阳极氧化钛生物相容性的实验研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1636

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

生物相容性：指材料在机体的特定部位引起恰当的反应，一般是指材料与宿主之间的相容性。评价和分析某种材料的生物形容性要明确关键点：第一，生物相容性是一个动态过程，不是静止不变的；第二，生物相容性不单纯是材料本身的性质，而是材料与机体环境相互作用的结果。

RT-PCR：是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平。

背景：研究证实，二氧化钛涂层可提高种植体表面的可黏附性，促进成骨细胞增殖和其他细胞功能，提高周围骨与植入体的骨整合能力，但将其作为涂层用于内固定植入预防螺钉松动的研究尚少。

目的：制备二氧化钛涂层钛螺钉，观察其用于骨内固定对于减少螺钉松动的影响。

方法：通过阳极氧化法在普通钛螺钉表面制备二氧化钛涂层。将30只雄性新西兰大耳白兔(上海市普陀区中心医院中心实验室提供)随机分为2组，每组15只：实验组右侧胫骨植入二氧化钛涂层钛螺钉，对照组右侧胫骨植入普通钛螺钉，植入后1 d、1周、4周，取钉道周围骨组织，RT-PCR检测血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子基因表达；植入后4周，取钉道周围骨组织，进行苏木精-伊红染色。

结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，对照组钉道内可见炎性细胞浸润，部分钉道螺纹被破坏、吸收；实验组钉道螺纹清晰，无破坏及吸收现象，钉道内炎性细胞渗出较少；②RT-PCR检测显示，两组植入1 d的血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子基因表达比较无差异(P > 0.05)；实验组植入1，4周的血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子基因表达均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)；③结果表明，二氧化钛涂层钛螺钉生物相容性强于普通钛螺钉，用于内固定可有效预防螺钉松动。

ORCID: 0000-0002-6778-6605(邹翰林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 二氧化钛涂层, 钛螺钉, 螺钉松动, 骨折固定, 生物相容性, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that titanium dioxide coating can improve the adhesion of implant surface, promote osteoblast proliferation and other cell functions, and improve the bone integration ability between the surrounding bone and implant. But little has been done in the use of titanium dioxide coating as a coating for internal and external fixation to prevent screw loosening.

OBJECTIVE: To prepare titanium dioxide coated titanium screws and to observe the effect of titanium dioxide coated titanium screws used for bone fixation to reduce screw loosening.

METHODS: Titanium dioxide coating was prepared on the surface of titanium screw by anodic oxidation. Thirty male New Zealand white rabbits (provided by the Central Laboratory of Shanghai Putuo District Central Hospital in China) were randomly divided into two groups (n=15 per group). Titanium dioxide coated screws were implanted in the right tibia of the rabbits in the experimental group, and ordinary titanium screws were implanted in the right tibia of the rabbits in the control group. Bone tissue around the screw canal was taken at 1 day, 1 and 4 weeks after implantation, and levels of platelet-derived growth factor and vascular endothelial growth factor genes were detected using RT-PCR. Four weeks after implantation, bone tissue around the nail canal was taken for hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of hematoxylin-eosin staining showed that inflammatory cell infiltration was seen in the screw canal of the control group, and some screw canal threads were destroyed and absorbed. In the experimental group, the screw threads were clear and had no damage or absorption; inflammatory cells in the screw canal were less exuded. (2) RT-PCR analysis revealed no significant difference in the expression of platelet-derived growth factor and vascular endothelial growth factor gene between the two groups at 1 day after implantation (P > 0.05), while the expression of platelet-derived growth factor and vascular endothelial growth factor gene in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 1 and 4 weeks after implantation (P < 0.05 or P < 0.01). Therefore, titanium dioxide coated titanium screws are more biocompatible than common titanium screws and can effectively prevent screw loosening when used for internal fixation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Nails, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318.08

刘少扬，邹翰林. 阳极氧化钛生物相容性的实验研究[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(10): 1575-1580.

Liu Shaoyang, Zou Hanlin . Biocompatibility of anodic titanium oxide: an experimental research[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(10): 1575-1580.

图/表（结果） 4

2.1 二氧化钛涂层螺钉的制作从顶面俯视图和不同侧面扫描图可看出，阳极氧化所得螺钉表面二氧化钛膜均一，膜的厚度约为2 μm，见图1。对经过阳极氧化及电化学抛光处理所得的钛螺钉组分进行测试，可看到O摩尔百分比为(65.27±3.90)%，Ti摩尔百分比为(32.16±0.60)%，O和Ti摩尔比为2.019 7∶1，可肯定阳极钛螺钉上所生成浅白色薄膜样品为二氧化钛。

2.2 钛螺钉植入兔胫骨后的钉道周围苏木精-伊红染色结果植入后4周，对照组均表现为钉道内炎性细胞浸润，部分钉道螺纹被破坏、吸收；实验组表现为钉道螺纹清晰，无破坏及吸收现象，钉道内炎性细胞渗出较少，见图2。

2.3 钛螺钉植入兔胫骨后的钉道周围生长因子检测结果植入1 d末，两组血小板衍生生长因子mRNA表达相近，实验组略高于对照组，但差异无统计学意义(1.124±0.512，0.974±0.766，t=0.004，P=0.997)。植入1周末，对照组血小板衍生生长因子mRNA表达开始下降，实验组血小板衍生生长因子mRNA表达略升高，实验组血小板衍生生长因子mRNA表达高于对照组(1.353±0.450，0.191±0.088，P=0.045)。植入4周末，两组血小板衍生生长因子mRNA表达都开始下降，实验组血小板衍生生长因子mRNA表达高于对照组(0.572±0.291，0.186±0.217，t=-5.301，P < 0.01)。两组钉道周围组织血小板衍生生长因子mRNA相对表达变化，见图3，在整个实验过程中，实验组血小板衍生生长因子mRNA表达一直维持在较高水平。

植入1 d末，两组血管内皮生长因子mRNA表达相近，实验组略低于对照组，但差异无统计学意义(0.302±0.045，0.178±0.039，t=0.506，P=0.056)。植入1周末，两组血管内皮生长因子mRNA表达都开始下降，对照组血管内皮生长因子mRNA表达下降更多，实验组血管内皮生长因子mRNA表达高于对照组(0.430±0.226，0.164±0.054，P= 0.019)。植入4周末，两组血管内皮生长因子mRNA表达都开始上升，实验组血管内皮生长因子mRNA表达高于对照组(0.287±0.018，0.516±0.016，t=-5.215，P <0.01)。两组钉道周围组织血管内皮生长因子mRNA相对表达变化，见图4。

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引言

钛及钛合金具有良好的机械强度与抗腐蚀性能，已在医疗领域得到广泛应用。骨折切开复位内固定治疗各类骨折有其独特优势，因为依靠坚强内固定可早期活动关节，避免石膏长期固定造成的肌肉萎缩、关节僵硬等骨折晚期并发症。螺钉-骨界面关系是骨折内固定稳定性最关键的环节，内固定螺钉是骨向外界传递载荷的唯一途径，随着内固定时间的增加，螺钉松动的概率也逐渐增加。螺钉松动又会导致骨折复位的丢失，引起钉道感染甚至骨髓炎^[1]。因此，如何提高螺钉-骨表面的生物活性，使之既能促进骨整合又能降低螺钉松动的发生率，成为当前钛及钛合金植入物研究的热点^[2]。Pieske等^[3]分别应用羟基磷灰石涂层固定针与不锈钢对不稳定腕骨骨折患者进行外固定，发现与不锈钢相比，羟基磷灰石涂层固定针的强度强，具有提高骨整合、改善钉-骨界面力学强度的作用。Holt等^[4]将氮氧化物涂层固定针的一半插入小白鼠脊柱中，证实了氮氧化物涂层可显著减少螺钉松动的发生率。目前以氮氧化物涂层来减少内固定螺钉的技术较新，尚缺乏大量的体外及动物实验。

随着涂层技术的进步，众多研究证实二氧化钛的光催化特性可有效抑制细菌增殖，并且已被广泛应用于水质、土壤和空气净化，自清洁及消毒灭菌等多种领域^[5-7]，但将二氧化钛作为涂层用于内固定植入骨预防螺钉松动的研究尚少。有学者将二氧化钛涂层用于髋关节假体，发现二氧化钛涂层结构表面可增加哺乳动物细胞在固体基质上的黏附和增殖^[8]。Zhang等^[9]通过二氧化钛涂层的股骨髓内钉在动物实验中证实了二氧化钛优越的生物相容性。目前二氧化钛用于涂层预防螺钉松动的动物实验研究比较缺乏。实验通过阳极氧化技术在钛螺钉表面制作二氧化钛涂层，通过动物实验来验证该涂层预防螺钉松动的有效性。

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材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年6月至2017年6月在上海市普陀区中心医院中心实验室完成。

1.3 材料钛螺钉(强生医疗器材有限公司)；浓硫酸、氢氟酸、去离子水(上海市普陀区中心医院中心实验室)；扫描电镜(日本日立S-4800，东京，日本)；X射线衍射仪(ESCA5800，ULVAC-PHI，Chigasaki，日本)。

实验动物：3月龄雄性新西兰大耳白兔30只，体质量2.5 kg，购自上海市普陀区中心医院中心实验室，许可证号：SCXK(沪)2016-0008。将30只兔随机分为实验组与对照组，每组15只。

1.4 实验方法

1.4.1 二氧化钛涂层钛螺钉的制备采用阳极氧化技术制作二氧化钛涂层钛螺钉。依次用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗钛螺钉；用浓硫酸与氢氟酸的混合酸(混合比例为4∶1)对清洗干净的钛螺钉进行电化学抛光(1 min，电压 15 V)，然后用离子水冲洗干净；在含质量分数0.3%NH₄F和体积分数2%H₂O的乙二醇电解液中，以清洗后的钛螺钉为阳极，铂片作对电极进行恒压阳极氧化。在整个阳极氧化过程中应辅以磁力搅拌，电压设置为45 V，时间控制在3.5-4.0 h，然后用去离子水清洗并高纯氮气吹干表面，最后用去离子水超声清洗，干燥。通过X射线衍射及扫描电镜检测二氧化钛涂层的纯度及厚度。

1.4.2 螺钉植入模型的建立将SPF环境下适应性1周后的新西兰大耳白兔固定在手术台上，自耳缘静脉注射3%戊巴比妥注射液(剂量1 mL/kg)。麻醉成功后，右小腿外侧剃毛，聚维酮碘溶液消毒皮肤，铺一次性无菌巾，带无菌手套，自右胫骨膑下外侧纵行切开长约0.5 cm的切口，切开皮肤皮下达骨膜，钝性剥离并切除骨膜，显露胫骨干骺端，2.7 mm钻头高速钻孔至对侧(1孔)，实验组和对照组分别拧入二氧化钛涂层钛螺钉和普通钛螺钉，冲洗后逐层缝合。术后动物隔离分笼饲养，自由饮食。

1.4.3 组织学评估(苏木精-伊红染色) 螺钉植入后4周末，取钉道周围骨组织，进行石蜡包埋固定，苏木精-伊红染色。苏木精-伊红染色病理切片平面与钉道轴线平行且经过钉道边缘，以便于由浅及深观察钉道周围与骨组织炎性浸润、骨痂生长情况。

1.4.4 钉道生长因子检测(RT-PCR) 螺钉植入后1 d、1周、4周时，2组每个时间点各取5只兔，处死，在无菌条件下取钉道周围骨组织，后快速浸没于放有trizol的冻存管中，并冻存于液氮中待检测。实验中需检测的2种生长因子及内参引物序列如下：血管内皮生长因子，F：GAC CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA 3，R：GGT GAG AGG TCT AGT TCC CGA；血小板衍生生长因子，F：CCT GTG CCA TCC GCA GGA AGA GA，R：TTG GCC ACC TTG ACG CTG CGG TG；GAPDH，F：GGC ATC CTG ACC CTG AAG TA，R：GCC GAT AGT GAT GAC CTG。

实验所得的为Ct值，其于样品中mRNA含量呈正相关。把实验所得的基因Ct值整理好，然后用每个样品的目的基因Ct值减去该样品的内参基因(GAPDH)Ct值，从而得到?Ct；公式如下：

?Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)

将所有样品的?Ct整理好，以每个样本的?Ct减去正常组织的?Ct，并同时对所有结果取负数，该步运算得到的结果就是-??Ct。最后，对-??Ct进行2的幂运算，最后将所得到的数值进行统计分析。

2^-^??Ct=2^-{^?Ct(^样品组织^{)- ?Ct(}^正常组织⁾^}

1.5 主要观察指标阳极氧化涂层的电子显微镜扫描及元素组分分析；实验组与对照组钉道周围组织苏木精-伊红染色；实验组与对照组钉道周围组织血小板衍生生长因子及血管内皮生长因子因子定量检测。

1.6 统计学分析应用SPSS 22.0软件进行统计，计量数据均用x(_)±s表示，组内数据采用配对t 检验，组间数据采用单因素方差分析比较，P < 0.05说明差异有显著性意义。

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讨论

钛金属及钛合金因其机械强度高、抗腐蚀性能好、无毒、质轻等优势，从20世纪90年代起已在医疗领域得到了广泛应用。传统金属内植物材料具有低弹性模量、低密度的优点，其抗延展性和抗疲劳性的优势突出，已被广泛应用于临床^[10]。钛及钛合金相对密度小、机械强度高，相比于不锈钢(190-200 GPa)及Co．Cr合金(230 GPa)、钛及钛合金的弹性模量(110 GPa)更接近于人体骨，有利于降低植入体与人体骨界面的应力屏蔽，避免局部骨吸收现象造成的植入体松动或下沉^[11-12]。虽然目前使用纯钛作为内固定植入的临床经验较成熟，但商用纯钛并不能有效提供内固定负重材料所需要的综合力学性能，如耐磨性较差、生物相容性不高等，限制了它在临床上的应用。钛及钛合金亦有自身的不足，其表面具有较强吸附蛋白的能力，植入人体后表面形成蛋白层，而且钛生物惰性较强，与骨组织发生化学键性结构的能力较弱，于组织界面处容易形成纤维组织隔层，使植入体发生松动，螺钉-骨界面纤维组织形成是螺钉松动最主要的原因^[13-14]。

为了减少螺钉的松动，国内外学者做出了多种尝试。螺钉的外形设计能影响植入时热能的产生，当植入锥形螺钉时，较大的旋入扭矩可增强钉-骨界面的长期稳定性^[15-17]。Pettine等^[18-19]通过实验指出植，入螺钉时旋入扭矩68 N•m为参考值，旋入扭矩<68 N•m将显著增加螺钉松动的概率。一些学者发现，单纯加大螺钉直径也不能提高其稳定性；而通过骨水泥强化钉道后，能显著提高螺钉的轴向拔出力和抗疲劳能力，进而增加椎弓根螺钉的稳定性，减少螺钉的松动^[20]。Partale等^[21]报道在无细菌感染情况下，聚乳酸涂层螺钉能通过减少破骨细胞活性和减少骨重建而增强骨整合作用。此方法可减少螺钉的松动，但聚乳酸涂层不具有传导性，不利于长期应用。Rammelt等^[22]报道Ⅰ型胶原涂层、精氨酸甘氨酸-天门冬氨酸复合肽涂层有较强的骨诱导能力，能促进钉道骨愈合，减少螺钉松动的发生率。不同材料的涂层是近年来的研究热点，既往研究的涂层如羟基磷灰石、氮氧化物等，制作工艺复杂、材料费用高昂，且部分材料实验仍然停留在体外细胞实验层面。生物相容性的优劣是生物材料和机体组织反应、血液反应和免疫反应的结果，故此类材料是否适用于临床仍有待进一步研究。在化工产业中，阳极氧化技术为制作二氧化钛涂层经典且较成熟的工艺，制作方法简便。二氧化钛已被广泛应用于水质、土壤和空气净化、自清洁、消毒灭菌等多种领域，但作为涂层内固定方面研究尚少。

生物相容性指在机体内材料表面和组织之间产生反应的一种性能。根据国际标准化组织(International Standards Organization，ISO)会议的解释，生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容性。生物材料植入人体内后，会对局部组织和全身产生影响和作用，包括组织反应、血液反应和免疫反应，两者的循环作用一直持续，直到达到机体和材料表面的平衡或者植入的材料被排异去除。生物相容性是生物材料研究中始终贯穿的主题。机体的组织修复及免疫反应过程十分复杂，评价和分析某种材料的生物形容性需注意几个关键：首先，生物相容性是一个动态的不断变化过程，不是静止不变的；其次，生物相容性不单纯是材料本身的性质，而是材料与机体环境相互作用的结果。基于以上分析，在螺钉植入动物体内的不同时期(1 d后、1周后、4周后)，测定二氧化钛表面各个生长因子的含量及钉道周围组织炎症变化，可有效分析阳极氧化钛的生物相容性。二氧化钛可在体内、外诱导磷灰石的沉积及骨组织的形成，作为缓冲层，二氧化钛能有效隔离植入物和生物集体，而且能提高涂层和界面的强度^[23]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，是一种贴壁依赖性细胞，在骨愈合过程是关键性的功能细胞。大量研究证明，二氧化钛涂层可提高种植体表面的可黏附性，促进成骨细胞增殖和其他细胞功能，可提高周围骨与植入体的骨整合能力^[24-25]。纳米尺寸的二氧化钛还具有纳米结构特有的比表面积大、吸附能力强和耐腐蚀性强等优点，使得其在种植体表面改性领域也成为热门研究^[12^，^26-27]。

血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子在组织修复中有着关键作用。通过检测血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子基因的表达水平，可反映组织修复程度，进而进一步反映植入机体生物材料生物相容性的强弱。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。在此次实验中，应用RT-PCR技术来检测普通钛螺钉和阳极氧化钛螺钉周围组织中血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子基因表达水平，从而反映阳极氧化钛的生物相容性强弱。正常情况下，血小板和内皮细胞以α颗粒的形式储存血小板衍生生长因子，血小板衍生生长因子受体是一种跨膜糖蛋白，在激活后经级联式放大效应调控细胞功能，如靶细胞的分裂增殖。实验证明，特定细胞群分裂增殖的能力可被血小板衍生生长因子调控。血小板衍生生长因子是一种重要的促有丝分裂因子，可调控胶原酶，最终增加新组织的形成和加快细胞外基质的沉积^[28-29]。血管内皮生长因子可诱导微血管的再生，为组织修复创造条件并促进骨缺损修复^[30-32]。作者研究了实验组和对照组不同阶段的螺钉-骨界面生长因子(血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子)变化。在螺钉植入初期，实验组和对照组2种生长因子都处于低水平，统计学上无差异；在螺钉植入后1，4周组时，实验组2种生长因子的水平较对照组明显高，提示在实验组钉道周围骨组织愈合能力较对照组快，这与二氧化钛优越的生物相容性有关。Zhang等^[9]在体内、外实验中都证实了二氧化钛涂层钛螺钉较普通钛螺钉生物相容性好，可促进小鼠成骨细胞的增殖。在组织病理学检测中骨组织的苏木精-伊红染色，二氧化钛涂层的螺钉钉道骨组织破坏较少，螺纹清晰，这在一定程度上增加了螺钉的稳定性，减少了螺钉松动的发生率^[33-34]。二氧化钛涂层之所以能提高螺钉-骨界面强度，另一个很重要的原因在于：在阳极氧化过程中，螺钉的微观表面更加粗糙，这使得螺钉表面和骨组织的接触面积明显增加，这样即便在螺钉力学强度不理想的情况下，二氧化钛涂层仍能够提高骨整合作用，降低螺钉松动。

多发伤、严重的高能量创伤日渐增多，骨折切开复位内固定的应用越来越多，螺钉松动是不容忽视的并发症。近年来，各种新型生物材料的问世和改进，极大推动了骨折内外固定治疗的不断进展。此次研究是对人体植入物涂层的探索性研究，将来借助纳米技术、二氧化钛纳米管缓释生长因子系统等方法的研究，将进一步揭示内在机制。二氧化钛涂层生物相容性较普通钛螺钉强，用于骨折固定可有效预防螺钉松动。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程