人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞干预糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合及Wnt/β-catenin信号表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1838

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人参皂苷：为中药三七与人参内所提炼出人参皂苷类单体，为固醇类化合物，三萜皂苷也是人参内主要的生物活性成分。人参总皂苷有抑制炎症反应、组织钙离子内流及改善微循环等多种影响，对机体免疫功能、代谢及心血管等有广泛药物作用。
糖尿皮肤溃疡：为糖尿病并发症之一，其反复发作，迁延不愈，易形成顽固且难愈性溃疡，若临床治疗不当还易向深部发展，导致患者截肢。糖尿病皮肤溃疡患者的皮肤组织内存在大量晚期糖基化终末产物，可引起组织细胞学变化。

摘要
背景：以往研究表明骨髓间充质干细胞在促进创面愈合方面已经取得了一定成效，能明显促进创面皮肤的恢复，但关于基因及药物调控的相关研究目前尚未取得突破性进展。
目的：分析人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡大鼠愈合作用及其对Wnt/β-catenin信号表达的影响。
方法：选取SPF级Wistar雄性大鼠61只，其中1只行骨髓间充质干细胞培养，另外60只随机数字表法将模型大鼠分成4组，空白组、糖尿病皮肤溃疡组、骨髓间充质干细胞组及人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组，除空白组，其他各组大鼠制备糖尿病皮肤溃疡模型，造模后6 h糖尿病皮肤溃疡组和空白组大鼠由尾静脉注入1 mL细胞培养液，骨髓间充质干细胞组注入1 mL骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.0×10⁹ L^-1)，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组注入1 mL人参皂苷诱导分化骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.0×10⁹ L^-1)。实验方案经已于2016年12月获得解放军二五一医院动物伦理学委员会批准开展进行，批准号：20161211。
结果与结论：与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α含量上升，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子含量下降；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组及人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α含量下降，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子含量上升；与骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白含量下降，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子含量上升；与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠成纤维细胞数和新生毛细血管数密度下降；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠成纤维细胞数和新生毛细血管数密度上升；与骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠成纤维细胞数和新生毛细血管数密度上升；与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠Wnt4及β-catenin mRNA表达上升；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组、人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠Wnt4及β-catenin mRNA表达下降；与骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠Wnt4及β-catenin mRNA表达下降。提示人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞可显著降低糖尿病皮肤溃疡大鼠血清炎性因子含量，提升生长因子含量，下调Wnt/β-catenin信号路径内相关蛋白表达加速创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7725-9251(马红伟)

关键词: 糖尿病皮肤溃疡, 创面愈合, 骨髓间充质干细胞, 人参皂苷, 成纤维细胞数, 毛细血管密度, 炎症细胞因子, Wnt/β-catenin信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells can certainly promote wound healing, and considerably accelerate the recovery of wound skin. However, relevant research on gene and drug regulation has yet to make breakthrough progress.
OBJECTIVE: To analyze the effects of ginsenoside-induced bone marrow mesenchymal stem cells on skin healing of rats with diabetic skin ulcer and their effects on Wnt/β-catenin signaling.
METHODS: Sixty-one SPF-level Wistar male rats were selected, one of them was used for the culture of bone marrow mesenchymal stem cells, and the other 60 were randomized into four groups: blank control group, model group (treated with 1 mL of culture medium via tail vein), single cell treatment group (treated with 1 mL of bone marrow mesenchymal stem cell suspension via tail vein, 2.0×10⁹/L) and ginsenoside-induced cell treatment group (treated with 1 mL of ginsenoside-induced bone marrow mesenchymal stem cell suspension via tail vein, 2.0×10⁹/L). Animal models of diabetic skin ulcer were made in all groups except the blank control group. Treatments in each group were performed at 6 hours after modeling. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of the 251st Hospital of PLA with approval No. 20161211 in December 2016.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the serum levels of interleukin-1, high-sensitivity C-reactive protein and tumor necrosis factor-α increased and the serum levels of platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor and basic fibroblast factor decreased in the model group. Compared with the model group, the serum levels of interleukin-1, high-sensitivity C-reactive protein and tumor necrosis factor-α decreased significantly and the serum levels of platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor and basic fibroblast factor increased significantly in the single cell treatment and ginsenoside-induced cell treatment groups. Compared with the single cell treatment group, the serum levels of interleukin-1, high-sensitivity C-reactive protein and tumor necrosis factor-α decreased significantly and the serum levels of platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor and basic fibroblast factor increased significantly in the ginsenoside-induced cell treatment group. Compared with the blank control group, the number of fibroblasts and density of newly born capillaries decreased in the model group. Compared with the model group, the number of fibroblasts and density of newly born capillaries increased in the two cell treatment groups. Compared with the single cell treatment group, the number of fibroblasts and density of newly born capillaries increased in the ginsenoside-induced cell treatment group. Compared with the blank control group, the expression of Wnt4 and β-catenin mRNA increased in the model group. Compared with the model group, the expression of Wnt4 and β-catenin mRNA decreased in the two cell treatment groups. Compared with the single cell treatment group, the expression of Wnt4 and β-catenin mRNA decreased in the ginsenoside-induced cell treatment group. These findings therefore indicate that ginsenoside-induced bone marrow mesenchymal stem cells considerably reduce the levels of serum inflammatory cytokines, increase the level of growth factors, and downregulate the expression of related proteins in the Wnt/β-catenin signaling pathway to accelerate wound healing.

Key words: diabetic skin ulcer, wound healing, bone marrow mesenchymal stem cells, ginsenosides, fibroblast number, capillary density, inflammatory cytokines, Wnt/β-catenin signaling pathway

中图分类号:

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图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞形态 培养至第5天培养瓶底能够看到细胞分布，为三角形或者菱形，集落数量明显变多，胞体透亮。在培养10-14 d时，细胞集落融合为单层，集落细胞不断扩增，胞体细长，为放射状扩展，部分细胞为宽大扁平状况，表现是纤维细胞样，可看到突起多个长胞浆。伴随传代次数增多，倒置显微镜观察细胞形态可见贴壁细胞分布均匀，形态基本一致，主要为梭形，其胞体饱满，骨髓间充质干细胞一致性好，见图1。同时，流式细胞术检测其纯度显示，CD45为阴性，阳性率为0.615%，稳定表达CD29、CD90，其阳性率均在97%以上，见图2。

2.2 人参皂苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，随人参皂苷含量增加，细胞数量也逐步变大，在人参皂苷质量浓度为120 mg/L时，细胞增殖最为显著，见图3。因此后续选用120 mg/L的人参皂苷进行骨髓间充质干细胞诱导。

2.3 实验动物数量分析 在实验过程中各组大鼠未发生意外死亡等事件，各组大鼠均进入结果分析。

2.4 人参皂苷诱导的骨髓间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡大鼠肉芽组织病理形态的影响 苏木精-伊红染色结果显示，空白组有大量成纤维细胞，核仁深染，胞浆多，炎性细胞较少；糖尿病皮肤溃疡组存在大量淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞，新生毛细血管及成纤维细胞较少；人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组成纤维细胞较多，核仁着色明显，胞浆多，炎性细胞较少；骨髓间充质干细胞组成纤维细胞较人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组少，胞浆突起不明显，胞体外形小，炎性细胞少，见图4。

2.5 人参皂苷诱导的骨髓间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡大鼠血清生长因子及炎性因子的影响 与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α水平上升(P < 0.05)，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子水平下降(P < 0.05)；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组和人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α水平下降(P < 0.05)，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子水平上升(P < 0.05)；与骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素1、超敏C-反应蛋白水平下降(P < 0.05)，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维因子水平上升(P < 0.05)，见表1。

2.6 人参皂苷诱导的骨髓间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡大鼠肉芽组织中成纤维细胞数和毛细血管密度量的影响 在400倍高倍镜视野下观察结果显示，与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠肉芽组织中成纤维细胞数和新生毛细血管数密度下降(P < 0.05)；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组、人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠肉芽组织中成纤维细胞数和新生毛细血管数密度上升(P < 0.05)；与骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组肉芽组织中大鼠成纤维细胞数和新生毛细血管数密度上升(P < 0.05)，见表2，图5。

2.7 人参皂苷诱导的骨髓间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡大鼠肉芽组织内Wnt4及β-catenin mRNA表达水平的影响 与空白组相比，糖尿病皮肤溃疡组大鼠肉芽组织内Wnt4及β-catenin mRNA表达水平上升(P < 0.05)；与糖尿病皮肤溃疡组相比，骨髓间充质干细胞组和人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠肉芽组织内Wnt4及β-catenin mRNA表达水平下降(P < 0.05)；和骨髓间充质干细胞组相比，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠肉芽组织内Wnt4及β-catenin mRNA表达水平下降(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年1月至2018年6月在解放军二五一医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验大鼠 SPF级雄性Wistar大鼠61只，鼠龄6周，体质量90-110 g，平均(103.62±8.07) g，购自成都达硕实验动物公司，许可证号：SCXK(川)2018-27。常规饲养1周后开始实验，大鼠分笼饲养，每笼5只，室温维持22-26 ℃，相对湿度55%-65%，昼夜循环，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加饲料及换水等均有专人进行。大鼠饮用水为灭菌纯水，高糖高脂饲料(10%猪油，20%蔗糖，2.5%蛋黄与67.5%普通饲料)与普通饲料购自成都达硕实验动物公司。实验操作过程中对动物处置方法符合动物伦理学规定，已于2016年12月获得解放军二五一医院动物伦理学委员会批准开展进行，批准号：20161211。

1.3.2 实验用主要试剂与仪器 人参皂苷购自中国药品生物制品检定所，链脲佐菌素、MTT购自美国Sigma公司，白细胞介素1、超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子及碱性成纤维因子试剂盒购自上海联硕生物公司，免疫组化CD34、增殖细胞核抗原试剂盒购自北京中衫金桥生物公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，DMEM培养基、BrdU购自美国GIBCO公司，PCR扩增仪(型号：PE9600)由美国PE公司生产，病理组织漂烘仪(型号：PHY-Ⅲ)由常州中威电子仪器厂生产，转轮式切片机(型号：莱卡-2016)由德国莱卡公司生产，包埋机(型号：BMJ-Ⅲ)、全自动封闭式组织脱水机(型号：TSJ-Ⅱ)由常州中威电子仪器厂生产，荧光显微镜(型号：BM-21AY)由日本OLYMPUS公司生产，酶联免疫监测仪(型号：MULTISKAN GO)由美国Thermo公司生产。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞培养 随机处死1只大鼠，浸入体积分数75%乙醇内消毒12 min。无菌条件下选取股骨与两侧胫骨，剪除骨端，提取骨髓间充质干细胞。体外骨髓间充质干细胞培养融合至80%后换液，在加入含有终浓度为20 mmol/L BrdU的培养基标记。

1.4.2 MTT检测人参皂苷对骨髓间充质干细胞增殖影响 选取培养第5代骨髓间充质干细胞，制备为细胞悬液，接种至96孔板内，每孔1.0×10⁴个，对照组则每孔加入培养液100 mL，人参皂苷诱导分化骨髓间充质干细胞组分别加入20，40，80，120，160及200 mg/L的人参皂苷100 mL，放置在含体积分数5%CO₂、37 ℃饱和湿度孵育箱内，培养7 d后，每孔加入20 μL 0.25%MTT溶液(5 g/L PBS配制MTT，pH值为7.4)，培养4 h后倒掉上清液，每孔加入二甲基亚砜150 mL，振荡器内震荡8 min，充分溶解结晶物。酶联免疫监测仪检测570 nm波长处吸光度。

1.4.3 人参皂苷促进骨髓间充质干细胞诱导分化 选取5代骨髓间充质干细胞行诱导分化，以细胞浓度2.5×10⁸L^-1接种至6孔培养板内，在细胞融合80%时，去培养液，再加入完全培养液(含10 mg/L碱性成纤维细胞生长因子)预诱导24 h，PBS冲洗3次，更换为无血清培养液(含120 mg/L人参皂苷)诱导；对照组采用完全培养液进行培养。观察细胞形态改变。

1.4.4 制备糖尿病皮肤溃疡模型 随机选取45只大鼠采用高脂高糖饲料喂养1个月，腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素制备糖尿病模型，5 d后检测大鼠血糖，血糖水平在20-33 mmol/L为符合标准糖尿病大鼠^[11]。成模后大鼠背部脱毛区域内采用龙胆紫标记造模面积，无菌下剪开造模区皮肤，深至筋膜，而后使用6层医用纱布将创面覆盖，包扎固定。
1.4.5 细胞移植与药物治疗 随机数字表法将模型大鼠分成3组：糖尿病皮肤溃疡组、骨髓间充质干细胞组及人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组，各15只。另取15只大鼠作为空白组。造模后6 h，糖尿病皮肤溃疡组大鼠经尾静脉注入1 mL细胞培养液，骨髓间充质干细胞组注入1 mL骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.0×10⁹ L^-1)，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组注入1 mL人参皂苷诱导分化骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.0×10⁹L^-1)。

1.4.6 苏木精-伊红染色检测肉芽组织病理变化 给药后10 d，大鼠腹腔注射8 mL/kg的2.4%水合氯醛麻醉后断颈处死，选取创面中心位置肉芽组织，缓冲液冲洗，体积分数10%甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后制备为厚度4 mm切片，常规行苏木精-伊红染色，显微镜下观察各组大鼠肉芽组织病理情况。

1.4.7 ELISA法检测血清炎症因子水平 给药后10 d，采集大鼠腹主动脉血清5 mL，ELISA法检测白细胞介素1、超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子α、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子及碱性成纤维因子含量，具体步骤依据试剂盒说明书进行。

1.4.8 免疫组化染色检测大鼠肉芽组织内毛细血管及成纤维细胞数量 取大鼠肉芽组织，经石蜡切片后，性免疫组化染色，依次行脱蜡、内源性酶灭活、热修复抗原并滴加CD34、增殖细胞核抗原单克隆抗体，DAB显色，复染，脱水，透明后封固。光镜下观察。

1.4.9 实时PCR检测大鼠肉芽组织内Wnt4及β-catenin mRNA表达水平 Trizol法提取大鼠肉芽组织总RNA行实时PCR扩增，Wnt4上游引物5'-GAT TGA GAT GAT TTT GGA G-3'，下游引物5'-GTA TGT TAA GTA TAT GAT TG-3'，扩增片段是482 bp；β-catenin上游引物5'-GAA TTG CGC GAT GTA GTA CG-3'，下游引物5'-GTT GTA CTG TAC TAG GTG CT-3'，扩增片段531 bp。PCR反应条件：94 ℃下45 s，55 ℃下50 s，72 ℃下75 s，在40次循环以后获取Wnt4 mRNA、β-catenin mRNA循环阈值(Ct)，使用??Ct(??Ct=?Ct目的基因-?Ct内参基因)分析，算出2^-^??Ct目的基因相对表达量。

1.5 主要观察指标 糖尿病皮肤溃疡肉芽组织病理变化、血清炎症因子水平、肉芽组织内毛细血管及成纤维细胞数量以及Wnt4及β-catenin mRNA表达水平。

1.6 统计学分析 用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料x(_)±s表示，t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞为骨髓内非造血干细胞内一类重要干细胞，获取容易，方便在体位进行增殖培养，其自我复制能力较强且有多向分化潜能，骨髓间充质干细胞加速创面愈合机制可能为①骨髓间充质干细胞可将更多地促创面愈合细胞因子与生长因子释放^[12-13]；②加速胶原合成和肉芽组织生长，进而使创面愈合加快；③骨髓间充质干细胞有免疫调节作用，可形成细胞因子对T细胞增殖和免疫反应有抑制作用，起到免疫重建影响^[14-16]。有研究将异体鼠内所获取有绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞注入有外部创伤的BN小鼠中，说明异体骨髓间充质干细胞可移行至创面并使皮肤细胞分化加速创面愈合^[17]。相关研究显示，远端骨髓间充质干细胞在创面受损中可加速血管内皮生长因子、局部胶原和成纤维细胞生长因子的生长^[18-20]。

中医学古籍中虽然没有关于糖尿病皮肤溃疡专名，但依据其临床表现可归于“消渴”“脱疽”等范畴内，其主要病机为外感湿热、瘀血阻络及气阴亏虚。人参皂苷为中药三七与人参内所提出人参皂苷类单体，为固醇类化合物，三萜皂苷也为人参内主要的生物活性成分。人参总皂苷有抑制炎症反应、组织钙离子内流及改善微循环等多种影响，对机体免疫功能、代谢及心血管等有广泛药物作用^[21-23]。

相关研究显示，糖尿病溃疡形成机制主要为细胞功能异常，特别是中性粒细胞与成纤维细胞，高血糖对于此类细胞也具有毒性影响，造成患者更易出现感染^[24-26]。多数专家均认为骨髓间充质干细胞分化成何种细胞和其所在微环境有紧密联系^[27-28]。创面愈合中成纤维细胞为主要功能细胞，在皮肤受损以后，激活了创缘的真皮成纤维细胞出现转分化，胞质内有收缩功能张力纤维出现，加速创面愈合。但在糖尿病溃疡创面组织内成纤维细胞形态发生改变，这可能和局部创面聚集大量炎性递质和细胞凋亡参与了创面愈合延迟有联系^[29-31]。超敏C-反应蛋白为非特异性炎症标志物，是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。肿瘤坏死因子α一般由巨噬细胞与单核细胞所形成，起生物效应较多，不但可使中性粒细胞吞噬功能加强，还可对肝脏产生影响，分泌超敏C-反应蛋白量增大。白细胞介素1为内分泌激素，可将全身炎症反应激发，机体表现出应激状况，对免疫系统细胞有调节影响^[32-33]。此次实验结果显示，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞组大鼠血清炎性因子含量显著降低，说明人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞可控制炎症递质的过度释放，降低炎症反应程度，加速创面愈合。血管内皮生长因子利于毛细血管融合为较大血管，调节血管内皮细胞迁移与增殖、加速形成新生毛细血管^[34]。血小板衍生生长因子主要由内皮细胞和巨噬细胞等释放，可当做组织修复细胞，促进细胞增殖，加速伤口愈合^[35]。创面愈合中，形成的肉芽组织有重要作用，可直接对创面愈合和预后产生影响。肉芽组织本质为大量新生毛细血管与丰富成纤维细胞。丰富新生毛细血管可使创面微循环改善，促进创面新陈代谢，为修复组织提供丰富营养物质与所需的氧^[36-37]。成纤维细胞在皮肤受损后，激活了创缘真皮成纤维细胞并发生转化，胞质出现有收缩功能的强力纤维，加速创面愈合^[38]。目前，相关研究已经验证，Wnt/β-catenin信号路径异常活化不但在多囊肾病、肾小管损伤修复等疾病的发生与进展中有重要影响，还和机体内多个组织器官的纤维化发展联系紧密。Wnt蛋白能够使胞浆中β-catenin降解阻滞，造成胞核中β-catenin含量上升，和结合基因特异性转录因子LEF1/TCF导致靶基因转录，引起上皮间质转换^[39-40]。此次实验显示，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞可下降大鼠肉芽组织内Wnt4以及β-catenin mRNA表达，起到抗纤维化影响。

综上所述，人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞可显著降低糖尿病皮肤溃疡大鼠血清炎性因子含量，提升生长因子含量，下调Wnt/β-catenin信号路径内相关蛋白表达加速创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程