人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1830

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5293-5299.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1830

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人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定

马晨^1，2，李晓国²，徐明均²，马晓娜²，马晓薇³

¹宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750003；²宁夏人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004；³宁夏医科大学总医院ICU，宁夏回族自治区银川市 750012

修回日期:2019-06-06 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 马晓薇，博士，主任医师，教授，硕士生生导师，宁夏医科大学总医院ICU，宁夏回族自治区银川市 750012
作者简介:马晨，男，1989年生，宁夏回族自治区石嘴山市人，回族，宁夏医科大学在读硕士研究生，主要从事急性呼吸衰竭方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860350)，项目负责人：马晓薇；宁夏自然科学基金(2018A0705)，项目负责人：马晓薇；宁夏高等院校科学研究项目(NGY2017126)，项目负责人：马晓薇

Amplification and identification of human placental mesenchymal stem cells

Ma Chen^{1, 2}, Li Xiaoguo², Xu Mingjun², Ma Xiaona², Ma Xiaowei³

¹School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ²Ningxia Human Stem Cell Institute, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ³Intensive Care Unit, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750012, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Revised:2019-06-06 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Ma Xiaowei, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Intensive Care Unit, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750012, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Chen, Master candidate, School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Human Stem Cell Institute, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860350 (to MXW); the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2018A0705 (to MXW); Scientific Research Project of Ningxia Higher Education, No. NGY2017126 (to MXW)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人胎盘间充质干细胞(hpMSC)：来源于人胎盘胎儿侧中胚层，和其他间充质干细胞一样具有低免疫原性、多向分化、损伤趋化作用，同时其容易获得，为医学科研工作提供了数量可观的间充质干细胞，人胎盘间充质干细胞已运用于多种疾病的科研中并取得了不错的效果。
人胎盘间充质干细胞三系体外诱导分化：体外培养人胎盘间充质干细胞，待细胞稳定后更换细胞培养基，向中胚层细胞诱导分化，即向骨、软骨、脂肪细胞诱导分化，经过21 d的体外诱导分化，分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O进行细胞染色观察人胎盘间充质干细胞向中胚层细胞的分化能力。

摘要
背景：作为组织工程的种子细胞，胎盘间充质干细胞因具有多向分化、低免疫原性、免疫调节等作用，被广泛用于临床疾病的治疗及临床科研中。
目的：根据间充质干细胞的定义来鉴定从宁夏医科大学总医院干细胞研究所获得的人胎盘间充质干细胞，为后续的实验提供可靠的保障。
方法：培养从宁夏医科大学总医院干细胞研究所获得的人胎盘间充质干细胞，观察其在塑料培养皿或培养瓶内的贴壁情况，并间断观察细胞形态发生的变化。将培养的第3代人胎盘间充质干细胞通过流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原，并且用成脂、成骨、成软骨诱导培养基分别诱导21 d后，采用油红O、茜素红、甲苯胺蓝进行细胞染色观察人胎盘间充质干细胞向脂肪、骨，软骨细胞的分化能力。实验方案得到宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准(编号：2018-047)。
结果与结论：①经过体外培养的第3代人胎盘间充质干细胞呈漩涡状贴壁生长，单个细胞呈梭状，形似纤维细胞；②人胎盘间充质干细胞具有特殊的细胞免疫学表型：流式细胞术检测CD105、CD90、CD73呈强阳性表达；造血标记物CD34、CD45、CD14以及HLA-DR呈阴性表达；③人胎盘间充质干细胞在成脂、成骨、成软骨诱导培养21 d后，油红O染色、茜素红染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。提示：根据间充质干细胞的定义，来自宁夏医科大学总医院干细胞研究所的人胎盘间充质干细胞符合间充质干细胞的特性，为后续实验提供良好保证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4313-5768(马晨)

关键词: 人胎盘间充质干细胞, hpMSC, 传代培养, 成脂诱导, 成骨诱导, 成软骨诱导, 流式细胞术

Abstract:

BACKGROUND: As a seed cell for tissue engineering, placental mesenchymal stem cells are widely used in the treatment of clinical diseases and clinical research due to their multi-directional differentiation, low immunogenicity, and immunomodulation.
OBJECTIVE: To identify human placental mesenchymal stem cells from the Stem Cell Research Institute of Ningxia Medical University General Hospital according to the definition of mesenchymal stem cells, and to provide reliable protection for subsequent experiments.
METHODS: The human placental mesenchymal stem cells were obtained from the Stem Cell Research Institute of Ningxia Medical University General Hospital. Cells attached to plastic culture dishes or culture flasks were detected, and cell morphology was observed intermittently. The cultured third-generation human placental mesenchymal stem cells were tested for cell surface specific antigen by flow cytometry, and were cultured in adipogenic, osteogenic and chondrogenic induction media, respectively. After 21 days of induction, Oil red O, alizarin red and toluidine blue were used for cell staining to observe the differentiation ability of human placental mesenchymal stem cells into fat, bone and chondrocytes. The study protocol was approved by the Ethics Committee of Ningxia Medical University General Hospital (approval No. 2018-047).
RESULTS AND CONCLUSION: The third-generation human placental mesenchymal stem cells cultured in vitro showed a vortex-like adherent growth. The single cell was fusiform with fibroblast-like appearance. Human placental mesenchymal stem cells had a special cellular immunological phenotype: CD105, CD90, and CD73 were positively expressed, and CD34, CD45, CD14 and HLA-DR were negatively expressed. The human placental mesenchymal stem cells were induced to differentiate in vitro after 21 days, and were positive for alizarin red, oil red O, and toluidine blue staining. As per the definition of mesenchymal stem cells, human placental mesenchymal stem cells from the Stem Cell Research Institute of Ningxia Medical University General Hospital meet the characteristics of mesenchymal stem cells, providing good guarantee for further experiments.

Key words: human placental mesenchymal stem cells, hpMSC, subculture, adipogenic induction, osteogenic induction, chondrogenic induction, flow cytometry

中图分类号:

马晨，李晓国，徐明均，马晓娜，马晓薇. 人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5293-5299.

Ma Chen, Li Xiaoguo, Xu Mingjun, Ma Xiaona, Ma Xiaowei. Amplification and identification of human placental mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5293-5299.

图/表（结果） 2

2.1 hpMSCs的塑料黏附性及生长形态 复苏培养第3代hpMSCs 24 h后细胞稳定贴壁生长，如图1A，单个细胞呈梭状，1周后细胞融合80%-90%呈漩涡状排列，如图1B。经传代的第4代细胞生长态势良好，大小均一，形态未发生改变，生长5 d细胞融合80%-90%继续传代，如图1C。第5代细胞形态略发生改变，变得细长，如图1D。

2.2 细胞表型分析 流式细胞术分析hpMSCs强烈表达间充质干细胞表面经典特异性抗原CD73、CD90、CD105，阳性率分别为97.6%，98.7%，98.5%；造血标记物CD45、CD34、CD14、HLA-DR呈阴性表达，如图2。

2.3 人胎盘间充质干细胞诱导分化结果

2.3.1 成脂肪细胞诱导分化结果 诱导7 d细胞形态发生改变呈扁圆形，体积增大，胞质中出现少量脂肪滴，如图3A；诱导14 d细胞形态进一步发生改变，胞质中脂肪滴增多，如图3B；诱导21 d显微镜下可见大量脂肪滴，如图3C；21 d阴性组hpMSCs呈梭形贴壁生长，如图3D。成脂肪诱导21 d油红O染色呈阳性，细胞染成红色，细胞核染成蓝色，如图4A；脂肪颗粒染成深红色，如图4B。

2.3.2 成骨细胞诱导分化结果 诱导7 d细胞内胞浆减少，细胞形态明显发生改变，可见少量钙沉积，如图5A；14 d后细胞呈多边形，形态不规则，细胞连接紧密，钙沉积增多，如图5B；21 d细胞呈扁圆形多突起，细胞内几乎无胞浆，细胞与细胞之间缝隙连接，镜下可见散在钙结节，如图5C；阴性组hpMSCs形态未发生明显改变，如图5D。成骨细胞诱导21 d茜素红染色呈阳性，镜下可见橘红色大小不等的钙结节，如图6A，B。

2.3.3 成软骨细胞诱导分化结果 诱导7 d，镜下观察细胞可发现局部区域细胞聚集，细胞形态发生改变，呈不规则排列，如图7A；第14天细胞呈不规则形，多突起，细胞聚集成簇的聚合体，如图7B；第21天局部细胞团块呈球形，多突起，如图7C；阴性组第21天hpMSCs呈梭形，形态未发生明显改变，如图7D。成软骨诱导21 d甲苯胺蓝染色呈阳性，细胞染成蓝色，局部成簇，如图8A；局部呈球状，如图8B。

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引言

间充质干细胞/基质细胞的研究已在许多国家开展，随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，中国也批准了多项临床研究，比如在神经系统疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病以及组织损伤的修复和自身免疫性疾病等领域。以往应用临床研究的间充质干细胞都是骨髓间充质干细胞，通常来自志愿者的髂嵴，该过程为侵入性的有创操作，并且通过穿刺所获得细胞数量有限，需在体外大量扩增后才可以运用至临床研究，但是随着扩增数目的增加细胞的状态会逐渐变差，其效力也会递减^[1-2]。

胎盘作为组织工程的细胞库可以从胚外中胚层分离出数量可观的人胎盘间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells，hpMSCs)，其免疫表型和骨髓间充质干细胞一致，且增殖能力也比骨髓间充质干细胞强^[3]。胎盘来源的间充质干细胞不易发生快速衰老^[4]，同样具有多向分化潜能、低免疫原性、损伤趋化作用“归巢”、组织损伤修复及免疫调节等功能，且hpMSCs的获得不涉及伦理问题^[5]。经过多年的研究hpMSCs在心血管疾病、肺部疾病、肌肉骨骼疾病、肝脏疾病等的科研中已显现出了重要的作用^[4]。此次实验的目的在于根据国际规定的间充质干细胞的定义^[6]：①间充质干细胞具有塑料黏附性；②间充质干细胞表面特异性抗原的表达以及不表达血细胞表面抗原；③间充质干细胞在体外可以向中胚层细胞分化，来验证宁夏医科大学总医院干细胞研究所获得的hpMSCs。通过在一次性塑料培养瓶内对hpMSCs的培养，流式细胞术检测胎盘间充质干细胞表面经典特性抗原CD105、CD90、CD73的表达以及血细胞表抗原CD34、CD45、CD14和HLA-DR的表达^[2，5-9]，并在体外一定条件下将hpMSCs向中胚层细胞：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞诱导分化进行验证^[9]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外实验。

1.2 时间及地点 于2018年9月至2019年1月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 标本来源 胎盘来自宁夏医科大学总医院产科正常产妇，标本收集经过捐献者及家属知情同意。实验经医院医学伦理委员会批准。

1.3.2 主要试剂 荧光基团标记的小鼠抗人单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗CD90抗体(CD90-FITC IgG1)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗CD105抗体(CD105-PE)、PE-cy7标记的抗CD73 抗体(CD73-PEcy7)、FITC 标记的抗 CD34抗体(CD34-FITC IgG1)、FITC标记的抗CD45 抗体(CD45-FITC IgG1)、FITC标记的抗CD14抗体(CD14-FITC IgG2a)，FITC标记的抗HLA-DR抗体(HLA-FITC IgG2a)，同型对照抗体：PE标记的IgG1(IgG1-PE)、FITC标记的IgG2a(IgG2a-FITC)均购自BD公司；间充质干细胞培养基，成脂、成骨、成软骨诱导分化培养基购于STEMCELL公司；PBS购自Gibco公司；油红O、茜素红、甲苯胺蓝染料试剂盒购于Solarbio公司。

1.3.3 主要仪器 FACS AriaII SORP流式细胞仪购自BD公司；3423型8000系列水套式CO₂培养箱购自Thermo公司；CKX41型倒置显微镜购自Olympus有限公司；Q/BKYY32-2000电热恒温水浴锅购自上海跃进医疗器械有限公司；Eppendorf5418型高速离心机购自艾本德中国有限公司。

1.4 方法 所有操作都在超净工作台中进行。

1.4.1 hpMSC的分离与冻存 剪取人胎盘胎儿侧0.5 cm厚组织，用组织剪将其剪碎(体积约1 mm³)，PBS反复漂洗至无色，将胎儿侧组织移入离心管并加入DNA酶Ⅰ1 mg/L以及10 g/L胶原酶Ⅰ，置于37 ℃水浴锅内消化2 h。将消化的组织充分震荡后540×g离心5 s，收集上清液并过滤去除组织块。上清液加入适量完全培养基混匀移入培养皿中，将培养皿置于细胞培养箱中24 h后换液，待细胞融合80%-90%按1∶3进行传代^[10-11]。细胞冻存方法：配制细胞冻存液，体积分数90%FBS加10%DMSO消化细胞并计数，用细胞冻存液重悬细胞并移入细胞冻存管，置于细胞冻存盒-80 ℃冻存，24 h后将细胞冻存管移入液氮中。

1.4.2 hpMSC传代培养 将配好的专用基质胶按1∶27和PBS充分混合，取300 μL均匀覆盖于25 cm²的培养瓶置于4 ℃冰箱内过夜。次日于液氮罐中取出由宁夏医科大学总医院干细胞研究所提供的3代hpMSCs(编号：201810001)，快速将细胞冻存管置于37 ℃水浴锅内快速晃动，待细胞冻存液融化后将其转移到15 mL离心管内并加入hpMSCs专用培养基1 mL。将15 mL离心管置于离心机内340×g离心5 min沉淀细胞，弃去上清液将沉淀的细胞重悬于1 mL hpMSCs培养基中，取10 μL重悬液和等量锥虫蓝混匀于细胞计数板内在显微镜下细胞计数^[12]。向每个培养瓶内接种4×10³细胞并补充hpMSCs培养基4 mL(接种细胞前用PBS冲洗培养瓶3次)充分将细胞摇匀并置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养。以后每隔两三天显微镜下观察细胞贴壁及生长状态，并给予细胞更换培养基、收集培养上清。待单层细胞生长融合80%-90%，用PBS冲洗细胞两三次，每个培养瓶内加入500 μL人胎盘间充质干细胞专用消化液，37 ℃孵育5 min(期间轻轻敲击培养瓶侧壁使细胞充分消化)，待细胞充分消化后立即向培养瓶内加入等量的消化终止液防止细胞过度消化。将消化的细胞移入15 mL离心管并加入少量hpMSCs培养基，340×g离心5 min，重悬细胞再次细胞计数，向每个基质胶包被的75 cm²培养瓶内接种3×10⁵个hpMSCs。待细胞再次长满后留取充足的hpMSC备于后续实验，剩余细胞冻存于液氮罐中。

1.4.3 流式细胞术检测hpMSCs表面特显抗原 将上述继续培养的第4代hpMSCs用PBS冲洗2次，消化细胞(步骤同上)移入15 mL离心管340×g离心5 min弃上清，用PBS 1 mL重悬沉淀的hpMSCs并计数(方法同上)，离心管内加入50 μL小鼠血清进行封闭约30 min之后再次340×g离心5 min，弃去上清，用PBS 2 200 μL重悬封闭的hpMSCs，然后平均的将hpMSCs移入11个EP管中。11个EP分别加入CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、CD14、HLA-DR抗体以及FITC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1、PE-CY7抗体同型对照(避光操作)，冰上孵育30 min后每个离心管加入1 mL PBS再次340×g离心3 min清洗抗体，离心结束弃上清每个EP管用200 μL重悬hpMSCs上机进行流式细胞分析。

1.4.4 hpMSCs的诱导分化

成脂细胞诱导分化：消化培养的第4代hpMSCs、计数，将其接种于12孔板内(12孔板提前基质胶包被过夜)，标记为成脂诱导分化并记录时间。12孔板内设3个阳性组，1个阴性组，每孔接种6×10³个细胞，每孔添加hpMSCs培养基2 mL。48 h后细胞贴壁生长，单层融合80%-90%，阳性组更换成脂诱导培养基，阴性组更换hpMSCs培养基。以后每两三天更换1次诱导培养基，并显微镜下观察细胞形态变化，共诱导培养21 d。21 d后按油红O染色剂说明进行细胞染色。

成骨细胞诱导分化：选择第4代hpMSCs，将其接种于12孔板内(12孔板提前基质胶包被过夜)，标记为成骨导分化并记录时间，设3个阳性组，1个阴性组，每孔接种8×10³个细胞，每孔添加hpMSCs培养基2 mL。48 h后单层hpMSCs融合约90%，阳性组给予更换成骨诱导分化培养基。以后每两三天更换1次诱导培养基，并显微镜下观察细胞形态变化，共诱导培养21 d。21 d后按茜素红染色剂说明进行细胞染色。

成软骨细胞诱导分化(微球法)：选择第4代hpMSCs，将其接种于12孔板内(12孔板提前基质胶包被过夜)，标记为成软骨导分化并记录时间，设3个阳性组，1个阴性组，每孔接种2×10⁶个细胞，每孔添加hpMSCs培养基3 mL。48 h后hpMSCs生长状态稳定，阳性组给予更换成骨软诱导分化培养基。以后每两三天更换1次诱导培养基，并显微镜下观察细胞形态变化，共诱导培养21 d。21 d后按甲苯胺蓝染色剂说明进行细胞染色。

1.5 主要观察指标 ①hpMSCs形态；②流式细胞术检测hpMSCs表面抗原；③hpMSCs成脂、成骨、成软骨三系诱导分化情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞作为未来治疗的希望细胞实际上存在于所有组织中^[13]，包括骨髓、脂肪组织^[14-15]、肝脏^[16]、牙周韧带^[17]、毛囊^[18]、脐带脐血^[19]、羊水等^[20]，最常用于临床研究以及治疗作用的间充质干细胞来自于骨髓，骨髓间充质干细胞的收集是侵入性的过程，一次操作获得细胞数量有限，且个体差异难以控制。令医学界兴奋的是胎盘能为医学研究提供丰富的间充质干细胞^[8，21-23]，且安全性较高，易于获得，体外扩增力强，不易衰老。hpMSCs源于胎盘中胚层^[24]，同样具有低免疫原性、免疫调节、多向分化、旁分泌、损伤趋化等功能，且其获得以及实验、临床应用不涉及复杂伦理问题^[5]。尤其间充质干细胞对机体的免疫调节功能近年来备受人们关注。间充质干细胞可通过细胞间接触以及可溶性细胞因子对T 、B淋巴细胞，NK细胞和树突状细胞产生免疫调节作用^[25-26]。近年来研究表明人胎盘胎儿侧组织分离的间充质干细胞可通过抑制T细胞的增殖来调节免疫功能^[27]，并且Zhang等^[28]研究表明hpMSCs的免疫调节与miR-25的上调有关。尽管大量文献报道hpMSCs在临床前或临床试验以及动物实验中获得很好的治疗效果，但在实际的研究中也存在诸多因素导致实验失败或实验结果不理想，在多次的反复实验中可能有一次的实验结果是令人满意的。其中一个非常重要的因素就是间充质干细胞在培养传代中由于各种各样原因导致了其特性的丧失或消减，换言之间充质干细胞已不是原来的间充质干细胞变成了另外一种细胞。比如间充质干细胞在无限的传代培养下它会出现衰老^[29]、自主分化、变异等情况；有研究表明在体外培养的hpMSC随着扩增代数的不断延长细胞会出现老化，生长速度减慢^[30]，且第5代以后的细胞诱导分化的特点明显减弱^[31]，若选用这些细胞来进行实验必定增加诸多不利因素。在用hpMSCs进行实验前按国际定义来验证选用细胞的可靠性或hpMSCs是否还具有间充质干细胞的特性已成为实验过程一个不可缺少的环节。

宁夏医科大学总医院干细胞研究所科研团队致力于研究hpMSCs多年，对hpMSCs的分离有着丰富的经验，研究所实验设备齐全为实验提供了很好的平台。作者对研究所提供的编号为20180001的人胎盘间充质干细胞培养发现，复苏的第3代细胞24 h后就可以稳定贴壁生长，大约经过7 d单层细胞融合80%-90%，细胞群呈漩涡状排列，单个细胞成梭形，大小均一，并可以1︰3传代。经传代的第4代细胞同样长势良好，细胞形态、结构无改变；遗憾的是第5代细胞增殖速度有所减缓(排除培养基营养成分分解)，且细胞形态有所改变，整体细胞体积稍增大，细胞变得狭长。总的来说，体外扩增的hpMSCs具有塑料黏附性，符合间充质干细胞标准的第一条。根据定义第二条间充质干细胞表面存在特异性抗原，不表达血细胞表面标记物^[5，32]：尽管还没有明确报道hpMSCs表面特异性抗原，但通过对第4代hpMSCs进行流式细胞分析发现其强烈表达间充质干细胞经典的表面特异性抗原CD73，CD105，CD90，阳性率分别为97.6%、98.7%、98.5%，造血标记物CD45、CD34、CD14以及HLA-DR呈阴性表达，这一结果的出现使得作者对后续的实验充满了信心。多年来人们对间充质干细胞的研究有了深入的了解，用流式细胞术检测其表面抗原已成为鉴定间充质干细胞可靠方法，但是大量文献报道，不同间充质干细胞检测到的表面抗原各不相同。2006年国际细胞疗法协会(ISCT)和干细胞委员会提出了一套标准，用于为基于实验室的科学研究和临床前研究定义人类间充质干细胞^[6]：统一间充质干细胞表面表达CD73，CD105，CD90不表达CD45、CD34、CD14、HLA-DR，这一结果这也是验证hpMSCs特性最为重要的一点。这里特别强调的是，为了保证实验结果不受干扰，所选的是扩增的第4代细胞而不是代次更靠后的细胞，因为在对hpMSCs的传代培养过程中发现第5代细胞已开始出现细胞形态的改变。最后根据定义，间充质干细胞在体外必须具有向中胚层细胞分化的能力^[1，33-34]。通常科研工作者会采用双普系或三系分化测定。双普系是指将间充质干细胞向脂肪和骨细胞诱导分化，三系则是多了向软骨细胞的诱导分化，对验证细胞的分化能力更具说明性^[1]。在此次实验中采用的是三系诱导分化，结果和预想的一样，三系细胞经历21 d的分化过程中形态逐步发生了改变，最终的细胞染色结果也和以往文献报道以及染色说明书所说的阳性的结果一致，这就说明hpMSCs具有多分化能力，符合间充质干细胞特性。

综上所述，作者在前期的实验过程中对hpMSCs的验证得到了满意的结果，为后续细胞共培养实验打下良好的基础，并且能为实验排除更多的干扰因素确保实验的顺利进行。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定

Amplification and identification of human placental mesenchymal stem cells

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