不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.009

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9168-9173.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.009

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不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响

郭丽媛¹^，²^，³，刘维强¹^，²^，³，何文智¹^，²^，³，黎青¹^，²^，³，孙筱放¹^，²^，³

¹广州医学院第三附属医院妇产科研究所，广东省广州市 510150； ²广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150；³广州市生殖与遗传重点实验室，广东省广州市 510150

收稿日期:2012-02-22 修回日期:2012-04-05 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-04-05
通讯作者: 孙筱放，教授，博士生导师，广州医学院第三附属医院妇产科研究所，广东省广州市 510150；广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150；广州市生殖与遗传重点实验室，广东省广州市 510150 xiaofangsun@hotmail.com
作者简介:郭丽媛★，女，1985年生，广东省潮州市人，汉族，广州医学院在读硕士，主要从事生殖遗传与干细胞组织工程的研究。 Liyuan-guo@hotmail.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30871378，U1132005)；广东省医学科研基金资助项目(A2011280)。

Effects of different oxygen tensions on gene expression profiling of human embryonic stem cells

Guo Li-yuan^1,2,3, Liu Wei-qiang^1,2,3, He Wen-zhi^1,2,3, Li Qing^1,2,3, Sun Xiao-fang^1,2,3

¹Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; ²Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; ³Guangzhou Key Laboratory of Reproduction and Genetics, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Received:2012-02-22 Revised:2012-04-05 Online:2012-12-02 Published:2012-04-05
Contact: Sun Xiao-fang, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; Guangzhou Key Laboratory of Reproduction and Genetics, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China xiaofangsun@hotmail.com
About author:Guo Li-yuan★, Studying for master’s degree, Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; Guangzhou Key Laboratory of Reproduction and Genetics, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China Liyuan-guo@hotmail.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30871378*, U1132005*; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. A2011280*

摘要/Abstract

摘要：

背景：低氧培养人胚胎干细胞的相关研究主要集中在干细胞多能性的维持及分化方面，而低氧对人胚胎干细胞基因表达水平的影响研究甚少。
目的：观察不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响。
方法：分别在低氧(体积分数5%O2)和常氧(体积分数21%O2)的条件下持续培养FY-hES-7细胞，收集晚期(第52代)细胞，运用全基因组表达谱芯片技术检测不同氧体积分数组FY-hES-7细胞的基因表达谱，并进行差异基因的功能富集分析及通路分析。
结果与结论：与常氧组相比，低氧组表达上调(>2倍)的基因1 840个，表达下调(>2倍)的基因1 676个。利用基因本体分析发现低氧组表达上调基因与细胞表面受体信号转导、免疫反应、离子转运、生物代谢及细胞活动等功能相关，而表达下调基因则与转录调控，依赖DNA的转录调控、神经分化、细胞形态、胚胎形态、胚胎器官及各系统发育等功能相关。通路分析发现低氧组表达上调的基因与细胞因子受体的相互作用、免疫反应以及造血系统等通路的改变相关，而表达下调的基因则多与胚胎发育及肿瘤通路改变相关。不同氧体积分数下长期培养的人胚胎干细胞基因表达谱存在明显的差异，低氧组出现差异表达基因的功能分析表明低氧有助于人胚胎干细胞的自我更新，防止分化及降低成瘤性。

关键词: 低氧, 氧体积分数, 人胚胎干细胞, 表达谱, 基因通路, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The studies describing culture of human embryonic stem cells under hypoxic condition mainly focus on the maintenance of pluripotency and differenciation. There are few studies regarding the effects of hypoxia on gene expression in human embryonic stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of different oxygen tensions on gene expression profiling of human embryonic stem cells.
METHODS: Gene expression profiling determined by Human Gene Expression Microarrays and differentially expressed genes were analyzed by gene ontology and pathway analysis in one human embryonic stem cell line (FY-hES-7) following prolonged passage under hypoxia (5%O2) and normoxia (21%O2), respectively.
RESULTS AND COCLUSION: 1 840 upregulated genes (more than two folds) and 1676 downregulated genes (more than two folds) were identified in the hypoxic group as compared to the nomorxic group. Gene ontology analysis and pathway analysis showed that gene upregulation in the hypoxic group was associated with cell surface receptor linked signal transduction, immune response, ion transport, metabolic process, cell activation and some pathways such as cytokine-cytokine interaction, immune response, but gene downregulation in the hypoxic group was related to transcription regulation, transcription DNA-dependent regulation, neuronal differentiation, cell morphogenesis, embryonic morphogenesis, embryonic organ and system development and the pathways of embryo development and cancer. The gene expression profiling of human embryonic stem cells in different O2 tensions is variable and the functional analyses of differentially expressed genes in hypoxia are beneficial for human embryonic stem cell culture by keeping stable self-renewal capacity, preventing human embryonic stem cell differentiation and reducing the risk of tumor formation.

中图分类号:

R394.2

郭丽媛，刘维强，何文智，黎青，孙筱放. 不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9168-9173.

Guo Li-yuan, Liu Wei-qiang, He Wen-zhi, Li Qing, Sun Xiao-fang. Effects of different oxygen tensions on gene expression profiling of human embryonic stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9168-9173.

图/表（结果） 6

2.1 人胚胎干细胞形态变化培养第3天，两组FY-hES-7细胞均呈克隆样生长，边缘整齐，与饲养层细胞分界清楚，见图1。

Figure 1 Morphology of FY-hES-7 clones in different O₂ tensions (SP, ×200)

图1 不同氧体积分数组FY-hES-7克隆形态(SP，×200)

2.2 不同氧体积分数组FY-hES-7细胞的基因表达谱差异实验利用Roche-NimbleGen Human Gene Expression Microarrays对不同氧体积分数组FY-hES-7细胞之间基因的表达情况进行对比分析，共发现低氧组比常氧组表达上调2倍以上基因1 840个，其中上调5倍以上者11个，见表1，而表达下调2倍以上基因1 676个，其中下调5倍以上者40个，见表2。 2.5 基因芯片结果的real-time PCR验证验证结果表明基因C4orf17、LOC644286、FBF1、SLC16A3在低氧组中表达明显上调，而基因CDH11、DKK1、EN2、H19、IGFBP5、KRT17、NR2F2、ZBTB16表达明显下调，与芯片结果相似，见表1，2，由此可见实验获得的芯片结果比较可靠。

表1 低氧条件下FY-hES-7比常氧条件下FY-hES-7细胞中表达水平上调(>5倍)的基因

Table 1 Genes up regulated more than five-folds in FY-hES-7 cells cultured under hypoxia compared with FY-hES-7 cultured under normoxia 表2 低氧条件下FY-hES-7比常氧条件下FY-hES-7细胞表达水平下调(>5倍)的基因

Table 2 Genes down regulated more than five-folds in FY-hES-7 cells cultured under hypoxia compared with FY-hES-7 cultured under normoxia

2.3 GO分析结果通过GO分析对不同氧体积分数组细胞中差异表达(>2倍)的基因进行功能归类(P < 0.05)，见表3，4，发现低氧组表达上调的基因与细胞表面受体信号转导(159/1840)，免疫反应(81/1840)，内稳定过程(78/1840)，离子转运(76/1840)，生物代谢及细胞活动等功能相关，而表达下调的基因功能则与转录调控(255/1676)，依赖DNA的转录调控(181/1676)，神经分化(66/1676)，细胞形态(56/1676)，胚胎形态(50/1676)，胚胎器官及各系统发育等相关。

表3 低氧条件下FY-hES-7细胞中表达水平上调(>2倍)基因GO分析的部分结果

Table 3 Part results from gene ontology of genes upregulated more than two-folds in FY-hES-7 cells under hypoxia 表4 低氧条件下FY-hES-7细胞中表达水平下调(>2倍)基因GO分析的部分结果 Table 4 Part results from gene ontology of genes downregulated more than two-folds in FY-hES-7 cells under hypoxia

2.4 KEGG通路分析结果通过对不同氧体积分数组差异表达(>2倍)基因的通路分析，发现对比常氧组，低氧组差异表达基因相关的细胞通路共有14条(P < 0.05)，见表5，6。表5，6可见低氧组中表达上调的基因与细胞因子受体的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)，免疫反应(intestinal immune network for IgA production；antigen processing and presentation)以及造血系统(hematopoietic cell lineage)等通路的改变相关，而表达下调基因则与胚胎发育(Wnt signaling pathway)，肿瘤发生(pathways in cancer；Melanoma；Melanogenesis；TGF-beta signaling pathway；p53 signaling pathway)等通路改变相关。

表5 低氧条件下FY-hES-7细胞中表达水平上调(>2倍)基因相关pathway分类

Table 5 Classification of pathway-related genes whose expression was significantly upregulated (> two folds) under hypoxia 表6 低氧条件下FY-hES-7细胞中表达下调(>2倍)基因相关pathway分类

Table 6 Classification of pathway-related genes whose expression significantly downregulated (> two folds) under hypoxia

参考文献

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引言

材料方法

设计：人胚胎干细胞的表达谱分析。

时间及地点：实验于2011年2至11月在广州医学院第三附属医院妇产科研究所实验部，以及上海康成生物工程有限公司(基因芯片实验)完成。

材料：

实验方法：

细胞培养：人胚胎干细胞(FY-hES-7)由本实验室前期所建立，细胞的建系方法详见已发表的文献^[13]。本实验采用三气培养箱(体积分数5%O₂/体积分数5%CO₂/体积分数90%N₂)建立低氧组的培养条件^[14]，常氧组采用常规CO₂培养箱(体积分数5%CO₂/体积分数21%O₂)培养。不同氧体积分数组细胞各自培养超过10代后收集晚期(第52代)细胞进行后续实验。

细胞总RNA提取：分别收集2组FY-hES-7第52代未分化细胞提取总RNA。基因组总RNA提取及反转录参照PureLinkTM RNA Mini Kit (invitrogen，12183018A)、PrimeScript® RT reagent Kit(Perfect Real Time)(Takara，DRR037S)试剂盒说明书。

基因芯片实验：实验采用上海康成生物技术公司提供的Roche-NimbleGen Human Gene Expression Microarrays检测不同氧体积分数组FY-hES-7细胞的基因表达谱。利用统计学方法比较不同氧体积分数组细胞之间探针杂交荧光强度比值，建立两者之间的基因差异表达谱，筛选出差异表达2倍以上的基因。整个杂交和数据采集实验由上海康成生物技术公司完成。

基因本体(gene ontology，GO)分析与KEGG通路分析：利用DAVID网站(http://david.abcc. ncifcrf.gov)，在线进行差异表达基因的GO分析和KEGG通路分析^[15]，以确定获得的与低氧相关的差异表达基因是否具有特定的细胞功能。

Real-time PCR检测：为了验证芯片的结果，随机选择12个差异表达的基因进行荧光定量PCR。利用Primer Premier 5.0软件进行验证基因的引物设计并在NCBI网站上进行引物序列比对，实验步骤参照SYBR®Premix Ex Tap^TM(Tli RNaseH Plus)说明书。

讨论

基因芯片是用于研究全基因组表达水平的有效工具，已有一些学者利用基因芯片研究人胚胎干细胞的基因表达及分子信号^[11^，^16-17]。随着分子生物学相关学科的迅猛发展，目前科学研究已经进入了功能基因组时代。GO是一个在生物信息学领域中广泛使用的本体。它主要包括3个分支：生物过程、分子功能和细胞组分。GO分析能为基因的功能研究提供重要的信息。基因芯片的数据分析十分复杂，而通过GO分析可以较完整地了解整个微阵列表达谱差异表达基因的信息，为后续的基因功能研究提供有意义的线索^[17]。而通路分析可以获得特定的生物学过程中发生显著变化的通路。 Forsyth等^[11]利用Affymetrix基因芯片比较不同氧体积分数(体积分数21%O₂ vs.体积分数2%O₂)下人胚胎干细胞的基因表达水平，筛选出表达上调的基因302个，下调的基因56个，将这些差异表达基因进行功能归类后，发现上调的基因与信号通路，发育潜能以及新陈代谢的功能相关，并且认为这些与体积分数2%O2培养环境相关的基因改变可以预测人胚胎干细胞用以维持多能性及稳定自我更新的新的细胞要求。

Moon等^[16]利用Applied Biosystems expression arrays检测人胚胎干细胞未分化与分化状态之间的基因表达差异，确定了与干细胞多能性及分化相关的通路。

由于人胚胎干细胞具有一定的异质性，本实验室前期建立的人胚胎干细胞系(FY-hES-7)经过长期的低氧培养后其基因表达谱的变化尚未得知。因此，实验采用Roche的人类全基因组表达谱芯片，检测不同氧体积分数组FY-hES-7的基因表达情况，结果显示大量的基因表达改变大于2倍以上。通过GO分析发现低氧组表达上调的基因与细胞表面受体信号转导，免疫反应，离子转运，生物代谢及细胞活动相关，这表明低氧可能是通过调节大部分的信号通路来促进人胚胎干细胞的自我更新；而表达下调的基因则更多的与转录调控，细胞分化，胚胎形态，胚胎器官及各系统发育等功能相关，这表明低氧培养有助于防止人胚胎干细胞分化，这与先前的研究结果一致^[11]。

低氧转录反应通路包括HIF依赖通路和HIF不依赖通路^[18]。实验在低氧组中没有观察到HIF成员的转录上调，但发现已知HIF依赖目的基因的表达上调，其中ABCB1(2.04倍)、ENIP3(2.78倍)、ENG(2.35倍)、EPO(2.51倍)、NOS2A(3.01倍)、NOS3(3.12倍)、NT5E(2.43倍)、PFKFB4(2.17倍)、TFF3(2.15倍)和HIF控制因子EGLN1(2.36倍)，这表明本实验中低氧条件激活了低氧转录反应通路。

同时，所以利用KEGG pathway分析的结果表明所获得的这些通路在长期低氧培养的人胚胎干细胞中起重要作用。对低氧条件下差异表达基因的确定也进一步阐述了细胞因子受体相互作用通路，钙离子信号通路，肿瘤通路等在低氧培养中的重要性。低氧激发了人胚胎干细胞的免疫相关通路，同时也增强了造血系统通路中相关基因的表达；而低氧组表达下调的基因与胚胎发育以及肿瘤通路相关，其中肿瘤通路中含有本实验低氧组中表达下调的基因42个(P < 0.05，见表6)，而p53信号通路已有研究证实其在人胚胎干细胞的分化中起重要作用^[16]，这表明低氧有助于减少人胚胎干细胞分化，降低细胞应用中人胚胎干细胞的成瘤性问题。

尽管关于低氧对人胚胎干细胞的基因表达所涉及的具体机制，人们了解的还不是很清楚，但实验通过基因芯片筛选出长期低氧培养的人胚胎干细胞与常氧对比的差异表达基因，并进一步利用GO分析和通路分析，对其进行基因功能的归类，从功能基因组学的角度初步阐述了低氧对人胚胎干细胞基因表达谱的影响，表明低氧培养有助于维持人胚胎干细胞的自我更新，防止干细胞分化以及降低成瘤性，为进一步研究低氧对人胚胎干细胞生物学功能的影响提供了基础。

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Effects of different oxygen tensions on gene expression profiling of human embryonic stem cells

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