钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层的体内成骨性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3115

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (16): 2461-2465.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3115

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钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层的体内成骨性能

张贤俊，赵锡江

江南大学附属医院骨科，江苏省无锡市 214062

收稿日期:2020-05-06 修回日期:2020-05-12 接受日期:2020-06-12 出版日期:2021-06-08 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 赵锡江，副主任医师，江南大学附属医院骨科，江苏省无锡市 214062
作者简介:张贤俊，男，1989年生，安徽省铜陵市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科及生物材料研究。
基金资助:
2017年无锡市卫生计生科研面上项目(MS201726)，项目负责人：赵锡江

In vivo osteogenic properties of silicon-incorporated titanium dioxide nanotubes on titanium screw surface

Zhang Xianjun, Zhao Xijiang

Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China

Received:2020-05-06 Revised:2020-05-12 Accepted:2020-06-12 Online:2021-06-08 Published:2021-01-07
Contact: Zhao Xijiang, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Xianjun, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Wuxi Municipal Health and Family Planning in 2017, No. MS201726 (to ZXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物力学：是应用力学原理和方法对生物体中的力学问题进行定量研究的生物物理学分支。人与动物骨头的压缩、拉伸、断裂强度理论及其状态参数都可应用材料力学的标准公式计算。
生物活性：在材料领域里主要指能在材料与生物组织界面上诱发特殊生物、化学反应的特性，这种反应导致材料和生物组织间形成化学键合。在生物矿化过程中主要指生物材料与活体骨产生化学键合的能力，是衡量生物材料的一个重要指标。

背景：目前假体及骨植入材料多采用钛及其合金材料，该类材料具有优越的力学特性及优良的抗腐蚀性，但其生物活性不足，很难与骨组织之间形成良好的化学键合。
目的：在纯钛螺钉表面制备含硅二氧化钛纳米管涂层，观察其体内促成骨性能。
方法：利用阳极氧化法在纯钛螺钉表面制备二氧化钛纳米管层(阳性对照组)，采用等离子体浸没离子植入和沉积法将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面(实验组)，以纯钛螺钉作为阴性对照组，采用扫描电镜观察各组形貌。将3种螺钉分别植入SD大鼠股骨内，植入后 2，4，6周取出股骨标本，进行生物力学检测；植入后6周进行免疫荧光分析。动物实验获得江南大学实验动物管理与动物福利伦理委员会批准。
结果与结论：①扫描电镜显示，实验组与阳性对照组均可见均匀一致的双层纳米管阵列，两组间无明显差异；②螺钉植入后第2，4周，实验组的螺钉平均峰值拔出力显著高于阳性对照组、阴性对照组(P < 0.05)，且阳性对照组显著高于阴性对照组(P < 0.05)；第6周时，3组螺钉的平均峰值拔出力比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③螺钉植入后第6周免疫荧光显示，阴性对照组螺钉周围几乎没有新生骨附着，实验组及阳性对照组的螺纹周围可见广泛的新生骨附着，其中实验组新骨生成最多；④结果表明，含硅二氧化钛纳米管层在大鼠体内可显著促进纯钛螺钉周围新生骨形成，并增加螺钉拔出力。
https://orcid.org/0000-0003-4935-7919 (张贤俊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 钛螺钉, 硅, 钛, 纳米管, 成骨, 涂层

Abstract: BACKGROUND: At present, titanium and its alloy materials are mostly used in prosthesis and bone implants. These materials have superior mechanical properties and excellent corrosion resistance, but their bioactivity is insufficient, so it is difficult to form a good chemical bond with bone tissue.
OBJECTIVE: To prepare titanium dioxide nanotube coating containing silicon on the surface of pure titanium screw and observe its osteogenic properties in vivo.
METHODS: Titanium dioxide nanotube layers were prepared on the surface of pure titanium screws by anodic oxidation method (positive control group). Silicon ions were deposited on the surface of titanium nanotube layers by plasma immersion ion implantation and deposition (experimental group). Pure titanium screws were used as negative control group. The morphology of each group was observed by scanning electron microscope. The three kinds of screws were implanted into the femur of SD rats. The femoral specimens were taken out at 2, 4 and 6 weeks after implantation for biomechanical test, and immunofluorescence analysis was performed at 6 weeks after implantation. The animal experiment was approved by the Ethics Committee of Experimental Animal Management and Animal Welfare of Jiangnan University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that uniform double-layer nanotube arrays were observed in the experimental group and the positive control group, and there was no significant difference between the two groups. (2) At 2 and 4 weeks after screw implantation, the average peak pullout force of the experimental group was significantly higher than that of the positive control group and the negative control group (P < 0.05), and the positive control group was significantly higher than the negative control group (P < 0.05). At the sixth week, there was no significant difference in pullout force among the three groups (P > 0.05). (3) Immunofluorescence showed that at 6 weeks after implantation, there was almost no new bone attachment around the screw in the negative control group, and extensive new bone attachment was observed around the screw thread in the experimental group and the positive control group, among which the new bone formation was the most in the experimental group. (4) The results showed that the silicon dioxide titanium nanotube layer could significantly promote the formation of new bone around the pure titanium screw and increase the pullout force of screws.

Key words: bone, material, titanium screw, silicon, titanium, nanotube, osteogenesis, coating

中图分类号:

张贤俊, 赵锡江. 钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层的体内成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2461-2465.

Zhang Xianjun, Zhao Xijiang. In vivo osteogenic properties of silicon-incorporated titanium dioxide nanotubes on titanium screw surface[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(16): 2461-2465.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

自20世纪60年代CHARNLEY首次进行全髋关节置换治疗取得成功以来，人工关节置换被广泛应用作为多种关节终末期疾患的首选治疗方法。经预测在2010至2030年间，美国中青年患者对人工关节置换的需求量将超过 50%，因此改善假体材料的表面性能，延长关节的使用寿命，减少假体松动就显得尤为重要 [1-2] 。
目前的假体及骨植入材料多采用钛及其合金材料，该类材料具有优越的力学特性及优良的抗腐蚀性，但其生物活性不足，很难与骨组织之间形成良好的化学键合，故目前多采用改变材料表面形貌及元素组成的方法改善植入材料的生物活性，如通过电化学处理方法在钛植入物表面形成一层致密的二氧化钛纳米管氧化膜，以提供比微结构化表面更宽的表面积，加速骨整合，或在植入物表面导入生物活性微量元素如钙、硅、锌、锶和镁等，这些元素能通过增强成骨细胞活性，刺激植入物表面骨生长及化学键合，从而改善植入材料的生物相容性及成骨活性 [3-6]。
基于以上认识，作者将具有成骨诱导能力的硅元素载入到有助于骨整合作用的纳米管上，以期望获得更为强效的成骨诱导及骨整合能力。体外实验证实，二氧化钛纳米管层可以通过等离子体浸没离子植入和沉积法加载硅离子，提高材料的生物活性，并可促进细胞的早期增殖和黏附、成骨相关基因表达及钙沉积等[1]。然而，体内骨组织中包含了多种细胞类型，且体内细胞与体外细胞相比受细胞基质、周围环境、血供等更多因素调控，使得这些结果并不能反映材料在生物体内的实际情况[7-10]，既往亦罕有其在生物体内成骨能力的研究报道，故对于钛螺钉表面含硅二氧化钛纳米管层对体内骨组织生长影响的进一步研究是必要的。实验将不同涂层表面的钛螺钉植入大鼠股骨内，通过螺钉拔出力及观察螺钉周围的成骨情况，评估其在体内的成骨能力，以期为植入物的表面设计提供进一步依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物对比观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2018年10月至2019年10月在江南大学医学院完成。
1.3 材料医用纯钛螺钉，长度10 mm，外螺纹直径2.0 mm，内螺纹直径1.7 mm，购自天津正天医疗器械有限公司，其材料学特性见表1。

实验动物：6月龄SD雄性大鼠36只，体质量270 g左右，SPF 级，购自江南大学动物实验中心，许可证号：JN.No20190515b0901231[062]。在适宜环境下喂养1周后进行实验。动物实验获得江南大学实验动物管理与动物福利伦理委员会批准。
主要设备：多功能离子注入系统(PIIIS-700，成都同创材料表面新技术工程中心)；X射线光电子能谱仪(XPS，Physical Electronic PHI5802，USA)；场发射扫描电镜(FEG-SEM，XL-30，Philips，荷兰)；HY-1080动态疲劳试验机(中国上海)；X射线衍射仪(XRD，Rigaku，Japan)；X射线光电子能谱仪(XPS，Physical Electronic PHI5802，USA)。
1.4 实验方法
1.4.1 二氧化钛纳米管及含硅二氧化钛纳米管螺钉制备将购买的医用纯钛螺钉使用去离子水及乙醇超声清洗后，于100 ℃下使用体积分数5%的草酸溶液预处理2 h[11]。然后将样品放入由体积分数1%氢氟酸组成的电解质中，在恒定电压(20 V)下阳极氧化30 min。通过空气干燥和超声波 (40 kHz，30 min)处理后，用三重蒸馏水冲洗样品，制成二氧化钛纳米管涂层螺钉样品(阳性对照组)。再将其放置在等离子体浸没离子注入设备的真空室靶台，进行硅离子注入。使用纯度为99.99%的硅为阴极，注入电压为-20 kV，注入脉宽为450 μs，频率6 Hz，时间为1 h，制成含硅二氧化钛纳米管涂层螺钉(实验组)。以纯钛螺钉作为阴性对照组。将3组钛螺钉采用60Co消毒后无菌储藏待用。
1.4.2 螺钉表面形貌及元素组成检测从3组螺钉中各随机抽取2个，在场发射扫描电镜下观察表面形貌，并用X射线衍射仪及X射线光电子能谱仪检测表面元素成分。
1.4.3 实验分组与处理将36只大鼠按随机数表法分阴性对照组、阳性对照组与实验组，分别植入对应的螺钉材料，每组12只。手术遵循无菌操作原则，采用3.5%水合氯醛麻醉成功后，于双膝外侧备皮，将大鼠仰卧固定于操作台，术区消毒铺巾；于膝外侧切开皮肤，暴露外侧股骨髁，尖刀剥离骨膜，于关节上缘3 mm、股骨前后缘中点处以直径1.2 mm钻头垂直钻深约4 mm，按预先分组迅速于双侧股骨各植入1枚螺钉，冲洗后缝合皮肤；3组动物操作方法相同。
螺钉植入后第2，4，6周，每组随机取3只大鼠处死，进行生物力学实验。植入后第6周，每组处死3只大鼠，处死前的第10天和第3天接受钙黄绿素皮下注射免疫荧光标记，进行免疫荧光分析。
1.5 主要观察指标
生物力学测定：取出植入钛螺钉的双侧股骨，采用HY-1080动态疲劳试验机进行生物力学测试，将骨端置于下端夹具的夹曹内，螺钉帽部分置入上端夹具内，按初始载荷0.1 N，以1 N/0.01 s速度递增，扫描间隔为0.001 s，当螺钉松动后停止受力(图1)。

免疫荧光染色：取出植入钛螺钉的双侧股骨，将18枚标本进行骨组织固定、脱钙、包埋、切片、封固后观察螺钉周围骨组织生长情况。将标本固定一两天，用PBS冲洗3次后(每次20 min)，放入10%EDTA脱钙液10 mL中，常温保存，每四五天更换脱钙液1次，四五周脱钙成功后进行石蜡包埋并切片，树胶封固后于荧光显微镜下观察拍照。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示，采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，两组间比较采用配对t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

植入物材料的设计需要考虑的因素是多方面的，其中以材料本身的生物力学性质和表面物理及化学性质最为重要，前者使得材料承受高应力成为可能，后者则是材料和周围组织相互作用并紧密结合的关键因素。如果植入物的硬度偏低，可能缩短其使用寿命。然而，如果其表面性质不能为内植物的表面和周围组织之间产生稳定连接，那么纤维层就会形成，从而影响骨-内植物界面负荷的传递，局部产生微动，最终导致固定或植入的失败[12]，因此生物材料的表面性质在组织工程中占有重要地位。研究发现，粗糙度可以作为单独因素影响成骨细胞在材料表面的黏附、扩散和增殖，而纳米级环境更是骨细胞生长的自然生理环境[13]，亦是骨组织整合植入的关键因素[14]。部分学者的早期研究显示，成骨细胞在纳米级二氧化钛表面的黏附性及功能与传统陶瓷相比有显著改善[15]，这可能与纳米级二氧化钛表面较常规微结构表面拥有更高的表面积与体积比及更大的生物可塑性有关[16]。SCHWARTZ等[17]通过提高螺钉表面的粗糙度进而提高了骨-螺钉界面的结合强度。然而，虽然通过改变植入物表面的微形态提高粗糙度，提高了骨-植入物界面的物理结合，但是生物化学性的键合未被提高，而这种键合似乎恰恰对于植入物的长期稳定起到更为重要的作用[18]。研究表明，当螺钉在体内时分别受到平行和垂直于螺钉方向的应力，界面的物理性结合可以很好地抵抗平行应力，但对于垂直应力抵抗不足，而这种垂直的牵张力才是致其松动的主要原因[19]。
因此，通过特定方法将银、锶、锌和硅等微量元素注入钛种植体的表面，以改变原有材料表面的元素组成及化学性质，从而提高材料表面的生物相容性和化学键合力是必要的。其中硅作为人体必需微量元素之一对于骨与软骨的生长发育至关重要。当含硅涂层材料植入体内后，首先在材料表面形成含硅层，继而产生丰富的碳酸羟基磷灰石层，使涂层具有更高的生物活性。当体内的硅摄入不足时会使得骨骼中硅含量降低，最终导致骨骼发育不良甚至畸形发育，而当补充硅元素使体内含量升高恢复正常时，骨骼发育不良现象消失[19]。不仅如此，既往研究发现在培养基内加入可溶性硅可使骨髓细胞繁殖得更快[20]。因此近些年来，国内外学者已经开始探索采用含硅涂层的材料替代传统的羟基磷灰石涂层材料。基于以上认识，作者认为对内植物表面的物理、化学性质进行合理设计是必要的，它可以促进内植物与周围组织的整合，并最终延长内植物的使用寿命。此次实验通过阳极氧化法在钛螺钉表面制备二氧化钛纳米管，并采用离子体浸没离子植入和沉积法加载硅离子至管层表面，成功制备出含硅二氧化钛纳米管螺钉，说明该方法可以在更为复杂的材料表面制备涂层。扫描电镜显示，掺入的硅元素亦并未改变二氧化钛纳米管涂层螺钉的物理形貌，硅离子分布在纳米管表面。
虽然目前的许多研究对细胞和纳米形貌间的相互作用机制做出了描述，但仍有许多未知之处诚待解决。例如，适宜细胞生长的纳米管最佳尺寸在不同的生物环境中存在变化，这就是为何大量研究试图使用动物模型进行体内实验来验证体外实验结果，并希望最后能用于临床研究。体外实验表明，30 nm二氧化钛纳米管是促进成骨细胞生长的最佳尺寸[20]，但在体内却不能刺激骨生长[21]。作者在前期研究中发现，含硅二氧化钛纳米管涂层在体外与成骨细胞共培养中具备更好的生物活性，并可促进细胞的早期增殖和黏附、成骨相关基因表达及钙沉积[1]，但其在生物体内是否具备相同的活性仍未可知。此次实验通过将含硅二氧化钛纳米管涂层螺钉植入大鼠股骨内，通过体内研究更确切地观察含硅二氧化钛纳米管涂层的生物学效应。结果显示，含硅二氧化钛纳米管涂层和二氧化钛纳米管涂层及钛与其周围的骨组织是生物相容的，并没有见到明显的排斥反应，3组植入物周围均显示正常的成骨行为，因此可证明含硅二氧化钛纳米管涂层材料是可用于体内的。
通过螺钉拔出力实验发现在螺钉植入大鼠股骨的第2，4周，含硅二氧化钛纳米管涂层螺钉的拔出峰值力较其他2组明显增大(P < 0.05)，而当饲养时间延长到第6周时3组材料之间比较差已无显著性意义，这说明硅离子的加入可以加快骨-植入物界面的早期物理性结合，使得植入物早期锚定于骨组织上。由于大鼠骨折愈合周期短，一般在4周时骨折线开始消失并出现骨骼塑形，6周可达到全部愈合，故在第6周时3组材料的螺钉拔出力比较差异无显著性意义。植入6周后通过免疫荧光发现，含硅二氧化钛纳米管涂层螺钉的螺纹周围较其他2组有更多的新生骨生成，骨细胞增殖增多，更多的骨接触出现在了螺钉内部，这可能与螺钉表面持续释放生理剂量的硅离子，使局部的硅离子浓度增高，从而不断促进骨细胞增生和新骨形成有关。当成骨细胞沿着植入物表面生长时，涂层内释放的硅离子可以促使成骨细胞分泌更多的骨质，使新生骨显著增加。目前的研究已发现硅离子可以促进Ⅰ型胶原合成，而后者是构成细胞外基质主要成分，可有效促进成骨细胞的分化[22]。在钛假体表面掺入硅可以增加其生物活性，并促进早期骨形成[23]。亦有针对硅离子生物活性的体内外实验证实，其有促进成骨和抑制破骨的双重作用[24]。
综上所述，此次实验通过将含硅二氧化钛纳米管涂层螺钉植入大鼠体内进行研究，发现含硅二氧化钛纳米管涂层的植入材料在大鼠体内可显著促进新生骨形成，增加螺钉早期拔出力与稳定性。但实验样本量较少，未对螺钉周围新生骨体积进行定量分析，大鼠饲养时间有限，对于材料与骨组织结合的长期效应有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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