粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞增殖和干性基因表达的影响及作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1573

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 729-733.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1573

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粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞增殖和干性基因表达的影响及作用机制

谢东可，何霞，廖凯男

西南医科大学附属医院小儿外科，四川省泸州市 646000

修回日期:2018-10-30 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 廖凯男，硕士，副教授，西南医科大学附属医院小儿外科，四川省泸州市 646000
作者简介:谢东可，男，1986年生，山东省鱼台县人，汉族，2013年天津医科大学毕业，硕士，医师，主要从事小儿外科相关疾病临床及基础研究。
基金资助:
西南医科大学校级课题(2015-YJ092)，项目负责人：谢东可

Inhibitory effects and mechanisms of tetrandrine on proliferation and stemness marker expression of neuroblastoma stem cells

Xie Dongke, He Xia, Liao Kainan

Department of Pediatric Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2018-10-30 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Liao Kainan, Master, Associate professor, Department of Pediatric Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Xie Dongke, Master, Physician, Department of Pediatric Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Southwest Medical University, No. 2015-YJ092 (to XDK)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
粉防己碱：是从粉防己根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱成分，有大量的医用功能，包括血管生成、细胞毒性、抗炎作用、抗癌作用和抗高血压的功效。最近的研究证实了粉防己碱在多种肿瘤疾病如白血病、肺癌、肝癌、前列腺癌及肾癌等中具有抗癌活性。
Wnt/β-catenin信号通路：β-catenin与axin/APC、GSK3-β组成降解复合物，信号通路活化时，β-catenin分离并转移至核内与TCF/LEF结合调控下游靶基因。Wnt/β-catenin信号通路对于维持肝癌、大肠癌、肺癌、神经母细胞瘤及膀胱癌等肿瘤干细胞特性起到重要作用。

摘要
背景：研究发现粉防己碱能通过下调β-catenin表达抑制神经胶质瘤干细胞特性，然而其对神经母细胞瘤干细胞的影响未见报道。
目的：探讨粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞增殖及干性标志物表达的影响，并探究其分子机制。
方法：使用无血清悬浮法从神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中获取肿瘤干细胞，给予粉防己碱干预，通过MTT法检测粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞的增殖抑制作用，细胞免疫荧光染色检测粉防己碱干预后Nestin蛋白水平变化，克隆球形成实验检测粉防己碱干预后肿瘤干细胞成球能力变化，qRT-PCR法检测粉防己碱干预后CD133、Oct-4、Nestin mRNA表达，Western blot检测粉防己碱干预后CD133、Oct-4、Nestin、p-GSK3β和β-catenin蛋白表达。
结果与结论：与未干预组比较，粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞增殖能力降低(P < 0.05)，CD133、Oct-4和Nestin mRNA表达降低(P < 0.05)，Nestin蛋白荧光强度减弱，克隆球形成能力减弱(P < 0.05)，CD133、Oct-4、Nestin、p-GSK3β和β-catenin蛋白减少(P < 0.05)。结果表明，粉防己碱抑制神经母细胞瘤干细胞增殖并降低干性标志物表达，可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9866-5195(谢东可)

关键词: 神经母细胞瘤, 肿瘤干细胞, 粉防己碱, 细胞增殖, CD133, Oct-4, Nestin, Wnt/β-catenin信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that tetrandrine can inhibit the characteristics of glioma stem cells by down-regulating the expression of β-catenin. However, its effect on neuroblastoma stem cells has not been reported.
OBJECTIVE: To explore the function and mechanism of tetrandrine on proliferation and stemness marker expression of neuroblastoma stem cells.
METHODS: Serum-free suspension method was used to obtain SK-N-SH stem cells. SK-N-SH stem cells were treated with tetrandrine, and the inhibitory effect of tetrandrine on the proliferation of neuroblastoma stem cells was detected by MTT method. Immunofluorescence staining was used to detect Nestin expression in the cells after intervention with tetrandrine. The tumorsphere-forming ability of SK-N-SH stem cells was determined by tumorsphere-forming assay. The mRNA levels of CD133, Oct-4 and Nestin were tested by qRT-PCR. The protein level of CD133, Oct-4, Nestin, p-GSK3β and β-catenin were tested by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Tetrandrine inhibited the proliferation of SK-N-SH stem cells (P < 0.05). After treated with tetrandrine, the mRNA levels of CD133, Oct-4 and Nestin in SK-N-SH stem cells were significantly decreased (P < 0.05). Fluorescence intensity of Nestin protien was weakened and the tumorsphere-forming ability of SK-N-SH stem cells was abated (P < 0.05). Tetrandrine also inhibited the protein levels of CD133, Oct-4, Nestin, p-GSK3β and β-catenin (P < 0.05). In conclusion, tetrandrine inhibits the proliferation and stemness marker expression of neuroblastoma stem cells, and the mechanism may be related to the inhibition of Wnt/β-catenin signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neuroblastoma, Neoplastic Stem Cells, Benzylisoquinolines, Tissue Engineering

中图分类号:

谢东可，何霞，廖凯男. 粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞增殖和干性基因表达的影响及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 729-733.

Xie Dongke, He Xia, Liao Kainan. Inhibitory effects and mechanisms of tetrandrine on proliferation and stemness marker expression of neuroblastoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 729-733.

图/表（结果） 1

2.1 神经母细胞瘤SK-N-SH干细胞鉴定结果 普通培养基培养神经母细胞瘤细胞，见图1A，无血清培养基培养2周可见悬浮生长的细胞球，离心吹打后传代培养获得新细胞球，见图1B。提取SK-N-SH细胞和SK-N-SH干细胞的蛋白和mRNA，通过Western blot和qRT-PCR检测CD133、Oct-4和Nestin表达，发现SK-N-SH干细胞中CD133、Oct-4、Nestin的蛋白和mRNA表达明显升高，见图1C和图1D，证实成功获取SK-N-SH干细胞。

2.2 粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞增殖 使用0，0.625，1.25，2.5，5.0，7.5，10.0 µmol/L粉防己碱处理SK-N-SH干细胞24 h，MTT实验检测SK-N-SH干细胞增殖能力的变化。结果显示，粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞增殖能力，呈浓度依赖性，粉防己碱对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)为3.749 µmol/L，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 免疫荧光检测粉防己碱处理后SK-N-SH干细胞Nestin蛋白表达 使用5 µmol/L粉防己碱处理SK-N-SH干细胞，应用细胞免疫荧光检测SK-N-SH干细胞Nestin蛋白表达，结果显示对照组Nestin表达阳性，而粉防己碱处理组Nestin表达减弱，见图3。

2.4 粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞的干细胞标志物表达 使用2.5 µmol/L和5 µmol/L粉防己碱处理SK-N-SH干细胞，蛋白提取后使用Western blot检测CD133、Oct-4和Nestin蛋白表达，结果发现粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞CD133、Oct-4和Nestin蛋白表达，见图4A。使用qRT-PCR检测CD133、Oct-4和Nestin mRNA表达，结果发现粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞CD133、Oct-4和Nestin mRNA表达，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图4B。

2.5 粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞克隆球形成能力 使用2.5，5 µmol/L粉防己碱处理SK-N-SH干细胞，通过肿瘤干细胞克隆球形成实验检测粉防己碱对SK-N-SH干细胞干性的影响。结果显示，粉防己碱处理后干细胞克隆球体积减小，见图5A。与对照组相比，粉防己碱处理组克隆球数量减少，见图5B，并呈浓度依赖性，差异有显著性意义(P=0.019和P=0.002)。

2.6 粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞Wnt/β-catenin信号通路 使用2.5，5 µmol/L粉防己碱处理SK-N-SH干细胞并提取蛋白，通过Western blot检测p-GSK3β和β-catenin蛋白表达，见图6。结果显示，2.5，5 µmol/L粉防己碱明显抑制p-GSK3β和β-catenin蛋白水平，提示粉防己碱抑制SK-N-SH干细胞Wnt/β-catenin信号通路。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察及探究性实验分析。

1.2 时间及地点 实验于2017年7月至2018年7月在西南医科大学实验室完成。

1.3 材料 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株(美国ATCC细胞库)；DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；粉防己碱、胎牛血清(美国Sigma-Aldrich公司)，粉防己碱溶解于0.1 mol/L HCl；表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27(美国Gibco公司)；总RNA提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)；兔抗人CD133单克隆抗体和Nestin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗人p-GSK3β和β-catenin单克隆抗体(CST公司)；兔抗人Oct-4单克隆抗体(Abcam公司)；鼠抗人β-actin抗体(万类生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养和克隆球形成实验 参照文献[10]方法分离培养神经母细胞瘤干细胞。将神经母细胞瘤SK-N-SH细胞离心、计数、调整细胞密度，按照4×10³/孔接种于DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，2%B27)，将培养板放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱内培养，6 d后细胞换液，10 d左右离心，重新接种于新的DMEM/F12无血清培养基中，细胞克隆球传代3次后认为是肿瘤干细胞，通过Western blot和qRT-PCR检测CD133、Oct-4和Nestin表达。

1.4.2 MTT法检测细胞增殖情况 将生长良好的SK-N-SH细胞克隆球(3代以后)接种至96孔培养板，每孔5.0×10³细胞，设5个平行复孔，培养24 h更换培养液，分别加入0，0.625，1.25，2.5，5.0，7.5，10.0 µmol/L粉防己碱，处理24 h后倾去培养液，加入5 g/L MTT溶液20 μL，培养4 h后倾去MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡器低速振荡10 min，酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度值，绘制细胞增殖抑制曲线，计算细胞增殖抑制率。

1.4.3 细胞免疫荧光观察Nestin蛋白表达 将生长良好的SK-N-SH细胞克隆球(3代以后)种植至6孔板中，每孔5.0×10⁴细胞，每孔内含有多聚赖氨酸包被的盖玻片，待细胞贴壁后加入5.0 µmol/L粉防己碱处理24 h，对照组未给予粉防己碱处理，加入0.1 mol/L HCl。取出爬片，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗，加入抗Nestin抗体，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，加入荧光二抗常温避光孵育1 h，PBS冲洗，加入DAPI染色5 min，封固，置于荧光显微镜下观察拍照。

1.4.4 Western blot实验检测CD133、Oct-4、Nestin以及p-GSK3β和β-catenin蛋白表达 将SK-N-SH细胞克隆球(3代以后)接种于6孔板，每孔2.0×10⁵细胞，细胞贴壁后加入2.5，5.0 µmol/L粉防己碱处理24 h，对照组未给予粉防己碱处理，加入0.1 mol/L HCl，PBS清洗3次，加入蛋白裂解液裂解细胞，振荡混匀后4 ℃离心15 min，收集上清液，使用BCA法进行蛋白定量，将蛋白加入Loading buffer并沸水煮沸5 min，以每孔30 µg蛋白计算每孔上样体积，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜到PVDF滤膜，5%封闭液常温封闭1 h，加入一抗于4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，加入对应二抗摇床室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显影液进行化学发光显影。

1.4.5 qRT-PCR检测CD133、Oct-4和Nestin mRNA表达 将SK-N-SH细胞克隆球(3代以后)接种于6孔板，每孔2.0×10⁵细胞，待细胞生长至70%-80%加入2.5，5.0 µmol/L粉防己碱处理24 h，对照组未给予粉防己碱处理，加入0.1 mol/L HCl，PBS清洗3次，使用上海飞捷RNAfast200试剂盒提取总RNA，RNA反转录获得cDNA模板。使用TaKaRa SYBR^@PrimixEx Taq^TM Ⅱ反应体系进行实时定量 PCR 扩增，CD133上游引物序列为5'-AGT CGG AAA CTG GCA GAT AGC-3'，下游引物序列为5'-GGT AGT GTT GTA CTG GGC CAA T-3'；Oct-4上游引物序列为5'-CTG GGT TGA TCC TCG GAC CT-3'，下游引物序列为5'-CCA TCG GAG TTG CTC TCC A-3'；Nestin上游引物序列为5'-CTG CTA CCCT TGA GAC ACC TG-3'，下游引物序列为5'-GGG CTC TGA TCT CTG CAT CTA C-3'。β-actin作为内参，上游引物序列为5'-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3'，下游引物序列为5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3'。各基因的相关表达量采用2^-ΔΔCt计算方法进行分析。

1.4.6 克隆球形成能力实验 将SK-N-SH细胞克隆球(3代以后)离心、计数、调整细胞密度，按照4×10³/孔接种于DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，2%B27)，实验组加入2.5，5.0 µmol/L粉防己碱，对照组未给予粉防己碱处理，加入0.1 mol/L HCl，将培养板放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱内培养，7 d时细胞离心并更换新鲜DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L成纤维细胞生长因子，2%B27)，14 d时倒置显微镜下观察拍照，并计数克隆球个数。

1.5 主要观察指标 ①Western blot和qRT-PCR检测CD133、Oct-4和Nestin蛋白及mRNA表达，确定培养的肿瘤球是SK-N-SH干细胞；②MTT实验检测粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞的增殖情况；③细胞免疫荧光染色检测粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞Nestin蛋白水平；④克隆球形成实验检测粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞成球能力；⑤qRT-PCR法检测粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞中CD133、Oct-4、Nestin mRNA表达改变；⑥Western blot检测粉防己碱干预后SK-N-SH干细胞中CD133、Oct-4、Nestin、p-GSK3β和β-catenin蛋白表达改变。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示，组间均数比较采用独立样本t 检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肿瘤干细胞具有自我更新、不定向分化潜能，是肿瘤发生发展、复发转移及耐药的根源之一^[11-12]，肿瘤干细胞广泛存在于神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、胃癌、肾癌及乳腺癌等肿瘤中^[13-18]，针对肿瘤干细胞的治疗越来越受到关注。肿瘤干细胞鉴定主要通过分子标记和功能鉴定，CD133、Nestin、CD114及Oct-4等干细胞分子标记物常常用于肿瘤干细胞球分离及鉴定^[10^，^19-21]。该研究通过悬浮培养法获得神经母细胞瘤干细胞，为了鉴定所得克隆球细胞是否具有干细胞特性，通过蛋白免疫印迹和qRT-PCR的方法发现克隆球CD133、Nestin及Oct-4等干性分子标记物表达升高，验证克隆球具有干细胞特性。

生物提取物粉防己碱作为抗癌药物越来越受到关注，体内和体外研究发现粉防己碱在前列腺癌、肾癌、肺癌等肿瘤中发挥抗肿瘤功能^[22-23]。此外，长春瑞滨联合应用粉防己碱能够抑制神经胶质瘤干细胞，可用于脑胶质瘤治疗^[24]。此研究重点讨论粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞的抑制作用，使用粉防己碱处理神经母细胞瘤干细胞，其能够抑制CD133、Nestin及Oct-4干细胞标记物表达。同时，应用细胞免疫荧光技术检测粉防己碱处理后Nestin表达变化，发现神经前体细胞标记Nestin的表达降低。无血清培养肿瘤细胞形成的肿瘤球具有干细胞特性，粉防己碱处理后克隆球体积减小、数量减少，具有抑制SK-N-SH干细胞克隆球形成能力。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤干细胞特性方面发挥重要作用，Wnt信号通路活化时，β-catenin与axin/APC、GSK3β组成的降解复合物分离，转移至核内与TCF/LEF结合调控下游基因。当Wnt信号通路未活化时，β-catenin与降解复合物结合，发生磷酸化并降解^[25-26]。最新研究发现，Wnt/β-catenin信号通路对于维持肝癌、大肠癌、肺癌、神经母细胞瘤及膀胱癌等肿瘤干细胞特性起到重要作用^[27-30]，该研究通过Western blot检测发现粉防己碱处理能够抑制p-GSK3β和β-catenin蛋白水平，说明粉防己碱抑制神经母细胞瘤干细胞增殖，并降低干细胞标志物表达，机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

上述结果显示，粉防己碱能够抑制神经母细胞瘤干细胞增殖及干性标志物表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路是其可能的分子机制，为研究粉防己碱治疗神经母细胞瘤提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

粉防己碱对神经母细胞瘤干细胞增殖和干性基因表达的影响及作用机制

Inhibitory effects and mechanisms of tetrandrine on proliferation and stemness marker expression of neuroblastoma stem cells

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