，当细胞长满瓶壁80%-90%时，胰酶消化离心后用培养基制成单细胞悬液，按适当密度传代培养。选用第4代的hUC-MSCs，用于流式细胞仪分析hUC-MSCs的特异性表面标记。

收集hUC-MSCs条件培养液：当脐带间充质干细胞生长至80%-90%融合时，取培养上清，在室温下离心 2 500 r/min，15 min，离心后取上清，经0.22 μm滤膜过滤除菌，保存于-80 ℃冻存备用，作为hUCMSCs-CM。该培养液用DF-12来稀释，然后用于培养C6细胞。

CCK-8检测细胞增殖：C6细胞长满时，胰酶消化收获细胞，按每孔2×10³个细胞接种于 96 孔板培养。待细胞贴壁后，分别换上浓度为25%，50%和100%的 hUCMSCs-CM，对照组为含体积分数2%FBS的DF-12。分别在培养24，48，72，96 h后检测，每个浓度测5个复孔。测定前避光下每孔加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育2 h，使用多功能酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值(A)。

流式细胞仪检测细胞周期：将C6细胞以每孔2×10⁵个接种于6孔板培养，待细胞贴壁后，分别换上浓度为25%、50%和100%的hUCMSCs-CM，对照组为含体积分数 2% FBS的DF-12。作用48 h后，分别取1×10⁹ L^{-1细胞，预冷PBS洗涤2次，70%冰乙醇4 ℃过夜固定，800 r/min离心5 min弃乙醇，PBS洗涤2次，加入 0.5 mL碘化丙啶染色液，于37 ℃作用30 min后，上流式细胞仪检测，采用 ModFit 软件对细胞周期各期细胞的百分比进行分析。} C6

Western Blotting检测β-连环蛋白和c-Myc的表达水平：将不同浓度的hUCMSCs-CM作用于C6细胞48 h后，收集细胞，用预冷的PBS洗2次，加入适量的蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解细胞30 min。之后，4 ℃离心12 000 r/min 10 min，取上清测定蛋白浓度，保存于-80 ℃。样品蛋白进行SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。之后分别加入一抗(β-连环蛋白、c-Myc单克隆抗体和β-actin抗体)，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入二抗(辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠二抗)于室温下孵育1 h，洗膜3次后，通过ECL发光进行曝光，最后显影定影。

ELISA法检测不同浓度条件培养液中Dickkopf-1的表达量：用无血清的DF-12培养基将hUCMSCs-CM上清分别稀释成25%，50%，100%的条件培养液，而无血清DF-12作为空白对照。应用ELISA双抗体夹心法分别检测不同浓度的hUCMSCs-CM中Dickkopf-1的分泌量，采用ELISA 试剂盒参照产品说明书进行检测。

抗体中和实验：在hUCMSCs-CM中，实验组加入 100 μg/L的兔抗人Dickkopf-1多克隆抗体，对照组加入100 μg/L的正常兔IgG，4 ℃温育过夜，用于中和Dickkopf-1蛋白^[18]。将中和后的条件培养液作用于C6细胞，持续作用48 h。之后，采用Western Blotting检测β-连环蛋白及靶基因c-Myc的表达，应用CCK-8法和流式细胞仪分析对细胞生长的影响，方法同前。

主要观察指标：①hUC-MSCs的培养和扩增结果。②hUC-MSCs免疫表型鉴定结果。③hUC-MSCs抑制C6细胞增殖的时效性。④hUC-MSCs对C6细胞周期的效应。⑤hUC-MSCs对C6细胞Wnt/β-连环蛋白信号通路蛋白表达的影响。⑥ELISA结果。⑦抗体中和效应。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验结果用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

尽管已证实间充质干细胞能够抑制激活的T淋巴细胞和肿瘤细胞的生长，但是潜在的机制尚未完全阐明^[21-23]。证据显示，来源于骨髓和脂肪组织的人间充质干细胞能够阻滞肿瘤细胞的生长^{[18, 24]}。作者前期也发现人脐带间充质干细胞具有抑制肿瘤细胞生长的作用。

人间充质干细胞抑制肿瘤细胞的生长可能是通过细胞与细胞的直接接触或分泌的多种可溶性因子而起作用的。有研究表明，人间充质干细胞诱导的免疫抑制和抗肿瘤发生作用是由其释放的可溶性因子介导的^[25-26]，故在本实验中作者重点观察人脐带间充质干细胞条件培养液对C6细胞的抑制作用，并探讨了其分泌的细胞因子Dickkopf-1在其中的作用机制。实验选取第3-5代的人脐带间充质干细胞收集培养上清，且每一批次实验都选取同一代细胞分泌的培养上清，经过过滤除菌后配制不同浓度的条件培养液用于培养C6细胞，保证每一批次实验的均一性。首先证明了人脐带间充质干细胞条件培养液能够抑制C6细胞的生长，并确定了与人骨髓和脂肪间充质干细胞的作用方式一样^[27-29]，人脐带间充质干细胞是通过分泌的Dickkopf-1因子阻滞Wnt信号通路完成抑制作用的。实验结果证实人脐带间充质干细胞能够抑制C6胶质瘤细胞的生长，这与一些研究结果相一致^[7^，^17]，然而也有报道发现间充质干细胞能够回归小鼠实体瘤位点，并增强肿瘤的生长^[30]。间充质干细胞对肿瘤细胞的效应可能与其的作用数量直接相关^[17]。这些造成结果明显差异的原因需要进一步研究。

胶质瘤的发生和发展是多种肿瘤相关基因表达失常所致，而Wnt信号转导途径是由一系列癌基因和抑癌基因编码的蛋白质组成，各种蛋白质之间彼此联系、相互制约，在细胞增殖、分化、运动、黏附等过程中起着重要调节作用^[19-20]。实验结果说明，人脐带间充质干细胞条件培养液能以浓度依赖性的方式抑制C6胶质瘤细胞的生长，并能将细胞周期阻滞在G₀/G₁期(见图2和3)。为了探索人脐带间充质干细胞抑制胶质瘤细胞生长的分子机制，作者认为Wnt信号参与该过程。Western blotting结果发现，人脐带间充质干细胞条件培养液下调了C6细胞中β-连环蛋白及其下游靶基因c-Myc的表达水平(见图4)，说明人脐带间充质干细胞条件培养液中可溶性因子能够封闭C6细胞Wnt信号通路的正常运转，也是抑制C6细胞Wnt信号途径的重要原因。

Dickkopf-1是Wnt信号通路中一个重要的调节因子^{[19–20，25]}，目前已发现在乳腺癌、肝母细胞瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达上调。实验用ELISA法检测了人脐带间充质干细胞条件培养液中Dickkopf-1的水平，结果显示Dickkopf-1蛋白的分泌水平与hUC-MSCs条件培养液的浓度呈正相关(见图5)。为了进一步证实人脐带间充质干细胞中Dickkopf-1能够抑制C6细胞Wnt信号途径，按照如下方法调节了Dickkopf-1的水平。使用抗Dickkopf-1的多克隆抗体中和了人脐带间充质干细胞条件培养液中的Dickkopf-1，发现处理过的的条件培养液失去了下调C6细胞中β-连环蛋白和c-Myc表达水平的能力(见图6A)。CCK-8法和流式细胞仪分析显示，抗体中和作用减弱了人脐带间充质干细胞条件培养液对C6细胞生长的抑制作用(见图6B和C)。这为人脐带间充质干细胞分泌的Dickkopf-1具有抑制C6细胞中Wnt信号通路的作用提供了证据。因此，人脐带间充质干细胞分泌的Dickkopf-1是C6细胞中Wnt信号通路的一个上游抑制子，这是间充质干细胞抑制肿瘤细胞的一个机制。需要注意的是，抗Dickkopf-1的中和抗体并没使C6细胞的生长完全恢复到正常水平，仅起到部分逆转，说明Dickkopf-1不可能是间充质干细胞抗肿瘤机制中的惟一媒介，仍需要进一步研究。

人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制

Human umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit glioma growth

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[6]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[7]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[8]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[9]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[10]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[11]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[12]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[13]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[14]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[15]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.