无支架三维人脐带间充质干细胞分泌组修复小鼠皮肤损伤

doi:10.12307/2025.982

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (1): 68-77.doi: 10.12307/2025.982

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

无支架三维人脐带间充质干细胞分泌组修复小鼠皮肤损伤

马文静1，张晋豫1，姜明霞2，修冰水2，白睿3，刘玉含4，陈旭义4，袁增强1，刘志强1

1南华大学衡阳医学院，军事科学院军事医学研究院研究生协作培养基地，湖南省衡阳市 421001；2潍坊医学院附属医院，烟台市莱阳中心医院，山东省烟台市 265299；3解放军第六医学中心心血管病医学部，北京市 100853；4武警特色医学中心，天津市 300162

收稿日期:2024-10-15 接受日期:2024-12-06 出版日期:2026-01-08 发布日期:2025-06-19
通讯作者: 刘志强，博士，研究员，南华大学衡阳医学院，军事科学院军事医学研究院研究生协作培养基地，湖南省衡阳市 421001；共同通讯作者：袁增强，博士，研究员，南华大学衡阳医学院，军事科学院军事医学研究院研究生协作培养基地，湖南省衡阳市 421001 https://orcid.org/0009-0001-4329-0779(马文静)
作者简介:马文静，女，1999年生，青海省海东市人，汉族，南华大学衡阳医学院，军事科学院军事医学研究院研究生协作培养基地生物学专业在读硕士，主要从事干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82200295)，项目负责人：白睿

Scaffold-free three-dimensional human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome repairs mouse skin injury

Ma Wenjing1, Zhang Jinyu1, Jiang Mingxia2, Xiu Bingshui2, Bai Rui3, Liu Yuhan4, Chen Xuyi4, Yuan Zengqiang1, Liu Zhiqiang1

1Hengyang Medical School, University of South China, Postgraduate Cooperative Training Base of Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Hengyang 421001, Hunan Province, China; 2Yantai Laiyang Central Hospital, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, Yantai 265299, Shandong Province, China; 3Cardiovascular Medicine Department of Sixth Medical Center of People's Liberation Army, Beijing 100853, China; 4Armed Police Characteristic Medical Center, Tianjin 300162, China

Received:2024-10-15 Accepted:2024-12-06 Online:2026-01-08 Published:2025-06-19
Contact: Liu Zhiqiang, MD, Researcher, Hengyang Medical School, University of South China, Postgraduate Cooperative Training Base of Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Hengyang 421001, Hunan Province, China; Co-corresponding author: Yuan Zengqiang, MD, Researcher, Hengyang Medical School, University of South China, Postgraduate Cooperative Training Base of Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Ma Wenjing, Master candidate, Hengyang Medical School, University of South China, Postgraduate Cooperative Training Base of Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82200295 (to BR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

无支架三维细胞培养：在没有可黏附生长的环境中，细胞在重力作用下自组装形成类似于微组织的球状体，比常规二维细胞培养更能模拟细胞在生物体内的生理环境。
间充质干细胞分泌组：指间充质干细胞培养过程中分泌至细胞外空间的各种分子或细胞外囊泡，由间充质干细胞培养上清液去除杂质后获得，通过各种可溶性分子(如生长因子、趋化因子)及外泌体介导了间充质干细胞的大部分治疗作用，并且能避免细胞移植的弊端。

摘要
背景：间充质干细胞分泌组中含有生物活性物质、细胞因子及生长因子等，三维细胞培养可调控间充质干细胞内含物的分泌，有望提升损伤修复的潜能。
目的：探讨三维培养人脐带间充质干细胞分泌组对小鼠皮肤损伤的修复效果。
方法：用常规二维培养皿和96孔U底细胞培养板培养人脐带间充质干细胞，收集其分泌组分，RT-qPCR检测人脐带间充质干细胞中皮肤损伤修复相关分泌因子基因表达水平，酶联免疫吸附实验检测人脐带间充质干细胞分泌组中皮肤损伤修复相关因子的蛋白表达水平；使用永生化人脐静脉内皮细胞迁移模型检测人脐带间充质干细胞分泌组的血管损伤修复潜能。建立小鼠皮肤损伤模型，经皮下注射人脐带间充质干细胞分泌组，通过伤口愈合率和组织病理学分析验证皮肤损伤的修复效果。
结果与结论：①培养3 d后，二维培养的人脐带间充质干细胞呈成纤维细胞样漩涡状生长，三维培养的人脐带间充质干细胞为均一微球体；②与二维培养相比，三维培养的人脐带间充质干细胞中转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达水平显著升高；③与二维培养相比，三维培养的人脐带间充质干细胞分泌组中血管内皮细胞生长因子、白细胞介素10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白表达水平显著升高；④与二维培养相比，三维培养的人脐带间充质干细胞分泌组可显著促进永生化人脐静脉内皮细胞的迁移；⑤与未处理对照组和二维培养的人脐带间充质干细胞分泌组相比，三维培养的人脐带间充质干细胞分泌组可显著加快小鼠皮肤伤口愈合速率和伤口皮肤结构重塑。研究结果表明：三维培养可提高人脐带间充质干细胞的旁分泌因子表达，其分泌组可显著促进小鼠皮肤损伤修复。

https://orcid.org/0009-0001-4329-0779(马文静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脐带间充质干细胞, 三维细胞培养, 旁分泌, 分泌组, 细胞迁移, 皮肤缺损, 伤口愈合, 工程化干细胞

Abstract: BACKGROUND: The mesenchymal stem cell secretome contains bioactive substances, cytokines, and growth factors. Three-dimensional cell culture can regulate the secretion of these components, potentially enhancing the ability to promote injury repair.
OBJECTIVE: To investigate the repair effect of three-dimensional cultured human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome on skin injuries in mice.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured in conventional two-dimensional culture dishes and 96-well U-bottom cell culture plates, from which their secretory components were subsequently collected. The expression of skin damage repair related secretory factors in umbilical cord mesenchymal stem cells was analyzed using RT-qPCR. The protein expression level of skin damage repair related factors in umbilical cord mesenchymal stem cell secretome was detected using enzyme-linked immunosorbent assay. The potential of human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome to repair vascular injuries was evaluated using an immortalized human umbilical vein endothelial cell migration model. A mouse skin injury model was established, and the human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome was injected subcutaneously. Repair effects on skin injury were assessed through wound healing rates and histopathological analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After three days of cultivation, human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in two dimensions exhibited a fibroblast-like, swirling growth pattern, whereas three-dimensional culture led to the formation of uniform microspheres. (2) Compared with two-dimensional culture, three-dimensional culture significantly increased the mRNA expression of transforming growth factor β and basic fibroblast growth factor in human umbilical cord mesenchymal stem cells. (3) Compared with two-dimensional culture, three-dimensional cultured human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome significantly enhanced the protein expression of vascular endothelial growth factor, interleukin-10, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome. (4) Compared with two-dimensional culture, three-dimensional cultured human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome significantly promoted the migration of immortalized human umbilical cord mesenchymal stem cells. (5) Compared with the untreated control group and the two-dimensional cultured human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome, the three-dimensional cultured human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome can significantly accelerate the skin wound healing rate and wound skin structure remodeling in mice. These results indicate that three-dimensional culture can enhance the expression of paracrine factors of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and their secretome can significantly promote the repair of mouse skin damage.

Key words: umbilical cord mesenchymal stem cell, three-dimensional cell culture, paracrine, secretome, cell migration, skin defect, wound healing, engineered stem cell

中图分类号:

马文静, 张晋豫, 姜明霞, 修冰水, 白睿, 刘玉含, 陈旭义, 袁增强, 刘志强. 无支架三维人脐带间充质干细胞分泌组修复小鼠皮肤损伤[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(1): 68-77.

Ma Wenjing, Zhang Jinyu, Jiang Mingxia, Xiu Bingshui, Bai Rui, Liu Yuhan, Chen Xuyi, Yuan Zengqiang, Liu Zhiqiang. Scaffold-free three-dimensional human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome repairs mouse skin injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(1): 68-77.

图/表（结果） 7

2.1 细胞形态学鉴定结果 二维或三维培养3 d后，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态，图1A显示二维培养的人脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或漩涡状生长，细胞密度较高；图1B显示三维培养的人脐带间充质干细胞在96孔U底细胞培养板内聚集成干细胞微球，整体形状规则、大小均一。

2.2 二维和三维培养人脐带间充质干细胞中相关分泌因子基因表达差异 为了验证三维培养模式下人脐带间充质干细胞分泌皮肤损伤修复因子的能力是否发生改变，收集了不同条件培养3 d的二维人脐带间充质干细胞和三维人脐带间充质干细胞，通过RT-qPCR检测相关分泌因子的基因表达水平，发现三维人脐带间充质干细胞中与皮肤损伤修复相关营养因子的mRNA表达水平显著上调，如图2所示，转化生长因子β上调约28.2倍、碱性成纤维细胞生长因子上调约6.4倍、血管内皮生长因子上调约16.2倍、白细胞介素10上调约17.4倍、肝细胞生长因子上调约8.7倍、肿瘤坏死因子刺激因子6上调约25.7倍、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子上调约92.2倍。

2.3 二维和三维HUCMSCs-Sec中旁分泌因子的蛋白表达水平 ELISA检测培养3 d后二维和三维HUCMSCs-Sec中血管内皮生长因子、白细胞介素10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的蛋白分泌量。如图3所示，与二维HUCMSCs-Sec相比，三维HUCMSCs-Sec中血管内皮生长因子的蛋白分泌量上调约1.2倍，白细胞介素10上调约7.1倍，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子上调约1.9倍。

2.4 二维和三维HUCMSCs-Sec对人脐静脉内皮细胞迁移的影响 将HUCMSCs-Sec用于人脐静脉内皮细胞划痕损伤培养，以使用DMEM完全培养基为对照组，对比二维和三维HUCMSCs-Sec对人脐静脉内皮细胞迁移的影响，结果显示与对照组和同体积分数的二维HUCMSCs-Sec组相比，划痕损伤后24 h时三维HUCMSCs-Sec组细胞迁移率已超过50%，36 h时三维HUCMSCs-Sec组划痕几乎愈合，细胞迁移率[20%三维HUCMSCs-Sec为(79.3±3.4)%，50%三维HUCMSCs-Sec为(93.5±0.5)%]显著高于其他两组[对照组为(56.6±4.2)%，20%二维HUCMSCs-Sec为(63.9±3.8)%、50%二维HUCMSCs-Sec为(72.8±2.2)%]；损伤后48 h时三维HUCMSCs-Sec组划痕完全愈合，愈合率为100%，显著高于其他两组[对照组为(85.5±5.3)%，20%二维HUCMSCs-Sec组为(90.3±4.1)%，50%二维HUCMSCs-Sec为(91.2±5.6)%]，见图4A-D；为了更加直观地对比各组人脐静脉内皮细胞的迁移能力，对各个时间点的划痕剩余率进行了定量统计，见图4A，图4E-G，与对照组和二维HUCMSCs-Sec组相比，划痕损伤后24，36，48 h时三维HUCMSCs-Sec组划痕缩小的速率更快。

2.5 二维和三维HUCMSCs-Sec对小鼠皮肤损伤愈合的影响 小鼠皮肤损伤造模后，在0，1，3，5，7，10，14，16 d对伤口恢复情况进行拍照记录，如图5A，B所示，大体观察伤口外观发现，二维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠伤口的炎性浸润程度、伤口结痂程度等与无处理对照组无显著差异，7-16 d伤口愈合程度无明显差异；而三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠在损伤后3 d内的炎性浸润程度较轻、伤口表面渗出液少，损伤后5 d时伤口结痂平整，损伤后7-16 d伤口开始快速缩小，损伤后16 d时创面几乎完全愈合，可见上皮化皮肤。将各个时间点的伤口边缘绘制成伤口愈合趋势图，见图5C，D，也同样显示三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠各个时间点伤口缩小更快。二维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠伤口愈合率在术后各个时间节点与对照组相比无显著差异，见图5E，而三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠伤口愈合率在术后10，14，16 d时均显著高于对照组，见图5F。

2.6 二维和三维HUCMSCs-Sec对小鼠皮肤损伤组织病理学的影响
2.6.1 苏木精-伊红染色结果 小鼠皮肤损伤后16 d，取伤口及其周围1.0-2.0 mm处的皮肤进行病理染色，如图6A显示对照组小鼠皮肤角化过度如红色箭头所示，伴有局部棘层增厚如白色箭头所示，胶原纤维缺失，未见皮肤附属器，同时可见少量炎症细胞浸润如黄色箭头所示。此外，局部区域还出现细胞坏死现象，表现为胞核碎裂、固缩及深染，如黑色箭头所示。二维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤损伤程度较对照组稍有改善，肉芽组织区域有所减少，皮肤附属器官稍有增多，如黄色箭头所示毛囊；棘层较厚，未见明显变化，真皮层胶原纤维排列疏松，仍可见大量炎症细胞及成纤维细胞。与对照组相比，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤表皮层结构保持相对完整，未见明显增厚，可观察到少量皮肤附属器，包括毛囊和皮脂腺，分别为蓝色和绿色箭头所示。更重要的是，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤的炎症和坏死症状有所减轻，如黄色箭头所示，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤中有较少的炎症细胞。进一步定量分析显示各小鼠在表皮、肉芽组织、真皮厚度方面有显著差异。如图6B-D所示，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠的表皮厚度(38.1±15.3) μm显著低于对照组的(85.6±33.7) μm和二维HUCMSCs-Sec治疗组的(66.5±20.5) μm；三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠肉芽组织厚度(124.0±34.2) μm同样低于对照组的(302.3±95.0) μm和二维HUCMSCs-Sec治疗组的(275.3±54.6) μm，而三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠的真皮厚度(544.6±424.1) μm显著高于对照组的(246.6±117.5) μm和二维HUCMSCs-Sec治疗组的(360.6±121.6) μm，表明三维HUCMSCs-Sec组治疗后小鼠损伤皮肤结构恢复更为完整。

2.6.2 免疫组化染色结果 如图7A所示，小鼠皮肤损伤后16 d，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤中CD31阳性染色显著增多。如图7B所示，三维HUCMSCs-Sec治疗组CD31阳性表达率(即微血管密度)达到(432.6±58.1)个/mm2，对照组CD31阳性表达率为(225.9±32.5)个/mm2，二维HUCMSCs-Sec治疗组CD31阳性表达率为(267.5±17.0)个/mm2，三维HUCMSCs-Sec治疗组与对照组和二维HUCMSCs-Sec治疗组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

皮肤作为人体抵御外界刺激与伤害的首道物理防线，不仅在体温调节、感知、代谢和免疫调节等关键生理环节发挥着不可或缺的作用，更是守护机体健康的重要屏障[1]。然而，长期暴露于外界环境的皮肤却时常遭受损伤，这不仅可能引发感染，还可能引发一系列并发症，对身体健康构成威胁[2]。皮肤损伤修复是一个高度复杂且动态的再生过程[3]，它需要经历血液凝固、炎症、增殖和组织重构4个阶段[4-5]。在这一过程中，皮肤需要克服诸多挑战，包括调节炎症反应、促进细胞增殖、实现血管再生以及重塑皮肤结构等[6-7]。
间充质干细胞是一类拥有强大自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞[8]，更具备免疫调节潜能[9-10]，在皮肤损伤修复中，凭借自我增殖、分化能力和旁分泌信号，有效促进细胞增殖和血管再生，减轻炎症反应，从而加速伤口愈合并提高愈合质量[11-13]。然而，目前间充质干细胞治疗面临着一些挑战，如细胞存活率低[14]、组织靶向困难以及潜在的致瘤风险等[15]。近年来的研究发现，间充质干细胞的旁分泌因子在改善损伤处微环境、促进组织器官损伤修复方面发挥着重要作用[16]，这为组织再生领域提供了一个全新的“无细胞”治疗思路——利用间充质干细胞来源分泌组进行损伤治疗[17]。
分泌组是间充质干细胞培养过程中所释放的所有蛋白质的集合，是间充质干细胞培养液去除细胞、细胞碎片等杂质后保留的主体部分，其中富含间充质干细胞分泌的生物活性因子，如可溶性蛋白、核酸、脂类和细胞外囊泡等，这些因子具有促进损伤修复的潜能[18]。目前，已有大量研究证实了间充质干细胞分泌组治疗的有效性[19-20]，在血管生成、组织修复、免疫调节、伤口愈合等多种生理过程中发挥调节作用。间充质干细胞分泌组通过影响损伤炎症期和增殖期的相应蛋白表达促进皮肤损伤修复，还可将表皮干细胞、成纤维细胞和免疫细胞等募集到损伤部位并协调各细胞以促进伤口修复；此外，间充质干细胞分泌组还可调节内源性细胞因子或生长因子的分泌，发挥旁分泌调控作用[21]。人脐带间充质干细胞分泌组(human umbilical cord mesenchymal stem cells-secretome，HUCMSCs-Sec)在成人皮肤细胞、体外皮肤组织和3D皮肤模型中具有抗炎、抗凋亡、抗衰老和解毒等一系列对皮肤稳态恢复有益的积极作用[22]。
然而，目前的研究往往以常规二维培养后收集的间充质干细胞分泌组为主，在玻璃或塑料为基底的平面上培养时，细胞以单层形式生长，这种培养方式虽然简便快捷，但是细胞以单层形式生长会影响细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用，从而使得常规二维培养的间充质干细胞旁分泌功能有限，分泌组中相关治疗因子的表达量也较低。而细胞在三维空间环境中生长时能够更加接近“体内”的生长环境[23]，与二维培养相比，三维细胞培养可以上调组织特异性标志物的表达水平，基因表达谱也更趋于多样化[24]。已有研究报道，三维细胞培养能显著提升间充质干细胞的旁分泌功能，从而提高分泌组的损伤修复潜能[25]。为了验证三维间充质干细胞分泌组修复皮肤损伤的效果，采用96孔U底细胞培养板三维培养人脐带间充质干细胞，收集HUCMSCs-Sec组，然后建立小鼠皮肤缺损模型，通过皮下注射三维HUCMSCs-Sec，观察皮肤缺损修复效果，为三维HUCMSCs-Sec在皮肤损伤修复中的应用提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验，随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年5月至2024年7月在军事科学院军事医学研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 人脐带间充质干细胞由北京中卫医正科技有限公司赠予，伦理审批号：2023-(药)第002号-001，细胞冻存、培养、传代均在军事科学院军事医学研究院进行；人脐静脉内皮细胞来自军事科学院军事医学研究院冻存细胞系。
1.3.2 实验试剂与仪器 α-MEM培养基(Gibco，C12571500BT)；DMEM高糖培养基(Gibco，C11995500BT)；胎牛血清(Biological Industries，04-001-1ACS)；青霉素-链霉素双抗溶液(Sigma，03-031-1BCS)；0.25%胰蛋白酶消化液(Biological Industries，03-050-1ACS)；PBS(Gibco，10010049)；血管内皮生长因子ELISA试剂盒(Biolegend，HUEB05478)；白细胞介素10 ELISA试剂盒(Biolegend，HUEB0119)；粒细胞集落刺激因子ELISA试剂盒(爱必信，abs51108)；反转录试剂盒(北京全式金生物，AU341-02-V2)；RT-qPCR MIX (GenStar，A020-10)；40 g/L多聚甲醛(塞维尔，G1101-500ML)；苏木精(无锡傲悦东源生物科技有限公司，ZLI-9610)；伊红(无锡傲悦东源生物科技有限公司，ZLI-9613)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，20231122)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，20240207)；柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司，20210511)；ABC-Peroxidase Kits(VECTASTAIN，PK-4000)；重组Anti-CD31抗体(Abcam，ab182981)；96孔U底细胞培养板(Corning，LOT30623044)；透析袋[索莱宝，Viskase(MD3416)]；二氧化碳细胞培养箱(瑞沃德，RWD-D180)；倒置荧光显微镜(蔡司，Vert A1)；RT-qPCR仪(Applied Biosystems，QuantStudio3)；普通PCR仪(Bio-Rad，MyCycler)；组织匀浆机(Bertin，Precellys24)；4 ℃离心机(Eppendorf，5417R)；NanoDrop 分光光度计(IMPLEN，Nanophotometer P330)；酶标仪(TECAN，Infinite M200)；全景扫描仪(济南丹吉尔电子有限公司，3DHISTECH)。
1.3.3 实验动物 8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠11只，体质量约20 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物机构许可证号为SYXK(京)2024-0010。动物在干燥通风条件下饲养，自由进食和饮水。实验方案经军事医学院军事认知与脑科学研究所军事脑科学研究中心动物实验伦理委员会批准，审批号为IACUC-DWZX-2022-814。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的培养 用含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗溶液的α-MEM培养基培养人脐带间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中，每2 d更换1次培养基，细胞长至80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3的比例传代培养。当细胞数量达到实验要求后，将细胞消化制备成浓度为8×107 L-1的细胞悬液，取50 μL细胞悬液加入超低黏附96孔U底细胞培养板中，将U型板转移至CO2细胞培养箱中培养3 d，作为三维培养组。同时，为了进行对比研究，将相同细胞浓度的细胞悬液接种在10 cm2细胞培养皿中培养3 d，作为二维对照组。
1.4.2 HUCMSCs-Sec的收集 将二维和三维培养的人脐带间充质干细胞置于CO2细胞培养箱中培养3 d后，收集相应的细胞培养液，2 000 r/min离心10 min以去除其中细胞碎片等杂质，然后将二维和三维细胞培养液装入预先处理好的分子质量为3 000 kDa的透析袋，放入无菌PBS中，4 ℃透析24-48 h，至培养基中的酚红完全去除。

1.4.3 RT-qPCR检测 收集HUCMSCs-Sec后在剩余的细胞中加入1 mL Trizol，研磨成匀浆，随后加入Trizol体积1/5的三氯甲烷冰浴萃取10 min，分层后14 000 r/min离心15 min，吸取上清液，加入等体积的异丙醇，涡旋混匀并冰浴10 min，再次14 000 r/min离心15 min后弃上清，用1 mL体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次，离心去除乙醇，晾干，最后加入适量无菌无酶水溶解RNA，用分光光度计检测浓度后，取1 μg RNA用反转录试剂盒合成cDNA，得到的cDNA用RT-qPCR试剂盒检测碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子刺激因子6、转化生长因子β基因的mRNA表达量，以ACTB作为内参基因，每个样本设3个复孔，反应条件为：95 ℃ 10 min以活化DNA酶，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环为扩增和分析，2-ΔΔCt方法计算目的基因的表达量。相关基因序列见表1。

1.4.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) 用ELISA法检测所收集的HUCMSCs-Sec中血管内皮生长因子、白细胞介素10、肿瘤坏死因子刺激因子6蛋白水平，按照ELISA试剂盒说明操作，提前准备好洗涤液、检测缓冲液、SA-HRP、信号增强剂、检测抗体和标准品，平衡至室温；用300 μL洗涤液泡板30 s，将100 μL不同浓度标准品和HUCMSCs-Sec加入相应孔中，封板，室温孵育1.5 h，每孔加100 μL洗涤液洗板5次；每孔加
100 μL检测抗体，室温孵育30 min，重复洗板操作；每孔加100 μL信号增强剂，室温避光孵育15 min，重复洗板操作；每孔加100 μL SA-HRP，室温避光孵育15 min，重复洗板操作；每孔加100 μL TMB显色底物，室温避光孵育5-30 min；每孔加100 μL终止液，30 min内使用酶标仪进行450 nm和570 nm双波长检测吸光度值，根据吸光度值计算样品蛋白浓度。
1.4.5 人脐静脉内皮细胞迁移模型 用0.25%胰蛋白酶消化人脐静脉内皮细胞，待细胞形态变圆后，加入双倍体积的DMEM完全培养基以终止消化。待细胞融合率达80%-90%后，用200 μL移液枪轻轻吹打后使细胞脱落并收集至离心管中，经1 400 r/min离心5 min后，去除上清液，再加入1 mL DMEM完全培养基重悬细胞，计数后按照1×108 L-1细胞浓度接种至12孔板中，每孔500 μL细胞悬液，培养至细胞融合率达80%-90%后，用200 μL移液枪头在孔中央划痕，轻轻加入PBS洗去被划起来的细胞，随后更换为DMEM完全培养基或含有不同体积分数(20%，50%)二维或三维HUCMSCs-Sec的培养基，分别在0，24，36，48 h时拍摄同一部位，Image J软件分析细胞迁移情况，根据各个时间点平均划痕宽度，统计划痕细胞迁移率和划痕剩余率以量化评估细胞迁移程度。划痕迁移率=(初始平均划痕宽度-第n小时平均划痕宽度)/初始平均划痕宽度×100%，划痕剩余率=(第n小时平均划痕宽度/初始平均划痕宽度)×100%。
1.4.6 皮肤损伤模型制备 11只雄性C57BL/6J小鼠经腹腔注射0.3%戊巴比妥(0.01 mL/g)麻醉后，剔除背部毛发，利用无菌眼科剪在小鼠背部上下各形成2个直径约1 cm的圆形皮肤缺损伤口，随后伤口随机分为无处理对照组、二维HUCMSCs-Sec治疗组和三维HUCMSCs-Sec治疗组，对照组伤口不做任何处理，二维和三维HUCMSCs-Sec治疗组连续7 d皮下注射80 μL二维或三维HUCMSCs-Sec，实验期间小鼠单笼饲养，自由摄食，环境保持通风干燥，以确保实验条件稳定。
1.4.7 小鼠伤口愈合的观察指标 观察伤口外观恢复情况。另外，在创伤后0，1，3，5，7，10，14，16 d时对创面进行拍照记录。采用Image J软件测量创面面积，并计算伤口愈合率，伤口愈合率=(初始伤口面积-第n天伤口面积)/初始伤口面积×100%，以量化评估伤口的愈合程度。
1.4.8 小鼠皮肤组织病理学检测 创伤后第16天测量愈合伤口面积后，随机取3只小鼠，麻醉后取伤口新生皮肤组织及周围少许正常皮肤，用40 g/L多聚甲醛固定，将固定好的组织脱水、包埋、切片，进行苏木精-伊红染色和免疫组化染色，全景扫描观察新生皮肤病理学改变。
1.4.9 苏木精-伊红染色 烤片机烤干石蜡切片，二甲苯脱蜡5-10 min，将切片依次移入无水乙醇、体积分数90%乙醇、体积分数80%乙醇、体积分数70%乙醇中各2 min，水中洗片2次以洗去乙醇，每次2.0-3.0 min；然后将切片浸入苏木精中8-15 min，观察颜色略微深染时移入水中1.0-2.0 min，以洗去浮色；之后切片转移至体积分数1%盐酸乙醇中分化几秒至30 s，使切片褪色至淡蓝红色，移入流水洗涤30-60 min，使组织呈鲜蓝色或天蓝色后转入伊红染液中浸染2-5 min，再转入水中洗去伊红浮色；吸去玻片上多余水分后浸入体积分数80%乙醇中脱水1.0-2.0 min，体积分数90%乙醇中脱水2-4 min，无水乙醇中彻底脱水4-8 min；最后，移入二甲苯Ⅰ中透明3-5 min，二甲苯Ⅱ中透明5-10 min；透明结束后取出，并滴加中性树脂于组织上用盖玻片封固；晾干后，全景扫描机扫片，观察各组皮肤组织结构恢复情况，并对表皮厚度、肉芽组织厚度和真皮厚度进行统计分析。
1.4.10 免疫组化染色 烤片机烤干石蜡切片，二甲苯脱蜡2次，每次20 min；梯度乙醇水化：无水乙醇5 min，无水乙醇5 min，体积分数95%乙醇3 min，体积分数80%乙醇3 min，体积分数70%乙醇3 min，ddH2O 5 min，PBS 5 min；切片用pH=6.0的柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，微波炉高火3 min煮至沸腾后低火8 min，室温冷却40 min后用PBS洗3次，每次5 min；然后用体积分数3%过氧化氢室温避光孵育15 min，以封闭内源性过氧化物酶，PBS洗3次，每次5 min；之后用组化笔圈住组织，30 g/L BSA室温封闭30 min；重组Anti-CD31抗体按1∶2 000稀释后4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min；免疫组化试剂盒中二抗按1∶200稀释后室温孵育90 min，PBS洗3次，每次5 min；免疫组化试剂盒中AB液按1∶100稀释后室温孵育90 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB显色液按1∶20稀释后显色10-15 min，显色后在显微镜下观察有无阳性染色，观察着色适宜后流水冲洗5 min后终止显色；接着用苏木精复染5 min，流水冲洗15 min，PBS反蓝1 min，ddH2O洗3 min，PBS洗3 min；用体积分数70%、80%，90%，95%，100%乙醇梯度脱水，每次3 min；二甲苯透明2次，每次5 min；最后滴加中性树脂于组织上用盖玻片封固；晾干后，全景扫描机扫片，观察各组CD31阳性表达并进行定量统计分析。
1.5 主要观察指标 ①二维和三维培养的人脐带间充质干细胞形态；②二维和三维培养的人脐带间充质干细胞中皮肤损伤修复相关基因表达差异；③二维和三维培养的HUCMSCs-Sec中血管内皮生长因子、白细胞介素10、肿瘤坏死因子刺激因子6的蛋白表达差异；④二维和三维HUCMSCs-Sec促进人脐静脉内皮细胞迁移能力的差异；⑤二维或三维HUCMSCs-Sec处理后皮肤伤口愈合情况；⑥二维或三维HUCMSCs-Sec处理后皮肤组织病理学和免疫组化分析。
1.6 统计学分析 实验数据采用x±s表示，应用Graphpad prism 9软件进行t检验和单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军军事科学院军事医学研究院统计学专家审核。

讨论

皮肤损伤修复是一个错综复杂的生物学过程，它涵盖了皮肤多层结构的再生与重塑。间充质干细胞具有独特的生物学特性，在治疗皮肤损伤方面展现出了巨大的应用潜力。特别是人脐带间充质干细胞，由于易于获取且不受伦理道德的约束，已成为损伤修复和组织再生研究中的热门选择。
当前，国内外大量研究已证实间充质干细胞在皮肤损伤修复中的多种作用机制。间充质干细胞能在损伤部位分化为成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞等伤口区域常驻细胞[26]，从而直接促进伤口愈合[27]；其次，免疫调节作用能有效调控伤口区域的炎症反应，促进伤口愈合；更重要的是，间充质干细胞通过旁分泌多种损伤修复相关营养因子，显著促进血管再生和组织重塑等[28]。然而，尽管间充质干细胞移植对皮肤损伤修复具有积极效果，但移植的细胞存活率低等问题限制了疗效的进一步提升[29]。近年来，间充质干细胞旁分泌组的研究取得了显著进展，大量研究发现其损伤修复效果甚至不亚于细胞本身。间充质干细胞旁分泌组促进皮肤损伤愈合的主要机制是增加细胞迁移和细胞增殖作用，以促进血管生成、再上皮化和胶原沉积等[30]。有研究报道显示使用骨髓来源间充质干细胞分泌组可显著加快伤口愈合速率，促进肉芽组织形成、血管和毛囊再生，通过中性粒细胞和巨噬细胞浸润发挥免疫调节作用，并在体内发挥一定的抗菌作用[31]。因此，间充质干细胞分泌组被视为是一种具有潜力的“无细胞疗法”[32]，这种治疗方法避免了细胞移植后的一系列不确定风险，不仅安全性更高，而且易于获取、储存、移植和临床转化[33]。目前，提升间充质干细胞分泌组治疗效率的研究正在不断深入，有望为临床化应用提供更多科研基础。
相较于常规的二维培养皿培养模式，三维培养技术可通过模拟细胞体内生态位，显著增强细胞与细胞、细胞与基质以及细胞与环境之间的相互作用[34]，进而增强间充质干细胞的旁分泌效应，提高间充质干细胞分泌组的治疗效果[35]。因此，该实验对三维HUCMSCs-Sec治疗皮肤损伤的效果进行了验证。
皮肤伤口愈合是一个涉及多种细胞和生物活性因子协同作用的过程[36]，这些因子在炎症调节、血管再生、上皮化、肉芽组织形成和胶原再生等方面发挥着重要作用[37]。如转化生长因子β通过调节伤口处单核细胞转化形成巨噬细胞减少炎症反应[38]；碱性成纤维细胞生长因子参与肉芽组织再生、再上皮化和组织重塑[39]；血管内皮生长因子在伤口炎症晚期和修复增殖期发挥作用，对伤口肉芽组织生成、血管再生和胶原纤维合成有重要作用[40]；白细胞介素10作为一种抗炎性细胞因子，在调控创伤性炎症反应中发挥重要作用[41]；此外，在整个损伤愈合过程中，肝细胞生长因子[42]、肿瘤坏死因子刺激因子6[43]、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等也发挥着重要作用[44-45]。通过RT-qPCR检测二维和三维培养模式下人脐带间充质干细胞中这些分泌因子的表达，发现三维培养的人脐带间充质干细胞微球中上述分泌因子的表达水平均显著上调，表明两种培养模式下的人脐带间充质干细胞旁分泌因子在基因水平上存在显著差异。同时，ELISA检测也显示三维HUCMSCs-Sec中血管内皮生长因子、白细胞介素10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等关键因子的蛋白表达水平也显著上调，进一步证实了三维培养对HUCMSCs-Sec的分泌有显著提升作用。
血管再生是指毛细血管以出芽的方式形成新血管，对伤口部位氧气和营养物质输送进而促进皮肤组织修复和再生至关重要[46]。为了进一步探究三维HUCMSCs-Sec在血管再生方面的治疗有效性，利用人脐静脉内皮细胞迁移模型体外模拟了血管损伤，并对比了二维和三维HUCMSCs-Sec对人脐静脉内皮细胞迁移的影响。实验结果显示，与DMEM培养基和二维HUCMSCs-Sec相比，20%和50%的三维HUCMSCs-Sec均能促进划痕损伤修复，这一发现提示三维培养可能显著提升了HUCMSCs-Sec对皮肤损伤修复的潜能。
伤口愈合是皮肤损伤修复的关键指标之一，是一个涉及炎症调节、血管新生、再上皮化和伤口闭合等多个生理现象的动态过程，因此，接下来验证了二维和三维HUCMSCs-Sec促进小鼠皮肤损伤修复的潜能，结果显示：与无处理对照组相比，二维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠伤口愈合速率、皮肤结构重塑以及血管再生这些主要的修复指标都没有显著恢复效果，而三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠则表现出更轻的炎症反应和更快的伤口愈合速率。病理染色结果也显示，三维HUCMSCs-Sec治疗组小鼠皮肤结构恢复更加完整，有明显的毛囊和微血管新生。以上结果均表明三维HUCMSCs-Sec对小鼠皮肤损伤模型具有良好的治疗作用。
然而，实验还存在一些局限性：首先，三维HUCMSCs-Sec的成分复杂，关键组分和机制尚不明确[47]；其次，不同批次和状态的细胞产生分泌因子的能力会有所差异，进而导致HUCMSCs-Sec中有效治疗因子的含量难以控制[48]；更重要的是，该实验采用的皮下注射给药方式虽然避免了静脉注射给药时HUCMSCs-Sec在非损伤部位吸收产生的不良反应，但HUCMSCs-Sec作为一种生物活性物质混合物，在皮肤损伤处的稳定性较差、易降解、有效成分难以长期保留、需要连续注射。因此，未来的研究需要进一步优化给药方式[49]、剂量和时间等参数以提高治疗效果，为HUCMSCs-Sec的临床应用提供理论参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

无支架三维人脐带间充质干细胞分泌组修复小鼠皮肤损伤

Scaffold-free three-dimensional human umbilical cord mesenchymal stem cell secretome repairs mouse skin injury

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