在Prrx1+骨髓间充质干细胞中过表达肝素结合表皮生长因子样生长因子抑制小鼠骨发育

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1805

摘要/Abstract

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文题释义：
肝素结合表皮生长因子样生长因子：属于表皮生长因子家族，通过与表皮生长因子受体和ErbB4结合，参与肿瘤发生、伤口愈合、眼睑形成、心脏发育、动脉粥样硬化、囊胚植入、骨骼发育等多种生理病理过程。
骨髓间充质干细胞：是一种多能干细胞，具有向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及肌细胞分化的潜能，对于骨骼发育十分重要。

摘要
背景：肝素结合表皮生长因子样生长因子对骨骼的发育十分重要，但目前尚未报道过体内骨髓间充质干细胞来源的肝素结合表皮生长因子样生长因子对骨发育的影响。
目的：探究在骨髓间充质干细胞中过表达肝素结合表皮生长因子样生长因子对骨发育的影响并初步分析相关机制。

方法：利用Cre-LoxP系统构建在Prrx1⁺骨髓间充质干细胞中过表达肝素结合表皮生长因子样生长因子(ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre)的小鼠模型，取骨组织切片染色进行组织学分析。取小鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养，进行分化能力检测和分子机制研究。实验于2015年经上海交通大学实验动物管理、学术、伦理与使用委员会批准，批准号为A2015027。
结果和结论：①Prrx1在成年小鼠股骨关节头、生长板、骨小梁表面和骨膜上均有表达；②ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠股骨变短，骨量明显减少，软骨形态和结构异常，出现骨关节炎样表型；③ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨、软骨分化减弱。结果提示在骨髓间充质干细胞中过表达HB-EGF可能通过削弱骨髓间充质干细胞成骨、软骨分化抑制小鼠骨发育。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7790-306X(刘佳佳)

关键词: Prrx1, 肝素结合表皮生长因子样生长因子, 骨髓间充质干细胞, 骨, 成骨细胞, 软骨细胞, 骨关节炎, 转基因模型

Abstract:

BACKGROUND: Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) plays an important role in bone development. However, there is no report regarding the effects of HB-EGF derived from bone marrow mesenchymal stem cells on skeletal development.
OBJECTIVE: To study the effects of HB-EGF overexpression in bone marrow mesenchymal stem cells on skeletal development and to preliminarily explore the underlying mechanisms.
METHODS: The mouse model of HB-EGF overexpression in Prrx1⁺ bone marrow mesenchymal stem cells(ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre) was constructed using Cre-LoxP system. Bone sections were processed and stained for histological analysis. Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro and their differentiation potential and relevant molecular mechanism were assessed. The experiment was approved by the Experimental Animal Management, Academics, Ethics and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University in 2015. The approval number is A2015027.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Prrx1 was expressed in the articular cartilage, growth plate, trabecular bone and periosteum of adult mice. (2) The femurs of ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre mice were shortened, the bone mass decreased significantly, and the cartilage morphology and structure were abnormal, all of which indicated osteoarthritic phenotype. (3) Overexpression of HB-EGF inhibited the osteogenic and chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre mice in vitro. These results suggest that overexpression of HB-EGF in Prrx1⁺ bone marrow mesenchymal stem cells may influence the skeletal development by inhibiting osteogenic and chondrogenic differentiation.

Key words: Prrx1, heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, bone marrow mesenchymal stem cells, bone, osteoblasts, chondrocytes, osteoarthritis, transgenic model

中图分类号:

刘佳佳，李平，邓琦，刘慧娟. 在Prrx1⁺骨髓间充质干细胞中过表达肝素结合表皮生长因子样生长因子抑制小鼠骨发育[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4623-4628.

Liu Jiajia, Li Ping, Deng Qi, Liu Huijuan. Overexpression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor in Prrx1⁺ bone marrow mesenchymal stem cells inhibits mouse skeletal development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4623-4628.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 所有构建的ROSA26-tdTomato; Prrx1-Cre的小鼠均进入结果分析。

2.2 Prrx1⁺细胞标记小鼠典型的骨结构 实验首先构建了ROSA26-tdTomato; Prrx1-Cre小鼠，通过红色荧光来示踪骨中Prrx1的表达。结果显示，Prrx1在股骨关节头、生长板、骨小梁表面和骨膜等典型的骨结构中均有表达，尤其是关节头和生长板区域，见图1。

2.3 ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠骨量减少 通过X射线成像获得长骨二维图，发现ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠呈现股骨变短，关节头变宽的趋势，见图2A。定量分析结果证实其股骨长度从1.4 cm缩短到0.9 cm，关节头宽度从3.1 mm增加到3.8 mm，其差异有显著性意义，见图2B。微型CT三维重建结果发现过表达组骨体积分数降低了90%，骨小梁数量减少70%，骨小梁厚度减少20%，骨小梁分离距离增加1.5倍，见图2C，表明ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠骨基质明显减少。

2.4 ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠软骨异常 Safranin O染色发现，对照组关节结构完整，关节头及生长板软骨层结构清晰、排列整齐，而ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠胫骨关节头凹陷，有异位软骨积聚，股骨和胫骨关节头软骨层变薄，软骨细胞减少，软骨生长板断裂，见图3A。通过免疫组化染色发现，FSP1在ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠关节头表达的区域增加，同时阳性细胞的数量也明显增加，表明关节头处纤维化增加，见图3B。综上，ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠关节头及生长板软骨细胞紊乱，有关节炎样表型。

2.5 ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠骨髓间充质干细胞分化减弱 将骨髓间充质干细胞进行体外培养诱导成骨、软骨分化，碱性磷酸酶染色结果发现过表达组成骨细胞明显减少，同时成骨细胞的标志基因Alp、Runx2、Osx、Ocn、Dmp1的表达都显著下调；阿尔辛蓝染色结果发现成熟的软骨细胞明显减少，软骨细胞的标志基因Col2α1、Col10α1、Sox9、Mmp13的表达也显著下降，见图4。这些结果说明过表达HB-EGF能抑制骨髓间充质干细胞成骨、软骨分化。

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引言

材料方法

1.1 设计 过表达HB-EGF的转基因小鼠体内实验和体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年9月至2018年11月在上海交通大学Bio-X研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 实验中所用SPF级别的ROSA26-tdTomato(Stock Number: 007909)、Prrx1-Cre (Stock Number: 005584)和ROSA26^tm1(HB-EGF)(Stock Number: 008040)小鼠均从美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)购买^[16-18]。ROSA26-tdTomato小鼠的ROSA位点敲入了tdTomato蛋白编码序列，由于其上游存在loxp-stop-loxp序列而不表达红色荧光，而当与Prrx1-Cre重组表达系统结合后，stop序列在Cre存在的组织中被删除，tdTomato在目标启动子表达的细胞及其子细胞中表达，指示基因表达的位置^[16]。同理，ROSA26^tm1(HB-EGF)小鼠不表达插入的HB-EGF基因，ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠Prrx1⁺细胞及其后代中过表达HB-EGF^[18]。小鼠品系为B6。小鼠在SPF级环境中分笼喂养，温度湿度适宜，昼夜交替，自由摄水摄食。动物实验于2015年经上海交通大学实验动物管理、学术、伦理与使用委员会批准，批准号为A2015027。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 苏木精、伊红、中性树胶、载玻片购于碧云天生物公司，快绿、Safranin O、碱性磷酸酶试剂盒购自Sigma，阿尔辛蓝及其他常见有机无机盐试剂购自上海生工生物公司，αMEM培养基购自Giboc。石蜡切片机和冰冻切片机购自Leica，显微镜购自Nikon，LightCycler 480荧光定量PCR仪购自Roche，PCR仪购自Applied Biosystems，X射线成像仪购自Faxitron，1176微型CT活体扫描系统购自SkyScan。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠构建 将ROSA26-tdTomato小鼠与Prrx1-Cre小鼠杂交得到ROSA26-tdTomato；Prrx1-Cre小鼠将ROSA26^tm1(HB-EGF)小鼠和Prrx1-Cre小鼠杂交得到ROSA26^tm1(HB-EGF)小鼠、Prrx1-Cre小鼠和ROSA26^tm1(HB-EGF)；Prrx1-Cre。

1.4.2 全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞 通过颈椎脱臼法处死2月龄小鼠，取后肢于PBS中，在超净工作台中分离股骨和胫骨，分别剪开其两端，将骨髓冲出直至骨壁变白。将含骨髓的培养基转移至离心管中，离心后加入红细胞裂解液，裂解后细胞用PBS重悬。再次离心后弃上清用含胚胎牛血清的完全培养基重悬，利用贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞。3 d后换液，细胞贴壁约90%后传代，选取生长良好的第3代细胞进行后续实验^[19]。培养至第3代的细胞均贴壁生长，显微镜下观察到细胞呈梭形的成纤维细胞状，经成骨及成软骨培养基诱导时，可分化为成骨和软骨细胞。即所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

1.4.3 成骨及成软骨分化 在12孔板中分别按5×10⁴个/孔(成骨)、8×10⁴个/孔(成软骨)接种全骨髓贴壁法分离得到的骨髓间充质干细胞，加完全培养基过夜，次日换诱导培养基。分别在诱导7 d(成骨)或21 d(成软骨)后，用多聚甲醛固定细胞，分别用碱性磷酸酶试剂盒或阿尔辛蓝染液进行染色。

1.4.4 小鼠X射线检测及股骨微型CT扫描 采用X射线成像仪对2月龄小鼠后肢进行X射线摄片，并初步观察实验鼠股骨长度、骨密度等指标。用微型CT扫描仪扫描固定后的2月龄小鼠右股骨，通过微型CT软件分析扫描结果并进行三维重建，分析指标有骨体积与组织体积比、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁分离度等^[20]。

1.4.5 Safranin O染色 2月龄小鼠后肢长骨固定、脱钙完成后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，得到厚度为4 μm的小鼠后肢关节切片。将组织形态完整的石蜡切片脱蜡、复水，用Weigert苏木精染细胞核，番红染软骨细胞，快绿染细胞质，脱水、透明后，用中性树胶封固。

1.4.6 免疫组化染色 将厚度为4 μm的小鼠后肢关节切片脱蜡、复水，进行抗原修复。0.5% Triton X-100溶液破膜后用体积分数10%的山羊血清封闭，一抗4 ℃过夜。次日复温后加二抗孵育，滴加DAPI染液，用抗荧光猝灭剂封固。

1.4.7 定量PCR分析 骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d及成软骨诱导21 d后，去除培养基，加入Trizol转移至EP管中。裂解完全后，加入氯仿混匀后离心。取上清至新的EP管中，等体积加入异丙醇，静置分层后离心。弃上清，用体积分数75%的DEPC-乙醇洗涤，离心后沉淀的RNA自然干燥，用无RNA酶的水溶解。测量RNA浓度，反转录得到cDNA。用Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪分别检测成骨及成软骨相关基因表达水平。基因引物见表1。

1.5 主要观察指标 ①关节组织组织形态；②细胞分布情况；③成骨以及成软骨相关基因表达情况。

1.6 统计学分析 所有数据均以x(_)±s表示，采用IBM SPSS 16.0软件处理，组间数据采用单因素方差分析，两独立样本的资料采用Student’s双尾t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

HB-EGF是一种促有丝分裂原，属于表皮生长因子家族^[21-22]。HB-EGF通过与表皮生长因子受体和ErbB4结合，触发受体二聚化并激活下游信号分子调节激酶、应激活化蛋白激酶、胞内磷脂酰肌醇激酶等^[23]，参与肿瘤发生、骨骼发育等多种生理病理过程^[24-25]。

既往研究表明Prrx1是一类骨髓间充质干细胞的遗传标记物^[26]，在此次实验中作者确认了Prrx1⁺细胞能够标记小鼠长骨中的成骨细胞的典型区域如骨小梁，软骨细胞的典型区域如关节头和生长板等，这与既往研究结果一致^[27]。

HB-EGF的功能极其复杂^[28-30]，而骨骼发育状况受到多种因素影响，如感染、创伤、炎症等^[31-32]。此次实验发现在环境条件一致且适宜的情况下，相比于ROSA26^tm1(HB-EGF)小鼠，在间充质干细胞中过表达HB-EGF的小鼠表现出骨小梁数量减少、厚度变薄、骨量减少和股骨变短的表型，这再次印证Prrx1是间充质干细胞的遗传标记物，同时说明过表达HB-EGF可影响小鼠骨发育。研究显示，HB-EGF在体外抑制成骨分化：HB-EGF可能通过抑制成骨分化标志基因Alp和Ocn的表达负调控成骨分化^[12]。HB-EGF通过抑制Runx2转录活性抑制成骨细胞的分化，并通过下调p27的表达促进成骨前体细胞的增殖而负调节小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞在体外的成骨分化^[33]。由于体外实验中外源性添加HB-EGF抑制间充质干细胞成骨及成软骨分化^[14]。此次实验检测了骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况，发现Prrx1⁺骨髓间充质干细胞中过量的HB-EGF使间充质干细胞成骨分化减弱，这说明可能因间充质干细胞成骨分化受到抑制，形成的成骨细胞数量减少最终导致小鼠骨量降低。

有研究报道，HB-EGF与骨关节炎密切相关^[34]。骨关节炎患者样本及模型小鼠组织中HB-EGF明显增加^[13^，^35]，生物信息学分析认为HB-EGF是骨关节炎的潜在介质^[36]，表皮生长因子受体的敲除增强了骨关节炎模型中软骨的破坏^[37]，关节炎患者软骨细胞体外培养时其合成、分解代谢受到HB-EGF调节^[38]。但还没有直接证据证明HB-EGF导致关节炎。此次实验发现在间充质干细胞中过表达HB-EGF导致ROSA26^tm1(HB-EGF); Prrx1-Cre小鼠关节头凹陷、生长板断裂、软骨浅表层纤维化增加并出现异位软骨等症状，这与研究报道骨关节炎症状十分吻合^[39-40]，这些发现有力地证明了过量的HB-EGF诱发骨关节炎。同时实验还检测到骨髓间充质干细胞软骨分化减弱，推测在Prrx1⁺骨髓间充质干细胞中过表达HB-EGF可能通过抑制骨髓间充质干细胞软骨分化导致小鼠出现骨关节炎样表型，这有待我们后续进一步研究验证。

综上所述，在Prrx1⁺骨髓间充质干细胞中过表达HB-EGF使小鼠骨量减少、出现骨关节炎样表型，可能是抑制了间充质干细胞的成骨、软骨分化。HB-EGF在调节骨髓间充质干细胞多系分化中起着重要作用，此研究为HB-EGF在骨骼发育中作用的相关分子机制提供了一个新的思路，同时也为骨关节炎产生机制提供了一定的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程