脂肪来源间充质干细胞及外泌体对地塞米松诱导肌肉减少症小鼠的治疗作用

doi:10.12307/2025.576

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (1): 58-67.doi: 10.12307/2025.576

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脂肪来源间充质干细胞及外泌体对地塞米松诱导肌肉减少症小鼠的治疗作用

袁为远1，2，雷秦袆3，李秀琪3，卢铁柱3，傅子文4，5，梁志丽5，季韶洋6，李一佳1，2，任宇3

1上海喜迈思生物医药有限公司，上海市 200233；2上海宝山合成生物学转化研究院，上海市 200233；3觅投克(北京)生物医学技术有限公司，北京市 101319；4觅外觅(张家港)生物科技有限公司，江苏省张家港市 215628；5广东艾万生物科技有限公司，广东省珠海市 519060；6中国科学院过程工程研究所，北京市 100190

收稿日期:2024-11-20 接受日期:2025-01-24 出版日期:2026-01-08 发布日期:2025-06-18
通讯作者: 李一佳，博士，副研究员，上海喜迈思生物医药有限公司，上海市 200233；上海宝山合成生物学转化研究院，上海市 200233；共同通讯作者：任宇，博士，觅投克(北京)生物医学技术有限公司，北京市 101319
作者简介:袁为远，男，1993年生，湖南省张家界市人，土家族，2019年南京中医药大学毕业，硕士，主要从事细胞治疗研究。共同第一作者：雷秦袆，女，1994年生，陕西省渭南市人，汉族，2020年甘肃农业大学毕业，硕士，主要从事细胞治疗研究。

Therapeutic effects of adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes on dexamethasone-induced sarcopenia in mice

Yuan Weiyuan1, 2, Lei Qinhui3, Li Xiuqi3, Lu Tiezhu3, Fu Ziwen4, 5, Liang Zhili5, Ji Shaoyang6, Li Yijia1, 2, Ren Yu3

1CiMSC Therapeutics Co., Ltd., Shanghai 200233, China; 2Baoshan Institute of Synthetic Biology and Translational Research, Shanghai 200233, China; 3Mitoch Therapeutics Co., Ltd., Beijing 101319, China; 4Miymi Biotech Co., Ltd., Zhangjiagang 215628, Jiangsu Province, China; 5AdvanCell Biotech Co., Ltd., Zhuhai 519060, Guangdong Province, China; 6Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Received:2024-11-20 Accepted:2025-01-24 Online:2026-01-08 Published:2025-06-18
Contact: Li Yijia, PhD, Associate researcher, CiMSC Therapeutics Co., Ltd., Shanghai 200233, China; Baoshan Institute of Synthetic Biology and Translational Research, Shanghai 200233, China; Co-corresponding author: Ren Yu, PhD, Mitoch Therapeutics Co., Ltd., Beijing 101319, China
About author:Yuan Weiyuan, MS, CiMSC Therapeutics Co., Ltd., Shanghai 200233, China; Baoshan Institute of Synthetic Biology and Translational Research, Shanghai 200233, China. Lei Qinhui, MS, Mitoch Therapeutics Co., Ltd., Beijing 101319, China. Yuan Weiyuan and Lei Qinhui contributed equally to this work.

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

间充质干细胞：是一类来源于中胚层的具有自我更新和多向分化能力的多能成体干细胞，具有抗炎、免疫调节、组织再生等生物学作用，已被作为新型疗法广泛运用到临床研究中。
肌肉减少症：是一种增龄相关的骨骼肌肉量减少、肌肉力量下降和/或躯体功能减退的老年性疾病。

摘要
背景：肌肉减少症是一种增龄相关的骨骼肌肉量减少、肌肉力量下降和/或躯体功能减退的老年性疾病。目前，针对肌肉减少症的有效治疗手段仍然匮乏，探索新的治疗方法以改善肌肉减少症患者的症状和预后具有重要的临床意义。
目的：探讨犬脂肪来源间充质干细胞及外泌体对地塞米松诱导的小鼠肌肉减少症模型的影响。
方法：从犬脂肪组织中分离并培养脂肪间充质干细胞，通过流式细胞术和成骨、成脂肪、成软骨分化实验进行细胞鉴定及功能评估。随后提取脂肪间充质干细胞外泌体，通过透射电镜、Western blot、库尔特纳米单颗粒检测技术对外泌体进行表征。在体外，使用地塞米松诱导C2C12肌管萎缩模型和C2C12衰老模型，观察犬脂肪来源间充质干细胞及外泌体对肌管生长和肌肉萎缩基因表达的影响。在体内，使用地塞米松诱导构建小鼠肌少症模型，腹腔或静脉注射犬脂肪间充质干细胞治疗，通过小鼠转棒行为学研究、组织病理检查、肌肉萎缩基因检测进行疗效评估。
结果与结论：①分离的犬脂肪间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达MHC-Ⅱ、CD14、CD19、CD34、CD45，在体外能够成功分化为成骨、成脂和成软骨细胞；②脂肪间充质干细胞外泌体粒径大小、电镜形态、特异性标志物阳性表达符合鉴定标准；③与地塞米松诱导的萎缩C2C12细胞相比，脂肪间充质干细胞及外泌体治疗后均可促进肌管的恢复和生长，抑制肌肉萎缩相关基因MuRF1和Atrogin-1的表达；④与衰老C2C12细胞组比，脂肪间充质干细胞及外泌体可显著促进衰老细胞肌管的恢复和生长；⑤与对照组小鼠相比，地塞米松诱导的肌少症模型小鼠在棒时间显著减少(P < 0.01)，脂肪间充质干细胞腹腔和静脉给药后7 d(P < 0.01，P < 0.01)和10 d(P < 0.01，P < 0.05)均可显著增加在棒时间，给药后14 d，各治疗组小鼠在棒时间均高于模型组，但无显著差异；⑥与对照组相比，地塞米松组胫前肌肌管面积显著减小(P < 0.01)，脂肪间充质干细胞腹腔和静脉给药后可显著增加胫前肌肌管横截面积(P < 0.05，P < 0.01)；⑦与地塞米松组相比，脂肪间充质干细胞腹腔和静脉给药可显著抑制MuRF1和Atrogin-1基因表达(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01)。结果表明，脂肪来源间充质干细胞及外泌体可通过抑制肌肉萎缩基因表达，促进萎缩肌管细胞恢复和生长，腹腔和静脉注射脂肪来源间充质干细胞均对肌肉减少症小鼠有良好的治疗作用。

https://orcid.org/0000-0003-0588-3802 (袁为远)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪间充质干细胞, 肌少症, 细胞治疗, 外泌体, 衰老, 肌肉萎缩, 地塞米松

Abstract: BACKGROUND: Sarcopenia is an age-related condition characterized by the loss of skeletal muscle mass, strength, and/or physical function. Currently, effective treatments for sarcopenia remain limited. A new therapeutic approach to improve symptoms and prognosis of sarcopenia patients clinically was important.
OBJECTIVE: To explore the effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes on a dexamethasone-induced sarcopenia in mice.
METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from canine adipose tissue, and identified and functionally evaluated through flow cytometry and differentiation assays for osteogenesis, adipogenesis, and chondrogenesis. Subsequently, exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells were extracted and characterized using transmission electron microscopy, western blot assay, and nanocoulter tracking analysis. In vitro, the effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes on myotube growth and the expression of muscle atrophy-related genes were investigated using dexamethasone-induced C2C12 myotube atrophy and aging C2C12 models. In vivo, a dexamethasone-induced mouse sarcopenia model was established and received intraperitoneal or intravenous injection of canine adipose-derived mesenchymal stem cells. Therapeutic efficacy was assessed through mouse rotarod performance, histopathological analysis, and muscle atrophy-related genes testing.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The isolated canine adipose-derived mesenchymal stem cells highly expressed CD73, CD90, and CD105, and lowly expressed MHC-II, CD14, CD19, CD34, and CD45, and successfully differentiated into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes in vitro. (2) The adipose-derived mesenchymal stem cells-derived exosomes met the identification criteria in terms of particle size, electron microscopy morphology, and positive expression of specific markers. (3) Compared to the dexamethasone-induced C2C12 atrophy group, treatment with adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes promoted the recovery and growth of myotubes, inhibited the expression of muscle atrophy-related genes MuRF1 and Atrogin-1. (4) Compared to the aging C2C12 group, adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes significantly enhanced the recovery and growth of aged muscle tubes in aging cells. (5) Compared to the control group, the rotarod time in dexamethasone-induced sarcopenia model mice was significantly decreased (P < 0.01). After 7 days (P < 0.01, P < 0.01) and 10 days (P < 0.01, P < 0.05) of adipose-derived mesenchymal stem cells treatment via intraperitoneal and intravenous injection, rotarod time was significantly increased, respectively. After 14 days, all treatment groups showed longer rotarod times than the model group, although with no significant differences between them. (6) Compared to the control group, the cross-sectional area of anterior tibial muscle in the model group was significantly reduced (P < 0.01), and it was significantly increased after intraperitoneal and intravenous administration of adipose-derived mesenchymal stem cells (P < 0.05, P < 0.01). (7) Compared to the model group, intraperitoneal and intravenous administration of adipose-derived mesenchymal stem cells significantly inhibited the mRNA expression of MuRF1 and Atrogin-1 genes (P < 0.01, P < 0.01, P < 0.01, P < 0.01). The results indicated that adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes promoted recovery and growth of atrophic myotube cells by inhibiting the expression of muscle atrophy-related genes, and both intraperitoneal and intravenous administration of adipose-derived mesenchymal stem cells provided good therapeutic effects on sarcopenia in mice.

Key words: adipose-derived mesenchymal stem cell, sarcopenia, cell therapy, exosome, aging, muscle atrophy, dexamethasone

中图分类号:

袁为远, 雷秦袆, 李秀琪, 卢铁柱, 傅子文, 梁志丽, 季韶洋, 李一佳, 任宇. 脂肪来源间充质干细胞及外泌体对地塞米松诱导肌肉减少症小鼠的治疗作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(1): 58-67.

Yuan Weiyuan, Lei Qinhui, Li Xiuqi, Lu Tiezhu, Fu Ziwen, Liang Zhili, Ji Shaoyang, Li Yijia, Ren Yu . Therapeutic effects of adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes on dexamethasone-induced sarcopenia in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(1): 58-67.

图/表（结果） 4

2.1 AMSCs鉴定结果 流式细胞术结果显示，AMSCs阳性标志物CD73、CD90、CD105的阳性百分比分别为96.50%，99.80%，99.30%，阴性指标MHC-Ⅱ、CD14、CD19、CD34、CD45的阳性百分比分别为0.03%，0.02%，0.49%，0.08%，0.08%，以上数据表明分离培养的AMSCs纯度达到95%以上，状态良好，见图1。AMSCs三系分化结果显示，经茜素红染色可见红色钙结节，表明具有成骨分化能力；经油红O染色可见红色脂滴，表明具有成脂分化能力；经阿利新蓝染色可见浅蓝色软骨，表明具有成软骨分化能力，见图2。以上结果表明，分离培养的AMSCs具有良好的分化潜能。
2.2 AMSCs-exo鉴定结果 纳米库尔特粒度仪检测结果显示，AMSCs-exo粒径分布为50-100 nm，平均粒径为60 nm，且呈单峰，提示所获得的外泌体纯度较高。Western blot结果显示，与AMSCs相比，分离制备的AMSCs-exo高表达CD9、CD63、TSG101，低表达Calnexin，符合外泌体的表征验证。透射电子显微镜观察到AMSCs-exo呈现不聚团的具有清晰膜结构的茶托状或杯状结构，边缘清晰。以上结果表明，已成功分离纯化获得高质量的外泌体，见图3。
2.3 AMSCs和AMSCs-exo可逆转地塞米松诱导的体外肌肉细胞萎缩 C2C12细胞使用地塞米松刺激后，肌管直径及面积显著减少，提示体外肌管萎缩模型构建成功。使用AMSCs和AMSCs-exo进行处理后，可促进肌管的恢复和生长，见图4。与对照组相比，肌管萎缩组肌肉萎缩相关基因MuRF1和Atrogin-1 mRNA表达显著升高(P < 0.05，P < 0.05)，AMSCs和AMSCs-exo处理后可显著抑制MuRF1和Atrogin-1 mRNA表达(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05)，见图5。以上数据表明AMSCs及AMSCs-exo均可缓解地塞米松诱导的肌管细胞萎缩，抑制肌肉萎缩相关基因表达。

2.4 AMSCs和AMSCs-exo可缓解肌管细胞衰老 体外培养C2C12细胞至衰老状态(第25代)后进行肌管分化。明场结果显示，与健康对照组(第5代C2C12细胞)相比，衰老对照组(第25代C2C12细胞)肌管不易形成，给予AMSCs和AMSCs-exo处理后，可明显恢复衰老细胞中肌管的数量及形态，见图6。以上结果表明AMSCs及AMSCs-exo均可缓解肌管细胞衰老。

2.5 实验动物数量分析 实验选用C57BL/6J小鼠35只，造模及给药后无死亡，全部进入结果分析。
2.6 AMSCs腹腔和静脉给药可增加肌少症小鼠肌肉耐力 通过转棒疲劳实验评估肌少症小鼠药物治疗后的肌肉耐力行为变化。在给药前，与对照组相比，模型组、AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组小鼠的在棒时间均显著降低(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01)，分别为(71.3±5.5) s，(71.4±5.6) s，(70.9±5.2) s，提示地塞米松诱导的小鼠肌少症模型构建成功。给药后7 d，与对照组相比，模型组小鼠的在棒时间为(74.5±5.0) s，差异有显著性意义(P < 0.01)，提示肌少症小鼠肌肉耐力下降。与模型组相比，AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组小鼠的在棒时间显著增加(P < 0.01，P < 0.01)，分别为(146.0±15.7) s，(112.5±11.1) s；给药后10 d，与模型组相比，AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组小鼠的在棒时间也显著增加(P < 0.01，P < 0.05)，分别为(150.5±12.1) s，(166.9±25.0) s；给药后14 d，AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组小鼠的在棒时间[(173.5±26.8) s，(142.5±17.7) s]虽高于模型组，但无明显差异(P > 0.05)，见表2。

2.7 AMSCs腹腔和静脉给药促进肌少症小鼠肌肉恢复 苏木精-伊红染色结果显示，与对照组相比，模型组胫前肌肌管面积显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组给药后均可显著增加胫前肌肌管面积(P < 0.05，P < 0.01)，这与增强肌少症小鼠的肌肉耐力直接相关，见图7。与对照组相比，模型组胫前肌肌肉萎缩相关基因MuRF1和Atrogin-1 mRNA表达显著升高(P < 0.01，P < 0.01)，AMSCs-i.p.组和AMSCs-i.v.组给药后可显著抑制MuRF1和Atrogin-1 mRNA表达(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01)，见图8。以上结果表明，AMSCs-i.p.和AMSCs-i.v.给药后可显著促进肌少小鼠的肌肉恢复和生长，抑制肌肉萎缩相关基因表达。

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引言

肌肉减少症(以下简称肌少症)是一种增龄相关的骨骼肌肉量减少、肌肉力量下降和/或躯体功能减退的老年性疾病[1]。该病最早由IRWIN ROSENBERG于1989年提出[2]，并自2010年起，国内外分别出台了一系列关于肌少症的共识[1，3-5]。2016年，世界卫生组织报告肌少症已成为全球范围内影响老年人健康的主要问题之一，并正式定义肌少症为一种疾病，代码为ICD-10-CM(M62.84)[6]。随着疾病的发展，肌少症不仅影响老年人的日常生活能力，还增加了跌倒和骨折的风险，给社会医疗保健系统带来沉重负担。
肌少症的发病机制复杂，目前尚未完全了解，已报道的可能因素包括细胞衰老、氧化应激、线粒体功能障碍及慢性炎症等[7]。目前，肌少症唯一治疗策略是改变生活方式、增加运动和补充营养[8]，但治疗效果有限，且对于长期卧床或年纪较大的患者来说，治疗需求无法得到充分满足[9-10]。因此，迫切需要开发一种新型、安全、有效的治疗方法，以改善肌少症患者的预后。
随着再生医学的快速发展，间充质干细胞因具有多向分化潜能、自我更新能力、免疫调节和抗炎等作用而成为治疗多种疾病的新方法。已有研究表明间充质干细胞在肌肉萎缩类疾病中具有潜在的治疗作用，间充质干细胞治疗后可显著改善肌肉萎缩和功能障碍[11-12]，并在肌肉稳态维持中发挥重要作用[13-14]。最新临床研究显示，脐带、骨髓和脂肪来源间充质干细胞在衰老引起的虚弱及炎症疾病中展示了良好的有效性和安全性[15-19]，但目前尚无间充质干细胞治疗肌少症的临床研究。临床前研究显示，脐带来源间充质干细胞可抑制肌肉萎缩[10-11]；骨髓来源间充质干细胞可有效抑制肌肉萎缩[20-21]、增强骨骼肌质量[22]、促进肌肉再生[23]；WANG等[24]验证了脐带来源间充质干细胞可显著改善后肢悬挂诱导的小鼠肌肉减少症状，主要通过恢复骨骼肌耐力、减少细胞凋亡及抑止炎症反应来发挥作用。此外，WANG等[25]研究表明脐带来源间充质干细胞改善了肌少症小鼠的肌肉功能障碍。但目前仍缺少脂肪来源间充质干细胞治疗肌少症的相关研究。
外泌体(exosomes)作为细胞间信息通讯的重要递质，具有良好的生物学活性、生物相容性、低免疫原性和低毒性[26]，近年来在医学领域受到广泛关注。外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，含有蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，可调节受体细胞的多种功能，如炎症反应、细胞凋亡和血管生成，以及促进组织修复和再生等。在肌肉相关性疾病治疗中，间充质干细胞来源外泌体已显示出巨大的潜力[27]。脐带来源间充质干细胞外泌体可缓解肌肉萎缩[11]；脂肪来源间充质干细胞外泌体可减少肌肉损伤[28-29]、促进肌肉再生[30]；骨髓来源间充质干细胞外泌体可缓解肌肉损伤[31]、肌肉萎缩和衰老虚弱[32-33]。在肌少症研究中，骨髓来源间充质干细胞外泌体可有效缓解老年肌少症小鼠的肌肉萎缩[34]；脐带来源间充质干细胞的培养液(间充质干细胞分泌组)可显著改善D-半乳糖诱导的肌少症相关生物标志物表达[35]。然而，目前仍缺少脂肪来源间充质干细胞外泌体治疗肌少症的相关研究。
地塞米松是一种常见的糖皮质激素类药物，具有抗炎、免疫抑制作用，广泛用于临床治疗各种疾病。然而，长期使用地塞米松类药物会导致肌肉萎缩和肌肉功能障碍，因此常用于建立肌肉萎缩模型。该研究通过地塞米松诱导构建了体外肌管细胞萎缩模型和小鼠肌少症模型，旨在初步探索犬脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)及外泌体(AMSCs-derived exosome，AMSCs-exo)对肌少症的治疗效果及作用机制。研究结果有望为肌少症的治疗提供新的思路，并为患者带来新的希望。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验、体内药效学实验。
1.2 时间及地点 实验于2022年5月至2023年12月在觅投克(北京)生物医学技术有限公司研发中心、中国科学院过程工程研究所和天津天诚新药评价有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3岁龄健康雌性比格犬1只，体质量约为7.1 kg，购自天津天诚新药评价有限公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0006，动物质量合格证号：20170006000163。8-10周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠35只，体质量22-25 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK (京)2019-0010，动物质量合格证号：11032422110669174。所有小鼠均饲养在天津天诚新药评价有限公司实验动物中心无病原体的环境中，温度(23±2) ℃，湿度50%-60%，12 h光照/12 h黑暗交替循环，保证所有动物能够自由饮水及饮食。
动物实验遵循研究所实验管理条例，且获得天津天诚新药评价有限公司动物关怀及使用委员会(IACUC)批准，批准号为2022092501，严格遵循实验室动物护理和使用指导方针。
1.3.2 实验细胞、试剂 小鼠成肌细胞C2C12(CL-0044，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；生理盐水(2301253402，石家庄四药有限公司，中国)；Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液(DPBS)(B210KJ，上海源培生物科技股份有限公司，中国)；磷酸盐缓冲液(PBS)(B320KJ，上海源培生物科技股份有限公司，中国)；苏木精染液(C220801、C230710，珠海贝索生物技术有限公司，中国)；伊红染液(醇溶性，C221103、C230704，珠海贝索生物技术有限公司，中国)；小鼠用地塞米松(D4902，Sigma，美国)；细胞用地塞米松试剂(D1756，北京兰博利德商贸有限公司，中国)；Ⅱ型胶原酶(C2-BIOC，Sigma，美国)；胎牛血清(C04001-500，VivaCell，德国)；DMEM高糖培养基(C3113-0500，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；马血清(164215，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；0.25%胰酶+EDTA(25200056，Gibco，美国)；青霉素/链霉素(PB180120，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；成脂分化培养基(PD-006，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；成骨分化培养基(PD-007，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；成软骨分化培养基(PD-020，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；成骨细胞矿化结节染色试剂盒(茜素红S法，C0148S，碧云天生物技术有限公司，中国)；阿利新蓝-核固红染色试剂盒(pH2.5，C0155S，碧云天生物技术有限公司，中国)；油红O(0684，北京兰博利德商贸有限公司，中国)；PC5.5-CD73单克隆抗体(561260，BD Pharmingen，美国)；FITC-CD90单克隆抗体(555595，BD Pharmingen，美国)；APC-CD105单克隆抗体(17-1057-42，Thermo Fisher Scientific，
美国)；FITC-MHC-Ⅱ单克隆抗体(11-5909-42，Thermo Fisher Scientific，美国)；FITC-CD14单克隆抗体(MA1-82074，Thermo Fisher Scientific，美国)；FITC-CD19单克隆抗体(11-0193-82，Thermo Fisher Scientific，美国)；FITC-CD34单克隆抗体(11-0341-82，Thermo Fisher Scientific，美国)；FITC-CD45单克隆抗体(11-5450-42，Thermo Fisher Scientific，美国)；兔抗CD9单克隆抗体(A19027，ABclonal，中国)；兔抗CD63单克隆抗体(A19023，ABclonal，中国)；兔抗TSG101单克隆抗体(A5789，ABclonal，中国)；兔抗Calnexin单克隆抗体(A4846，ABclonal，中国)；聚乙二醇(76293，MERCK，德国)；醋酸双氧铀(GZ02625-5，河南欣锐，中国)；RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒[DP451，天根生化科技(北京)有限公司，中国]；反转录试剂盒(F0202A，北京兰博利德商贸有限公司，中国)；2× Realab Green PCR Fast mixture(R0202，北京兰博利德商贸有限公司，中国)。
1.3.3 实验仪器 二氧化碳培养箱(MCO-18AIC，SANYO，日本)；流式细胞仪(CytoFLEX S，BECKMAN COULTER，美国)；水浴锅(XMTD-600，长风，中国)；超净工作台(BSC-1500-II-A2-X，BIOBSAE，中国)；倒置荧光显微镜(XD，SOPTOP，中国)；电泳仪(EPS300，天能，中国)；凝胶成像系统(5200SF，天能，中国)；透射电子显微镜(HT-7700，Hitachi，日本)；小鼠转棒疲劳仪(ZH-YLS-4C，安徽正华生物仪器设备公司，中国)；Nanocoulter G纳米库尔特粒度仪(RESUN-G02，瑞芯智造，中国)；实时荧光定量PCR系统(QuantStudio™ 5，Applied Biosystems，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 犬AMSCs的提取与培养 在无菌手术台上取3岁龄健康比格犬腹股沟处皮下脂肪(1.0-2.0 g)，DPBS清洗后，用已灭菌解剖剪将组织团块剪碎，加入Ⅱ型胶原酶(1 mg/mL)于37 ℃消化1 h，随后1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀再次清洗、过滤后用间充质干细胞培养液重悬，计数后培养，待细胞融合度达80%-90%后传代。
1.4.2 流式细胞术鉴定AMSCs 取1×106第5代AMSCs于若干1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min后弃去上清，向各管中加入200 μL 5%牛血清白蛋白冰上封闭40 min，随后1 000 r/min离心5 min弃去上清，再分别向各管中加入200 μL 1%牛血清白蛋白稀释好的抗体CD73(5 μL/Test)、CD90(5 μL/Test)、CD105(5 μL/Test)、MHC-Ⅱ(5 μL/Test)、CD14(5 μL/Test)、CD19(0.5 μL/Test)、CD34(5 μL/Test)、CD45(5 μL/Test)及对应的同型抗体进行免疫标记反应，混合均匀后冰上孵育40 min，用含0.1%牛血清白蛋白的DPBS洗涤2次，最后用500 μL含0.1%牛血清白蛋白的DPBS重悬细胞，使用CytoFLEX流式细胞仪及FLOWJO分析软件对各样本进行检测及数据分析。
1.4.3 AMSCs三系分化能力 第5代AMSCs以2×104/ cm2密度接种6孔板用于成骨和成脂肪细胞分化实验，待细胞90%融合后换成骨和成脂肪分化培养液，每隔3 d换液，21 d后进行茜素红、油红O染色鉴定。第5代AMSCs以5×105/管密度接种于15 mL离心管用于成软骨分化实验，细胞接种后离心(1 000 r/min，5 min)去上清，用500 μL成软骨分化液重悬，再次离心后放入培养箱进行成软骨分化，21 d后进行阿利新蓝染色鉴定。按照茜素红、阿利新蓝、油红O染色试剂盒说明书操作并拍照观察。
1.4.4 AMSCs-exo提取 收集第5代AMSCs培养上清，以4 500-5 000×g离心25-35 min，沉淀上清液中的细胞碎片，将离心后的上清液转移至新容器中，得到外泌体粗体液，使用微滤膜过滤粗体液，保留滤液，聚乙二醇与水配制成质量浓度180-240 g/L的聚乙二醇水溶液，将聚乙二醇水溶液与滤液1∶1混匀，低温过夜沉淀，24 h后再以8 000-12 000×g离心50-80 min，弃去上清，加入1.5-2.0 mL PBS重悬沉淀，从而得到纯化外泌体，分装后-80 ℃冰箱保存。
1.4.5 AMSCs-exo鉴定 ①外泌体形态：吸取10 μL外泌体滴加在铜网沉淀1 min，滤纸吸去浮液，吸取10 μL醋酸双氧铀滴加在铜网沉淀1 min，用滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，再使用透射电子显微镜观察并拍摄外泌体的形态。②外泌体的纳米粒径分布及浓度：从-80 ℃冰箱中取出外泌体样本，室温融化后，立即低速离心5 s，混匀外泌体悬液，取20 μL外泌体加入到含有980 μL PBS的离心管中，混合均匀，随后使用1 mL注射器吸取稀释后的外泌体悬液进行上样，利用库尔特纳米单颗粒检测技术(电阻脉冲传感法)进行粒径、颗粒浓度检测。③外泌体标志蛋白表达：使用Western blot检测外泌体阳性标志物(CD9、CD63、TSG101)和阴性标志物(Calnexin)的表达。
1.4.6 C2C12肌管萎缩模型与肌管衰老模型的建立 ①肌管萎缩模型：取C2C12细胞(第5-10代)，按5×103/cm2密度接种于6孔板，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，待细胞融合度达80%以上时，更换含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基持续培养6 d后可见肌管分化成型。然后将细胞分4组干预：对照组继续用含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基培养3 d；肌管萎缩组加入100 μmol/L地塞米松诱导3 d；AMSCs组和AMSCs-exo组在加入100 μmol/L 地塞米松的同时加入AMSCs(4×105/孔)或AMSCs-exo(3×109 particles/mL)[AMSCs或AMSCs-exo重悬于2 mL含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基中混合均匀后再加入各孔中]共同孵育3 d，培养结束后镜下观察。②肌管衰老模型：C2C12培养至第25代后，按5×103/cm2密度接种于6孔板，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养至细胞融合度达80%以上时，更换含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基持续培养6 d。然后将细胞分3组干预：衰老对照组再继续用含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基培养3 d；AMSCs组和AMSCs-exo组加入AMSCs (4×105/孔)或AMSCs-exo(3×109 particles/mL) [AMSCs或AMSCs-exo重悬于2 mL含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基中混合均匀后再加入各孔中]共同孵育3 d，培养结束后镜下观察。另外，第5代C2C12细胞按5×103/cm2密度接种于6孔板，在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养至细胞融合度达80%以上时，更换含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基持续培养 6 d，再继续用含体积分数2%马血清的DMEM高糖培养基持续培养3 d，设置为健康对照组。

1.4.7 RT-qPCR检测肌肉萎缩相关基因的mRNA表达 使用RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒分别提取各组C2C12细胞和小鼠胫前肌组织总RNA，随后使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，再使用2× Realab Green PCR Fast mixture在QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR系统上进行qPCR，详细操作见试剂盒说明书。引物序列见表1。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。GAPDH为内参基因，采用2-∆∆Ct方法计算mRNA相对表达水平。

1.4.8 动物分组 C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后，35只小鼠随机分为以下4组：①对照组(n=5)；②模型组(n=10)；③AMSCs腹腔注射治疗组(AMSCs-i.p.组，n=10)；④AMSC静脉注射治疗组(AMSCs-i.v.组，n=10)。除对照组外，其余各组小鼠均进行造模处理。小鼠成功造模后，AMSCs-i.p.组每只小鼠腹腔注射200 μL含1×106个AMSCs的细胞悬液；AMSCs-i.v.组每只小鼠尾静脉注射200 μL含1×106个AMSCs的细胞悬液；对照组和模型组小鼠尾静脉注射等体积的生理盐水。在所有实验结束后，各组小鼠进行CO2安乐死后，收集对应组织进行后续实验。
1.4.9 地塞米松诱导建立肌少症模型 基于WANG等[36]前期研究，并由天津天诚新药评价有限公司进行改良。使用生理盐水提前配制地塞米松溶液(地塞米松使用终质量浓度为1 mg/mL)。将配制好的地塞米松溶液按照20 mL/kg的剂量经由小鼠腹腔注射进行造模，每天按时注射1次，连续注射14 d，通过转棒疲劳实验评估造模效果。
1.4.10 转棒疲劳实验 每日观察各组小鼠的生理状态，在正式检测之前，将动物置于小鼠转棒式疲劳仪中进行模拟适应，经过一两次简单训练(300 s/次)，小鼠可逐渐适应转棒运动。在给药后第7，10，14天进行正式检测，转速由5 r/min开始，匀速增加，直至20 r/min，最长观察300 s。自小鼠在转棒上保持平衡并运动开始计时，直至跌落转棒，记录小鼠的在棒停留时间。实验期间，每只小鼠需重复检测3次，每次检测间隔时间为10 min，最终取平均值进行数据分析。
1.4.11 苏木精-伊红染色 取各组小鼠胫前肌，梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋处理，将蜡块进行切片，切片厚度约为5 μm，切好的薄片置于40 ℃温水浸泡，随后用载玻片装片，石蜡切片晾干后置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，依次置于梯度乙醇(体积分数为100%，95%，85%，70%，50%)中各浸泡5 min，置于蒸馏水中浸泡5 min，共清洗2次，置于苏木精染液中浸泡5 min，使用流水冲洗5 min，使用1%盐酸乙醇分化10 s，用流水冲洗2 min，置于伊红染液中浸泡3 min，将切片依次置于梯度乙醇(体积分数为50%，70%，85%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ，100%Ⅱ)中各浸泡1 min，置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中浸泡5 min，通风橱中晾干各切片，使用中性树胶进行封固，置于显微镜下观察拍照，通过Image J软件标记胫骨前肌横截面积，进行数据分析。
1.5 主要观察指标 ①AMSCs及AMSCs-exo体外抑制肌细胞萎缩能力；②体外肌细胞萎缩相关基因表达；③小鼠转棒疲劳行为能力；④小鼠肌肉组织病理变化；⑤小鼠肌肉萎缩相关基因表达。

1.6 统计学分析 实验数据以均值±标准误(Mean±SEM)表示，使用GraphPad Prism 9.5软件进行统计。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用t检验进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过中国科学院过程工程研究所生物统计学专家审核。

讨论

肌少症是一种典型的老年性疾病，特征为骨骼肌质量、功能和表现显著下降[1，37]。肌少症显著降低了老年人的生活质量，特别是对行动不便和长期住院的患者[38]，也增加了再入院率及死亡率[39]，给患者家庭和社会公共卫生系统带来了巨大的压力。适当规律的运动及营养补充是肌少症的主要治疗方法，但疗效十分有限[40-41]，目前仍缺乏更有效的治疗方式。因此，积极探索具有良好治疗作用的新型疗法，对于肌少症患者具有重要意义。
近年来，间充质干细胞因具有多种生物学活性、低免疫原性、易获取和培养以及在多种疾病中的广泛治疗潜力，成为基础研究和临床应用的热点[42-43]。最新临床研究显示，脐带来源间充质干细胞(ClinicalTrials.gov.注册号：NCT04314011)[15]、骨髓来源间充质干细胞(ClinicalTrials.gov.注册号：NCT03169231[16]，NCT02065245[18-19])均是治疗衰老虚弱的安全有效方法，脂肪来源间充质干细胞(ClinicalTrials.gov.注册号：NCT05827757)对衰老引起的炎症具有良好的治疗作用[17]。在临床前研究中，脐带、骨髓来源间充质干细胞在肌肉相关性疾病中均有报道，但目前仍缺乏脂肪来源间充质干细胞在肌少症中的研究。为了弥补这部分的空白，该研究首次在体内外水平评估脂肪来源间充质干细胞在肌少症中的疗效。该研究从犬脂肪中分离培养出AMSCs，并对AMSCs的特异性标志物及多向分化潜能(骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞)进行了表征及验证，所有结果均符合国际细胞治疗协会(ISCT)提出的间充质干细胞应满足的基本要求[44]，为后续药效研究提供重要支撑。
间充质干细胞主要通过旁分泌反应发挥作用，其中外泌体是主要方式之一。外泌体作为一种潜在的治疗策略，尤其在肌肉修复和再生领域引起了广泛关注。与传统细胞治疗相比，外泌体治疗具有诸多优势，包括低免疫原性、低毒性、无成瘤性、易存储、易运输以及能够在体内广泛扩散等优点[28，45]。最新临床研究显示，骨髓来源间充质干细胞分泌的神经营养因子(ClinicalTrials.gov.注册号：NCT01051882)已用于肌萎缩侧索硬化症(又名渐冻症，临床表现常伴随肌肉萎缩)的Ⅲ期临床研究[46]。在临床前研究中，脐带、骨髓、脂肪来源间充质干细胞外泌体在肌肉相关性疾病中均有报道[11，30，32]；而在肌少症研究中，主要集中于脐带和骨髓来源间充质干细胞外泌体，目前尚缺乏AMSCs-exo的研究。该研究从犬AMSCs的培养液中分离纯化出外泌体，并通过透射电镜、Western blot和纳米颗粒跟踪分析技术对获得的外泌体进行表征与鉴定，结果符合国际细胞外囊泡协会(MISEV2023)提出的外泌体应满足的基本要求[47]，为后续AMSCs-exo研究提供基础。
骨骼肌是人体最大的器官之一，基本结构单元是肌纤维，组成肌纤维的肌管细胞的衰老与萎缩是肌少症研究的核心关注点[13]。该研究显示地塞米松可诱导C2C12肌管萎缩，给予AMSCs和AMSCs-exo可有效促进萎缩肌管的恢复和生长。有研究表明，脐带来源间充质干细胞可通过抗炎、抗凋亡、缓解线粒体损伤来改善骨骼肌萎缩和功能障碍[10]。
NAKAMURA等[31]研究显示，骨髓来源间充质干细胞外泌体也可促进C2C12细胞的增殖与分化。MA等[48]研究表明，脐带来源间充质干细胞外泌体可抑制C2C12肌管萎缩。FIGLIOLINI等[29]发现AMSCs-exo可增强C2C12肌管分化。此外，细胞衰老也是肌少症的主要风险因素，因此该研究也考察了AMSCs及AMSCs-exo对衰老C2C12的影响，结果显示AMSCs及AMSCs-exo均可缓解肌管细胞衰老。
肌少症动物体内研究是评估药物疗效最直接的手段。WANG等[24]通过构建后肢悬挂诱导的小鼠肌少症模型来评估脐带来源间充质干细胞的疗效，发现脐带来源间充质干细胞主要通过恢复骨骼肌耐力、减少细胞凋亡及抑制炎症反应来发挥作用。此外，WANG等[25]通过构建2种肌少症小鼠模型(一种是D-半乳糖诱导的肌少症模型，另一种是SAMP8加速衰老小鼠)来考察脐带来源间充质干细胞的疗效，发现脐带来源间充质干细胞可通过增加细胞外基质蛋白表达、激活卫星细胞、增强自噬及阻碍细胞衰老等机制恢复肌肉力量和功能。该研究构建了地塞米松诱导的小鼠肌少症模型，结果显示通过腹腔和静脉注射给予AMSCs治疗后均可显著增加小鼠的在棒时间，提示给药后可有效增加肌少症小鼠的肌肉耐力；苏木精-伊红染色结果显示通过腹腔和静脉注射给予AMSCs治疗后可显著增加胫前肌肌管面积，该病理变化与增强肌少症小鼠的肌肉耐力直接相关，且2种给药方式无明显差异。WIAFE等[49]研究表明，间充质干细胞通过腹腔或静脉给药后均可有效缓解大鼠膀胱纤维化，且2种给药方式效果类似，但腹腔注射需要更高的给药剂量。该研究首次在地塞米松诱导的小鼠肌少症模型中验证AMSCs的治疗效果，结果显示腹腔和静脉注射等量AMSCs达到了相似的治疗效果，这为后续肌少症研究提供了重要的数据支撑及指导。
MuRF1和Atrogin-1是公认的肌肉萎缩特异性标志物[50]。该研究显示地塞米松诱导的C2C12细胞中MuRF1和Atrogin-1基因表达显著增加，给予AMSCs及AMSCs-exo均可显著抑制MuRF1和Atrogin-1基因表达，这可能与促进肌管生长有密切关系；此外，在地塞米松诱导的小鼠肌少症模型中，模型组小鼠肌肉组织中MuRF1和Atrogin-1基因表达显著增加，腹腔和静脉注射给予AMSCs治疗后均可显著抑制MuRF1和Atrogin-1基因表达，这可能与给药后增加胫前肌肌管面积直接相关。
综上，实验结果表明AMSCs和AMSCs-exo可逆转肌管细胞的萎缩，腹腔注射或静脉注射AMSCs可有效增加肌少症小鼠的肌肉耐力，促进肌肉组织的恢复和生长，作用机制可能与抑制肌肉萎缩基因MuRF1和Atrogin-1的表达有关，这一研究有望为肌少症的疗效探索及后续临床转化提供新的思路和治疗策略。
该研究仍存在一些不足之处：①该研究使用犬AMSCs，无法直接类比说明人源AMSCs的作用，后续将使用人源细胞进行研究；②该研究为AMSCs和AMSCs-exo对肌少症的疗效探索，尚未对分子作用机制进行深入研究；③AMSCs-exo对小鼠肌少症的治疗效果待验证；④AMSCs-exo为复杂成分，尚不清楚该实验条件下外泌体中所含的主要成分及活性物质，需通过高通量测序及体内外实验进行验证。以上问题将在后续研究中进一步补充说明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪来源间充质干细胞及外泌体对地塞米松诱导肌肉减少症小鼠的治疗作用

Therapeutic effects of adipose-derived mesenchymal stem cells and their exosomes on dexamethasone-induced sarcopenia in mice

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