桃红四物汤干预外周血内皮祖细胞数量与功能增加的时间剂量效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1593

摘要/Abstract

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文题释义：
内皮祖细胞：是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，存在于骨髓、外周血、脐血，其在体外培养时能够增殖，表达内皮系的特征。然而，一些研究发现年龄、心血管疾病等危险因素减少了循环内皮祖细胞的数量并损害其功能。
桃红四物汤改善外周血内皮祖细胞数量和功能：桃红四物汤原方出自《医宗金鉴》，是四物汤加桃仁、红花而成，具有养阴补血、活血祛瘀之功效，主治血虚兼血瘀证。近期研究表明，桃红四物汤能减轻血管内皮细胞的损伤和维持正常的分泌功能，而内皮修复和损伤之间失平衡是内皮功能障碍的本质。内皮祖细胞是内皮细胞的前体，因而设想桃红四物汤可能通过改善内皮祖细胞的功能活性及增加其数量来保护内皮功能。

摘要
背景：近期研究表明，桃红四物汤能减轻血管内皮细胞的损伤和维持其正常的分泌功能，而内皮祖细胞对内皮损伤后的修复有促进作用，因而设想桃红四物汤可能通过改善内皮祖细胞的功能活性及增加其数量来保护内皮功能。
目的：观察桃红四物汤对人外周血内皮祖细胞功能活性和数量的影响。
方法：从健康人外周血中分离培养内皮祖细胞，将内皮祖细胞分为对照组和桃红四物汤低、中、高质量浓度组，在体外培养24 h以观察量效关系，同时桃红四物汤高质量浓度组培养6，12，24，48 h以观察时效关系。倒置相差显微镜下计数内皮祖细胞数量，通过MTT比色法、黏附能力和Boyden小室观察内皮祖细胞的增殖、黏附和迁移能力。
结果与结论：①桃红四物汤干预组内皮祖细胞增殖、黏附和迁移能力明显高于对照组，并与质量浓度呈一定的量效关系，高质量浓度组最为显著(P < 0.01)；②桃红四物汤高质量浓度组内皮祖细胞增殖、黏附和迁移能力的增加呈时间依赖关系，干预24 h时最为显著(P < 0.01)；③结果表明，桃红四物汤可增加内皮祖细胞数量并改善其功能，高质量浓度干预24 h时效果最佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4372-6381(王小斌)

关键词: 内皮祖细胞, 桃红四物汤, 内皮祖细胞增殖, 细胞迁移, 细胞黏附

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that Taohong Siwu Decoction can alleviate the damage of vascular endothelial cells and maintain their normal secretory function, and endothelial progenitor cells can promote the repair of endothelial injury. Therefore, it is assumed that Taohong Siwu Decoction may protect endothelial function by improving the functional activity and increasing the number of endothelial progenitor cells.
OBJECTIVE: To investigate whether Taohong Siwu Decoction can augment the number and functional activity of peripheral blood endothelial progenitor cells.
METHODS: Endothelial progenitor cells were isolated from the peripheral blood of healthy subjects, and divided into control, low-, moderate- and high-concentration Taohong Siwu Decoction groups. Cells were then cultured to observe the dose-effect relationship within 24 hours. Meanwhile, the high-concentration Taohong Siwu Decoction group was cultured for respective time points (6, 12, 24 and 48 hours) for observing the time-effect relationship. The number of endothelial progenitor cells was counted under inverted phase contrast microscope. Proliferation, adhesion and migration of endothelial progenitor cells were detected by MTT chromatometry, adhesion activity assay and modified Boyden chamber assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proliferation, adhesion and migration abilities of endothelial progenitor cells in the Taohong Siwu Decoction groups were significantly higher than those in the control group and showed a certain dose-effect relationship. (2) The proliferation, adhesion and migration abilities of endothelial progenitor cells in the Taohong Siwu Decoction groups were enhanced in a time-dependent manner, especially at 24 hours after intervention (P < 0.01). To conclude, the Taohong Siwu Decoction can increase the number of endothelial progenitor cells and promote cell functions. High-concentration Taohong Siwu Decoction exhibits the best interventional effect at 24 hours after intervention.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Endothelial Cells, Cell Proliferation, Cell Adhesion, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

王小斌，蒋红心，屈长宏，吴冬梅，张荣生，徐斌. 桃红四物汤干预外周血内皮祖细胞数量与功能增加的时间剂量效应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1354-1358.

Wang Xiaobin, Jiang Hongxin, Qu Changhong, Wu Dongmei, Zhang Rongsheng, Xu Bin. Time-dose effects of Taohong Siwu Decoction on number and functional activity of peripheral blood endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1354-1358.

图/表（结果） 2

2.1 内皮祖细胞的鉴定结果 通过共聚焦显微镜鉴定，内皮祖细胞UEA-I和DiLDL染色双阳性，见图1；流式细胞仪检测AC133、CD34、VEGFR-2阳性率分别为(21.6±5.3)%，(29.2±5.9)%和(59.7±8.8)%，进一步鉴定为内皮祖细胞，见图2，详见参考文献[15-16]。

2.2 桃红四物汤对外周血内皮祖细胞数量的影响 与对照组相比，桃红四物汤干预组内皮祖细胞数量显著增加，且随着桃红四物汤质量浓度增加，内皮祖细胞数量也相应增加，高质量浓度组增加的效应最大(P < 0.01)，见表1；高质量浓度组内皮祖细胞数量显著高于中、低质量浓度组(P < 0.05)，中质量浓度组内皮祖细胞数量显著高于对照组(P < 0.05)，中质量浓度组与低质量浓度组间内皮祖细胞数量差异无显著性意义；此外，高质量浓度干预组内皮祖细胞数量的增加呈时间依赖关系。在桃红四物汤干预6 h后内皮祖细胞数量开始显著增加，24 h到高峰(P < 0.01)，见表2。

2.3 桃红四物汤对外周血内皮祖细胞增殖能力的影响 桃红四物汤干预组内皮祖细胞增殖能力明显高于对照组，并与质量浓度呈一定的量效关系，高质量浓度组时最为显著(P < 0.01)，见表1；高质量浓度组内皮祖细胞增殖能力显著高于中、低质量浓度组(P < 0.05)，中质量浓度组与低质量浓度组间内皮祖细胞增殖能力差异无显著性意义。此外，高质量浓度组桃红四物汤对内皮祖细胞增殖能力的增加呈时间依赖关系。在桃红四物汤干预6 h后内皮祖细胞的增殖能力开始明显改善(P < 0.05)，于24 h达到最强(P < 0.01)，48 h有所下降，但仍明显高于对照组(P < 0.01)，见表2。

2.4 桃红四物汤对外周血内皮祖细胞黏附能力的影响 桃红四物汤干预组内皮祖细胞的黏附能力显著高于对照组，并与质量浓度呈一定的量效关系，高质量浓度组时最为显著(P < 0.01)，见表1；高质量浓度组内皮祖细胞黏附能力显著高于中、低质量浓度组(P < 0.05)，中质量浓度组与低质量浓度组间内皮祖细胞黏附能力差异无显著性意义。此外，高质量浓度组桃红四物汤对内皮祖细胞黏附能力的增加呈时间依赖关系。在桃红四物汤干预6 h后内皮祖细胞黏附能力开始明显改善(P < 0.05)，于24 h达到最大(P < 0.01)，见表2。

2.5 桃红四物汤对外周血内皮祖细胞迁移能力的影响 与对照组相比，桃红四物汤干预组内皮祖细胞的迁移能力显著增加，并与质量浓度呈一定的量效关系，高质量浓度组时最为显著(P < 0.01)，见表1；高质量浓度组内皮祖细胞迁移能力显著高于中、低质量浓度组(P < 0.05)，中质量浓度组迁移能力高于低质量浓度组(P < 0.05)；此外，高质量浓度组内皮祖细胞迁移能力呈时间依赖关系，于12 h时迁移能力明显增加(P < 0.05)，于24 h达到高峰(P < 0.01)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2017年6月在扬州大学医学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 药材 桃红四物汤处方药材组成桃仁、白芍、当归、川芎、红花、熟地黄购自于江苏省扬州市中医院。

1.3.2 实验试剂 M199、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-DiI)、牛脑提取物、FITC标记荆豆凝集素I (FITC-UEA-I)(美国Sigma公司)；MTT(华美生物工程公司)；人纤维连接蛋白(Chemicon公司)；体外血管生成试剂盒(Biovision公司)；血管内皮生长因子(Pepro Tech Inc.公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；0.25%胰蛋白酶(武汉华美生物工程公司)。

1.3.3 实验动物 雌性SD大鼠120只，6-8周龄，体质量(200±20) g，由扬州大学医学院实验动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 内皮祖细胞的分离、培养 健康志愿者均无心血管危险因素、心血管病史，抽空腹外周静脉血100 mL，用密度梯度离心法分离并提取单个核细胞，将其接种在预先包被人纤维连接蛋白的培养板上，加入M199培养基，培养4 d后用PBS洗涤，换新培养液再培养3 d，PBS洗掉非贴壁细胞，收集贴壁细胞供下一步药物干预用。该研究方案得到扬州市中医院伦理委员会批准，并与健康志愿者签署知情同意书。

1.4.2 内皮祖细胞鉴定 将acLDL-DiI(2.4 μmol/L)加入细胞培养皿中，37 ℃孵育1 h；20 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗；将FITC-UEA-I(10 μmol/L)加入培养皿中，37 ℃孵育1 h。在多波长激光共聚焦显微镜下对贴壁细胞鉴定，UEA-I和DiLDL同时染色的细胞就是在分化的内皮祖细胞^[11]。在倒置荧光显微镜下选择15个×200视野，对每孔的内皮祖细胞进行计数。

1.4.3 流式细胞仪检测细胞表型 用0.25%胰蛋白酶消化和收集贴壁细胞，取2×10⁵贴壁细胞分别加入PE标记的VEGFR-2、AC133和CD34单克隆抗体，在4 ℃下孵育30 min，PBS洗涤2次，加300 μL PBS悬浮细胞后上机检测^[12]。

1.4.4 制备桃红四物汤 按大鼠与人体表面积的比和桃红四物汤的组方比例，推算出200 g大鼠的等效用药剂量作为中质量浓度组，按其0.5倍和2倍剂量作为低质量浓度组和高质量浓度组^[13]。组方的方剂量为55 g，大鼠与人体表面积比率为0.018，55 g×0.018=0.99 g，故桃红四物汤组的终质量浓度分别为0.5，1.0，2.0 g/mL。中药饮片购自江苏省扬州市中医院药剂科，由专业药师进行饮片的鉴定及制剂，纯净水煎2次，时间分别为2 h和1 h，合并煎煮液后过滤并浓缩至预定浓度，4 ℃冰箱保存。

1.4.5 含药血清的制备 将SD大鼠随机分成4组(n=5)，其中桃红四物汤低、中、高质量浓度组每日给予相应的中药加生理盐水稀释成3 mL灌胃，连续7 d，空白组给予等量的生理盐水。末次给药后1 h，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清，放入离心管中，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，-40 ℃保存备用^[6]。

1.4.6 实验分组 内皮祖细胞用桃红四物汤低、中、高质量浓度组含药血清培养24 h以观察量效关系；同时内皮祖细胞用高质量浓度桃红四物汤组含药血清培养6，12，24，48 h，观察时效关系^[14]。对照组内皮祖细胞用含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液培养。

1.4.7 MTT法检测内皮祖细胞增殖能力 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁内皮祖细胞，以1×10⁵/孔的细胞密度接种至包被有人纤维连接蛋白的96孔培养板，根据实验分组加入桃红四物汤含药血清，干预结束后，每孔加MTT(5 g/L) 20 μL，37 ℃培养4 h后，吸弃上清液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min后用酶标仪测吸光度值(波长490 nm)。

1.4.8 内皮祖细胞黏附能力检测 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁内皮祖细胞，加入M199培养液500 μL，以1×10⁵/孔将其接种在包被有人纤维连接蛋白的96孔培养板上，37 ℃下培养30 min，然后根据实验分组加入桃红四物汤含药血清，干预结束后，随机取15个视野，倒置显微镜(×200)下计数贴壁细胞数^[7]。

1.4.9 Boyden小室法检测内皮祖细胞的迁移能力 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁内皮祖细胞并计数，将含有5×10⁴内皮祖细胞的500 μL M199培养液，注入改良Boyden小室的上室，下室加入25 μL M199培养液(含50 μg/L血管内皮生长因子)，37 ℃下培养24 h，然后根据实验分组加入桃红四物汤含药血清，干预结束后，刮去滤膜上面的细胞，用甲醇固定、Giemsa染色后，计数迁移的细胞数(随机选择3个显微镜视野×200)。

1.5 主要观察指标 各组内皮祖细胞的增殖数量、黏附能力、迁移能力。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件包进行处理。各组重复6次实验，计量资料以x(_)±s表示，用ANOVA、t 检验进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

桃红四物汤是四物汤加桃仁、红花而成，方中熟地甘温质润，长于滋养阴血、补肾填精，为补血要药，故为君药；当归甘辛温，可补血活血，养血调经，为补血良药，故为臣药；佐以白芍养血柔肝、敛阴和营，川芎活血行气、条畅气血，桃仁、红花活血化瘀；诸药合用，具有养血、活血、逐瘀之功效。有学者发现桃红四物汤可促进激素性股骨头缺血坏死股骨头局部微血管的生长，改善股骨头局部血运，促进坏死股骨头的修复^[17]；龙翔等^[18]发现桃红四物汤能增加兔自体皮片移植术后的血管密度、促进血管新生。池晓霞^[19]发现高、中、低不同剂量的桃红四物汤含药血清干预培养后脐静脉内皮细胞的增殖能力增加；刘竹青等^[20]研究发现桃红四物汤含药血清能减轻过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。内皮损伤后可通过原先存在的邻近成熟内皮细胞的出芽或迁移来对内皮损伤进行修复，也可由内皮祖细胞分化为成熟内皮细胞来取代损伤的内皮。

内皮祖细胞是一类尚未表达成熟血管内皮细胞表型、也未形成血管的前体细胞，能增殖并分化为血管的内皮细胞^[15^，^21-24]。内皮祖细胞参与人胚胎血管的生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复；新生血管中的内皮细胞25%是由内皮祖细胞分化而来的^[25-26]。近来研究表明内皮祖细胞在动脉粥样硬化的发生、发展中起了重要作用^[7^，^27-30]，冠心病患者外周血中内皮祖细胞数量减少了近50%，内皮祖细胞的迁移能力下降，并与危险因子的数目成正相关，而且高危者内皮祖细胞更易衰老。因而用药物干预或体外培养扩增内皮祖细胞，移植到机体内以增加内皮祖细胞的数量和功能，可能会促进动脉粥样硬化患者内皮修复与血管新生，防治动脉粥样硬化，从而改善机体微循环，增加心脏血供，提高生活质量。但是，正常成人外周血内皮祖细胞数量有限，因此对其进行体外扩增很有必要。目前发现一些激素、刺激因子、化学药物等在体外细胞培养时能增加内皮祖细胞数量，改善内皮祖细胞功能，延缓衰老，但是在体内的疗效有待进一步证实，因此在一定程度上限制了应用。目前有关中草药对内皮祖细胞影响的研究比较少。

该研究首次发现桃红四物汤不但能增加内皮祖细胞的数量，同时能改善内皮祖细胞的增殖、黏附、迁移能力，且高质量浓度组内皮祖细胞增殖能力显著高于中、低质量浓度组，同时高质量浓度干预组内皮祖细胞的数量、增殖、黏附、迁移能力的增加呈时间依赖关系，在干预6 h后内皮祖细胞开始显著增加，24 h到高峰，提示桃红四物汤可直接保护内皮细胞，并改善其功能，从而促进内皮修复，改善冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的临床症状和预后。桃红四物汤影响内皮祖细胞数量和功能的确切机制尚不明确，可通过信号转导途径而调节内皮祖细胞的分化和增殖，这尚有待进一步研究。此外桃红四物汤对内皮祖细胞作用的分子生物学机制也尚有待于进一步的研究和探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程