荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成骨诱导及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1643

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1359-1363.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1643

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成骨诱导及鉴定

陈钰萌^1，2，韩哲先^1，2，刘迎春^1，2，高峰³

¹内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010018；²内蒙古自治区生物制造重点实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018；³内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010018

修回日期:2018-12-16 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 高峰，博士，教授，内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010018
作者简介:陈钰萌，女，1994年生，山东省济宁市人，在读硕士，主要从事干细胞信号通路方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31160445)，项目负责人：刘迎春

Osteogenic induction and identification of mammary stem cells derived from a Holstein dairy cow

Chen Yumeng^{1, 2}, Han Zhexian^{1, 2}, Liu Yingchun^{1, 2}, Gao Feng³

¹College of Life Sciences, ³College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Key Laboratory of Biological Manufacturing of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2018-12-16 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Gao Feng, MD, Professor, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Chen Yumeng, Master candidate, College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China; Key Laboratory of Biological Manufacturing of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31160445 (to LYC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
乳腺干细胞：DeOme等在1959年的研究中发现，将乳腺上皮组织移植到乳腺中即可产生完整乳腺组织，即表明乳腺上皮组织中有干细胞存在；随后，Shackleton等报道了单个乳腺细胞能够发育成完整乳腺，印证了乳腺干细胞的存在。乳腺干细胞是一种成体干细胞，由多种类型上皮细胞组成，在乳腺组织发育中起到关键作用。在动物青春期和怀孕阶段，乳腺干细胞迅速得到活化，自主更新非常活跃，这对于不同时期的乳腺生长与重建具有重要意义。正常情况下乳腺干细胞处于不分裂的静息状态，但在体外环境中，根据诱导条件不同可分化为多种不同细胞，例如乳腺上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等。
奶牛乳腺的生长发育：动物的乳腺是一种能够反复经历发育、功能分化和退化的组织，早在胚胎期乳腺就己经开始发育。奶牛的乳腺发育经过胚胎期、青春期前、青春期后、妊娠期、泌乳期及干乳期6个时期，这一过程是奶牛泌乳性能发挥的决定性过程。然而在乳腺的生长发育过程中，乳腺干细胞对于青春期、妊娠期、泌乳期和泌乳衰退期的乳腺生长与重建具有重大意义。

摘要
背景：课题组已经完成乳腺干细胞向神经细胞和脂肪细胞的诱导，该实验诱导乳腺干细胞分化为成骨细胞，进一步丰富其分化潜能多样性，对乳腺干细胞的研究具有重要意义。
目的：探讨荷斯坦奶牛乳腺干细胞定向诱导分化为成骨细胞的潜能。
方法：分离纯化的荷斯坦奶牛乳腺干细胞系，由内蒙古生物制造重点实验室提供。取第4代乳腺干细胞加入成骨诱导液培养21 d，采用茜素红染色法和RT-PCR技术进行鉴定。
结果与结论：荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成骨诱导后，细胞边缘模糊，细胞中有颗粒状钙化结节出现，经茜素红染色呈阳性，诱导后成骨细胞标记性基因Alpl和Bglap呈阳性表达，表明了荷斯坦奶牛乳腺干细胞具有分化为成骨细胞的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9891-2715(陈钰萌)

关键词: 荷斯坦奶牛, 乳腺干细胞, 成骨诱导分化, 成骨细胞, 成骨标记基因, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The isolated and purified mammary stem cells from Holstein dairy cows have been induced to differentiate into nerve cells, adipocytes and osteoblasts, further enriching their multi-directional differentiation potential, which is of great significance for the study on mammary stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the osteogenic potential of mammary stem cells from Holstein dairy cows.
METHODS: Mammary stem cells from Holstein dairy cows were isolated and purified, which were provided by the Key Laboratory of Biological Manufacturing of Inner Mongolia Autonomous Region. The fourth generation of mammary stem cells were cultured for 21 days in an osteogenic induction medium, and identified by alizarin red staining and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After osteogenic induction, the cell edge was indistinct, and there were some granular calcified nodules in the cells. The induced cells were positive for alizarin red staining. The positive expressions of Alpl and Bglap in the induced osteoblasts were detected, indicating that the mammary stem cells from Holstein dairy cows have the potential to differentiate into osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cattle, Mammary Glands, Animal, Stem Cells, Cell Differentiation, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

陈钰萌，韩哲先，刘迎春，高峰. 荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成骨诱导及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1359-1363.

Chen Yumeng, Han Zhexian, Liu Yingchun, Gao Feng. Osteogenic induction and identification of mammary stem cells derived from a Holstein dairy cow[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1359-1363.

图/表（结果） 4

2.1 乳腺干细胞复苏、传代后的细胞形态 乳腺干细胞解冻培养后，生长活性较好，隔天贴壁，2 d后细胞长至50%-60%融合，乳腺干细胞呈铺路石状生长，细胞多且密集生长；转到高倍显微镜下观察，发现每个乳腺干细胞中都有多个细胞核，且细胞核占细胞比例较大，这符合干细胞生长特性，即核质比大，可见细胞尚处于明显的幼稚细胞的状态，见图1。

2.2 乳腺干细胞分子表面标记基因鉴定结果 经PCR检测，解冻传代后的乳腺干细胞表达干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和乳腺干细胞标记物基因Procr，引物扩增长度分别为452，341，162，299，144 bp，见图2，结果表明该细胞为乳腺干细胞，可用于后续实验。

2.3 乳腺干细胞生长曲线 经细胞计数后绘制乳腺干细胞的生长曲线，发现其呈S型，基本符合一般细胞生长规律，说明细胞生长状态良好，可用于后期实验，见图3。

2.4 乳腺干细胞成骨诱导后茜素红染色结果 乳腺干细胞呈铺路石状生长，加入成骨诱导液诱导后，随着诱导天数的增加，细胞数不断增加。培养16 d左右，显微镜下观察细胞生长逐步变慢，细胞边缘有些模糊，细胞聚集，出现少量颗粒状钙结节；21 d时，显微镜下观察到钙结节增多，其形态与体内成骨细胞类似，经茜素红染色呈阳性，见图4A，B。对未诱导的乳腺干细胞茜素红染色，未发现有钙化结节结构特征的细胞，见图4C，D。

2.5 成骨细胞分子表面标记基因鉴定结果 经PCR检测，诱导后的乳腺干细胞表达了成骨细胞标志基因Bglap和Alpl，扩增长度分别为235 bp和307 bp，见图5。利用特异性引物扩增两个目的基因片段，电泳显示出单一条带，排除非特异扩增，可初步判断乳腺干细胞诱导为成骨细胞。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2017年12月在内蒙古自治区生物制造重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞 分离纯化的荷斯坦奶牛乳腺干细胞系，由内蒙古生物制造重点实验室提供^[24]。

1.3.2 实验试剂 DMEM/F12(SH30023.01B)、磷酸缓冲盐溶液(PBS，SH30256.01B)、胎牛血清(SV30087.01)均购自美国HyClone公司；青霉素(00212226)、链霉素(03032507)均购自华北制药集团有限责任公司；表皮生长因子(E9644)、胰蛋白酶(T4799)、地塞米松(D1756)、抗坏血酸盐(A4403)、β-磷酸甘油(G9891)、茜素红(A5533)均购自美国Sigma公司；胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS，907606)、0.25%胰蛋白酶(25200-056)均购自美国Gibco公司；Taq DNA 聚合酶、DL500 DNA Marker、反转录试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.4 实验方法

1.4.1 乳腺干细胞的复苏与传代 将冻存的第3代乳腺干细胞取出，37 ℃水浴复苏；将解冻后的细胞移入1.5 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min；弃除上清液，干细胞培养液(含DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、20 μg/L表皮生长因子、1%胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂)重悬细胞，接种到培养皿中，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养。待细胞在培养皿表面长到70%-80%融合时，进行传代。用含双抗的PBS清洗2遍培养皿，加入0.25%胰蛋白酶没过皿底，放入37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中消化细胞1 min，待细胞有80%悬浮时，加入等体积干细胞培养液终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃除上清，重悬细胞。

1.4.2 乳腺干细胞RNA的提取及cDNA的合成 将细胞悬液接种于培养皿中，待细胞长至70%-80%融合时，弃掉培养液，PBS清洗，加入RNAiso plus裂解细胞，水平放置片刻，将裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置5 min；加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，剧烈振荡15 s；待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min；从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为3层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min；小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入体积分数为75%乙醇1 mL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 4 ℃ 12 000×g离心5 min，小心弃去乙醇，室温干燥后加入RNase-free水溶解沉淀。

以提取得到的总RNA进行反转录，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书。反应条件：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，4 ℃保温。

1.4.3 乳腺干细胞相关标记物基因的鉴定 干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和乳腺干细胞标记物基因Procr以及内参基因β-actin的引物，用Priemer 5.0软件设计，并由上海生工公司合成，引物序列见表1。获得引物后用RT-PCR和1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。PCR反应体系共20 µL，包括Mix 10 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各1 µL，ddH₂O 7 µL。

PCR扩增反应条件：①预变性94 ℃，5 min；②变性94 ℃，30 s，退火A ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；此步骤共35个循环；③延伸72 ℃，7 min。

1.4.4 乳腺干细胞生长曲线的绘制 取上述细胞悬液，以1×10⁴/孔接种于96孔培养板中，置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，每隔24-48 h换液1次，每24 h计数3孔并计算平均值，连续计数8 d。采用细胞计数板法进行细胞计数，以细胞生长时间(d)为横坐标，细胞数目(×10⁴)为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.5 乳腺干细胞的成骨诱导 第4代乳腺干细胞接种于12孔板中，加入干细胞培养液培养至细胞50%-60%贴壁生长，随机分为对照组和实验组，实验组更换成骨诱导液(含DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、10^-6 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 mg/L抗坏血酸盐)，对照组更换普通培养液(含DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)。将12孔板置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，隔天换液，每天观察细胞生长形态变化，镜检照相记录。

1.4.6 成骨细胞鉴定 ①加入诱导液培养21 d时，用茜素红染色鉴定成骨细胞。具体操作步骤：取出12孔板，吸去培养液，用PBS清洗培养板3次；吸去PBS，加入40 g/L多聚甲醛，室温固定30 min；吸去固定液，PBS清洗培养板3次；吸去PBS，滴加茜素红染色液，覆盖细胞，染色5 min；吸去染色液，PBS清洗培养板2次；倒置显微镜下观察，照相记录；②加入诱导液培养21 d时，即刻提取诱导后细胞的总RNA，反转录为cDNA。成骨细胞标记基因Alpl和Bglap的引物，用Priemer 5.0软件设计，并由上海生工公司合成，引物序列见表1，用RT-PCR和1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5 主要观察指标 ①乳腺干细胞复苏、传代后的细胞形态；②乳腺干细胞分子表面标记基因鉴定结果；③乳腺干细胞生长增殖情况；④乳腺干细胞成骨诱导后茜素红染色结果；⑤成骨细胞分子表面标记基因鉴定结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

现如今，随着人们对干细胞的了解，发现干细胞的存在有巨大作用，围绕干细胞的研究也就越来越重要^[25]。乳腺是奶牛很重要的一个皮肤腺，妊娠后期分娩乳房显著增大，腺泡迅速发育出现分泌腔，开始泌乳。乳腺干细胞在雌性哺乳动物的乳腺发育、分化、凋亡这一循环中起到关键作用，参与了乳腺的生长与重建，其研究意义也显得尤为重要。乳腺干细胞是研究乳腺细胞增殖、分化、生存、凋亡等信号通路的理想模型^[26]。最初，人们提出了乳腺中存在乳腺干细胞的假说^[27]；后来有研究证明单个乳腺干细胞可再生为一个完整功能性乳腺，从而证明了乳腺干细胞的存在^[28-29]。随着这方面探索的不断深入，研究者已经成功分离和鉴定了乳腺干细胞，建立了可在体外稳定培养的乳腺干细胞系^[30]。然而，乳腺干细胞的形态结构、标记特征、增殖和分化潜能等并没有很好的解释。与大多数干细胞一样，乳腺干细胞在超微结构和生化特征方面也还保留着许多未分化细胞的特征，具有自我更新、多向分化潜能、体外克隆形成率高等特点。研究表明，在不同的实验条件下培养，乳腺干细胞可表达出多向分化潜能的特点，能向不同的细胞组织定向分化^[31-32]。

在该实验中，成骨细胞诱导液中加入了地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸盐，这些都可以促使乳腺干细胞诱导分化为成骨细胞。地塞米松属于糖皮质激素的一种，是诱导干细胞成骨分化的常用诱导剂之一，可以诱导细胞表达骨钙素^[33]；β-磷酸甘油可以促进成骨细胞的矿化过程，可促进地塞米松对乳腺干细胞的诱导分化。抗坏血酸盐是一种重要的营养素和氧化还原剂，在骨盐代谢及骨形成中具有重要作用。茜素红能与碳酸钙或磷酸钙中的钙盐螯合形成橙红色复合物，经茜素红染色可检测成骨细胞类型^[34]。在诱导21 d后利用RT-PCR技术鉴定成骨细胞标志基因Alpl和Bglap表达呈阳性。Alpl和Bglap是成骨细胞的一种标志性酶，而钙结节是成骨细胞成熟的标志之一，结合这两种成骨分化指标，说明乳腺干细胞被诱导分化为成骨细胞。课题组已经完成乳腺干细胞向神经细胞和脂肪细胞的诱导^[35-36]，该实验在体外诱导乳腺干细胞分化为成骨细胞，探讨其定向分化潜能，进一步丰富牛乳腺干细胞的分化潜能多样性，对乳腺干细胞的研究具有重要意义，可以为今后生物制药、乳品产业和保健食品生产等开辟新途径，从而提高经济效益。

结论：体外分离培养的荷斯坦奶牛乳腺干细胞经特定诱导可以定向分化为成骨细胞，具有分化为成骨细胞的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成骨诱导及鉴定

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