基于雌激素受体研究氯化锂干预成骨细胞的分化及自噬

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1613

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 680-684.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1613

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

基于雌激素受体研究氯化锂干预成骨细胞的分化及自噬

付殷¹，孙贵才²，陈水林²，樊祥伟²，彭宇飞³

¹黑龙江中医药大学，黑龙江省哈尔滨市 150000；²南昌大学第四附属医院骨科，湖北省南昌市 330003；³黑龙江中医药大学附属第一医院骨伤一科，黑龙江省哈尔滨市 150000

修回日期:2018-11-23 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 孙贵才，博士，主任医师，南昌大学第四附属医院骨科，湖北省南昌市 330003
作者简介:付殷，女，1985年生，辽宁省凌源市人，汉族，2015年黑龙江中医药大学毕业，博士，主要从事药理学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81473503)，项目负责人：孙贵才

Lithium chloride increases differentiation and autophagy of osteoblasts inhibited by estrogen receptor

Fu Yin¹, Sun Guicai², Chen Shuilin², Fan Xiangwei², Peng Yufei³

¹Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China; ²Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Hubei Province, China; ³Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China

Revised:2018-11-23 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Sun Guicai, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Hubei Province, China
About author:Fu Yin, MD, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150000, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81473503 (to SGC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
氯化锂：是白色的晶体，具有潮解性，味咸。易溶于水及乙醇、丙酮、吡啶等有机溶剂，具有低毒性。但对眼睛和黏膜具有强烈的刺激和腐蚀作用。氯化锂主要用于空气调节领域，用作助焊剂、干燥剂、化学试剂，并用于制焰火、干电池和金属锂等。近几年发现可作为临床候选药物用于治疗骨代谢类疾病。
自噬：是细胞非必须生理过程中产生的营养物质以供给细胞维持生存营养物质的过程，是细胞的一种自我保护方式。

摘要
背景：临床应用锂治疗造血系统疾病和双极性疾病已经有数十年，并且发现锂可以直接刺激骨髓间充质干细胞的增殖。
目的：研究雌激素受体抑制下氯化锂对大鼠成骨细胞增殖分化及自噬的影响。
方法：实验选取10只出生72 h的SPF级SD乳鼠(由黑龙江中医药大学提供)。采用酶消化法和茜素红染色法获得和鉴定成骨细胞。取对数生长期成骨细胞，于培养基中加入不同浓度的氯化锂(0，1，2，5 nmol/L)处理24 h，采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。另取成骨细胞随机分为空白组(正常培养细胞)、抑制剂组(10^-7 mol/L ICI182780)、治疗组(5 nmol/L氯化锂+10^-7 mol /L ICI182780)。采用钙化结节染色及碱性磷酸酶活性检测各组成骨细胞分化情况；Western blot法测定各组成骨细胞中Beclin1和Runx2蛋白表达情况。
结果与结论：①倒置显微镜下观察细胞多为单核、多边形及梭形，局部有细胞密集的细胞团；②CCK-8法检测结果显示不同浓度的氯化锂都能对成骨细胞增殖产生促进作用，呈浓度依赖性；③茜素红染色结果显示与空白组比较，抑制剂组成骨细胞矿化能力明显降低，与抑制剂组比较，治疗组成骨细胞矿化结节能力明显增加(P < 0.05)；活性测定结果显示与空白组比较，抑制剂组中碱性磷酸酶活性明显降低，与抑制剂组比较，治疗组中碱性磷酸酶活性明显增加(P < 0.05)；④Western blot结果显示与空白组比较，抑制剂组中Beclin1和Runx2蛋白表达明显降低，与抑制剂组比较，治疗组中Beclin1和Runx2蛋白表达显著增加(P < 0.05)；⑤结果提示，雌激素受体抑制下氯化锂可以提高大鼠成骨细胞增殖分化及自噬。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1515-9378(孙贵才)

关键词: 氯化锂, 骨质疏松, 成骨细胞增殖, 雌激素受体, 自噬, 茜素红染色, 成骨细胞矿化结节, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Lithium has been used in the treatment of hematopoietic diseases and bipolar diseases for decades, and it can directly stimulate the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of lithium chloride on the proliferation, differentiation and autophagy of rat osteoblasts inhibited by estrogen receptor.
METHODS: Ten neonatal Sprague-Dawley rats, 72 days old, SPF grade, were provided by the Heilongjiang University of Chinese Medicine. (1) Osteoblasts were isolated by enzymatic digestion and alizarin red staining, and logarithmically growing osteoblasts were then cultured in media containing different concentrations of lithium chloride (0, 1, 2, 5 nmol/L) for 24 hours. Cell proliferation was measured by cell counting kit-8. (2) Osteoblasts at logarithmical growth phase were randomly divided into blank group (normal cultured cells), inhibitor group (10^-7 mol/L ICI182780), treatment group (5 nmol/L lithium chloride+10^-7 mol/L ICI 182780). Calcified nodule staining and alkaline phosphatase activity were used to detect the differentiation of osteoblasts. Expression of Beclin1 and Runx2 in osteoblasts were determined by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the inverted microscope, the cells were mostly mononuclear, polygonal and fusiform, with local cell-dense cell clusters. Results from the cell counting kit-8 assay showed that different concentrations of lithium chloride promoted the proliferation of osteoblasts in a concentration-dependent manner. Alizarin red staining results showed that the mineralization ability of osteoblasts was significantly reduced in the inhibitor group compared with the blank group, while compared with the inhibitor group, the mineralization ability of osteoblasts was increased significantly in the treatment group (P < 0.05). The activity of alkaline phosphatase was significantly reduced in the inhibitor group compared with the blank group, while compared with the inhibitory group, the activity of alkaline phosphatase increased significantly in the treatment group (P < 0.05). Western blot results showed that the expression of Beclin1 and Runx2 proteins in the inhibitor group decreased significantly compared with blank group, while compared with the inhibitor group, the expression of Beclin1 and Runx2 protein in the treatment group increased significantly (P < 0.05). In conclusion, lithium chloride can increase the proliferation, differentiation and autophagy of rat osteoblasts inhibited by estrogen receptor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lithium Chloride, Osteoblasts, Autophagy, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

付殷，孙贵才，陈水林，樊祥伟，彭宇飞. 基于雌激素受体研究氯化锂干预成骨细胞的分化及自噬[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 680-684.

Fu Yin, Sun Guicai, Chen Shuilin, Fan Xiangwei, Peng Yufei. Lithium chloride increases differentiation and autophagy of osteoblasts inhibited by estrogen receptor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 680-684.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

骨质疏松症被定义为一种骨疾病，其特征是骨强度受损及骨折风险增加^[1]。正常生理代谢情况下骨组织自噬能力低，在雌激素缺失或下降及氧化应激水平异常增高等相关因素共同影响下，骨组织细胞的自噬活性发生变化，进而引发了骨微环境中骨吸收与骨形成失衡，进一步导致骨质疏松的发生^[2]。自噬是维持细胞正常生理状态的重要机制，通过对成骨细胞增殖与分化来调节成骨细胞的活性和功能，影响了绝经后骨质疏松的发生与发展^[3]。目前为止，大多数有效治疗骨质疏松的方法是减少骨丢失，但很难恢复丢失的骨量和强度。因此，增加成骨细胞分化功能，刺激新骨形成是当前治疗骨质疏松的一种有效治疗手段^[4]。

与雌激素缺乏相关的骨质疏松症是年龄相关性骨丢失最常见的原因^[5]。激素替代疗法可以解决绝大多数绝经后的问题，但是长期使用会增加乳腺癌和子宫内膜癌的相关风险^[6]，所以课题组尝试寻找另一种治疗方法替代激素疗法。有研究发现通过锂刺激小鼠Wnt信号通路可以提高骨体积和骨密度，细胞水平研究发现锂可以通过刺激间充质干细胞增殖从而促进成骨能力^[7-8]。而且众所周知锂已被用于治疗抑郁症超过50年，特别是躁狂症，可用于短期或长期治疗。有研究数据表明，服用锂治疗精神障碍的患者骨量也增加，并且患者的骨转化率也随之降低^[9]。通过这些临床与基础研究观察发现，锂可作为临床候选药物用于治疗骨代谢类疾病^[10-11]。目前，锂对雌激素缺失引发的骨形成的作用和作用机制尚未得到很好的研究。因此，实验通过雌激素受体抑制时研究氯化锂对成骨细胞分化及自噬作用，并希望阐明锂对成骨细胞作用机制，这不仅可以提供一种简单有效的方法来加强治疗骨质疏松，也为锂对雌激素缺乏的临床应用提供了依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 于2017年1至12月在黑龙江中医药大学方剂实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 出生72 h的SPF级SD乳鼠10只，雌雄随机，体质量(10±3) g，由黑龙江中医药大学提供。动物合格证号：SCXK黑2015004。饲养环境：温度(23±2) ℃；相对湿度(55±15)%。

1.3.2 实验主要试剂及仪器 氯化锂、维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Sigma，美国)，胎牛血清、MEMα培养基、青霉素-链霉素混合液和胰酶、胶原酶I (Hyclone，美国)，CCK-8(同仁，日本)，Beclin1、Runx2、ICI182780 (Abcam，美国)，抗GAPDH抗体(苏州瀛睿生物技术有限公司，中国)，茜素红染液(索莱宝，中国)，PNPP(大连美伦，中国)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；全自动图像分析系统(Kontron，德国)，脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国)，凝胶成像系统、垂直凝胶电泳槽、电转槽(Bio-Rad，美国)，WFZ UV-2100可见紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司，中国)，EPS601电泳仪(GE Healthcare，美国)，5430 R低温高速离心机(Eppendorf，德国)。

1.4 方法

1.4.1 乳鼠颅骨成骨细胞分离 麻醉后无菌条件下剥离乳鼠头盖骨，去除结缔组织，用PBS冲洗颅骨，将颅骨剪碎，将剪碎组织移入1.5 mL离心管中，加入胰酶37 ℃的恒温摇床中，消化20 min，终止消化，4 ℃静置5 min，离心去上清，加入0.2%胶原酶Ⅰ，置入37 ℃恒温摇床中振荡消化60 min；终止消化，反复吹打过200目筛网过去除骨碎片，收集滤液，1 200 r/min离心8 min，弃上清，用完全培养基重悬浮细胞，接种于培养瓶中，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，每天观察成骨细胞生长状态，孵育2 d后换液，并在倒置显微镜下观察细胞生长至80%左右时，开始传代培养。传代培养至第3代细胞，收集成骨细胞用于实验^[5]。

1.4.2 CCK-8法检测成骨细胞增殖 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为10⁸ L^-1，接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，加入不同浓度的氯化锂(0，1，2，5 nmol/L)处理24 h，结束后每孔加入10 μL的CCK-8继续孵育3 h，然后在波长490 nm处用酶标仪检测测定每孔吸光度值^[12]。

1.4.3 成骨细胞分组 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为10⁸ L^-1，接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后。设空白组(正常培养细胞)、抑制剂组(10^-7 mol/L ICI182780)、治疗组(5 nmol/L氯化锂+10^-7 mol /L ICI182780)分别继续培养24 h^[13]。

1.4.4 钙化结节染色及碱性磷酸酶活性测定 取第3代成骨细胞加入成骨诱导剂(100 nmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸，7 mol/L地塞米松)诱导矿化结节。实验共分为3组，分别为空白组(矿化诱导培养基)、抑制剂组(10^-7 mol /L ICI182780)、治疗组(5 nmol/L 氯化锂+10^-7 mol/L ICI182780)，连续诱导21 d，诱导结束后用PBS冲洗，体积分数95%乙醇固定15 min，双蒸水冲洗3次，体积分数0.1%茜素红(pH 8.3)染色，37 ℃孵育1 h，双蒸水冲洗3次，显微镜下拍照。细胞连续培养21 d后弃培养液，PBS冲洗2遍，1% Triton X-100通透细胞裂解物在37 ℃孵育于磷酸盐底物30 min，加入1 mol/L的NaOH终止反应，在波长为405 nm测定其吸光度。根据蛋白质标准化的Sigma校正曲线，计算酶活性^[14-15]。

1.4.5 成骨细胞中Beclin1，Runx2蛋白含量的测定 取第3代成骨细胞，接种于6孔培养板，待细胞长至70%左右，按照实验分组加入相应的药物组，干预48 h药后，用Western blot及IP裂解液提取各组总蛋白，经8%-12% SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，体积分数5%脱脂奶粉室温孵育1 h后，加入相应的一抗稀释液(1∶100稀释)，4 ℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次，10 min/次，加入辣根酶标记的二抗工作液(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，滴加ECL显色液，凝胶成像系统摄片并分析计算^[16]。

1.5 主要观察指标 ①成骨细胞各组经成骨诱导液体外诱导后茜素红染色差异；②成骨细胞各组经成骨诱导液体外诱导后碱性磷酸酶活性差异；③成骨细胞各组经成骨诱导液体外诱导后成骨分化及自噬相关蛋白表达差异。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析及t 检验，结果以x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

骨质疏松症影响了50%的绝经后妇女和超过20%50岁以上男性的健康^[17]，其导致骨折风险增加，最常涉及椎体、髋部和前臂^[18-19]。在女性中，该病主要发生在绝经后，由于雌激素缺乏而导致骨重建失衡，导致骨丢失^[20-21]。目前已批准的骨质疏松药物被分类为骨吸收抑制剂(抗骨吸收剂)或促进骨形成药物(合成代谢)^[22-23]，其不良反应对于大多数骨质疏松妇女来说是不利的，会出现骨转换的加快和过度抑制骨吸收^[24-25]。骨质疏松症治疗在过去几十年中主要依赖于抗破骨细胞活性剂，它们对破骨细胞活性和骨吸收起着重要作用^[26-27]。因此，有必要尝试寻找一种双向调节成骨和破骨细胞的药物。文献报道氯化锂通过调节糖原合成酶激酶-3激活Wnt信号通路增加骨体积，及双向调节成骨细胞促进骨形成和抑制破骨细胞进行骨吸收，但具体机制在雌激素受体抑制时并不明确^[28-29]。所以当前实验尝试研究雌激素受体抑制时氯化锂对成骨细胞作用机制。

ICI182780是一种类固醇类选择性雌激素受体调节剂，是雌激素受体的特异性拮抗剂，ICI182780基本可以完全阻断雌激素的效应^[31-32]。CCK-8显示治疗组对比抑制剂组细胞增殖具有显著性差异，表现在雌激素受体抑制时氯化锂可以提高成骨细胞增殖。茜素红与碱性磷酸酶结果显示通过用ICI182780阻断雌激素后发现，氯化锂可以促进成骨细胞矿化能力与碱性磷酸酶活性，可见在雌激素受体抑制时的氯化锂可以提高骨分化与自噬。

有研究发现在生理状态下，自噬能够通过促进细胞的存活或死亡过程而发挥重要作用^[33]。Beclin1是自噬体形成中的关键分子，作为分子反应“平台”，介导自噬相关蛋白，并与多种蛋白相互反应调控形成自噬体^[34]。Runx2是一种成骨分化所需的特异性转录因子，是骨发育过程中激活与启动成骨细胞分化并调节成骨细胞成熟的重要转录因子，研究发现敲除Runx2基因导致成骨细胞分化完全被阻滞，Runx2是成骨细胞分化的标志^[35]。当前实验发现当雌激素受体抑制时氯化锂可以通过提高Beclin1蛋白表达，从而提高成骨细胞自噬，同时还能提高Runx2蛋白表达，促进成骨细胞分化。分子实验表明在雌激素受体抑制时氯化锂可以提高成骨细胞自噬与骨分化。

综上，当前研究提示在雌激素受体抑制下氯化锂可激活诱导成骨细胞自噬与分化。研究为雌激素缺失下引发骨质疏松类疾病提供一种治疗手段，激活自噬是一种潜在的促进骨分化愈合的新途径。该研究也具有一定的局限性，在氯化锂激活成骨细胞自噬与分化上并未深入研究二者之间的相互关系，因此这方面需要进一步的探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Lithium chloride increases differentiation and autophagy of osteoblasts inhibited by estrogen receptor

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