转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植抑制大鼠肺纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1529

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因沉默：是基因表达调控的一种重要方式，是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制，在外源DNA侵入、病毒侵染和DNA转座、重排中有普遍性。对基因沉默进行深入研究，可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质；利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的，所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义。
肺纤维化：是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(瘢痕形成)。绝大部分肺纤维化患者病因不明(特发性)，这组疾病称为特发性间质性肺炎，是间质性肺病中一大类。而特发性间质性肺炎中最常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型为特发性肺纤维化，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病。

摘要
背景：大量动物实验证明转化生长因子β1基因是目前肺纤维化的研究热点和重要的药物作用靶点。
目的：探讨转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植对大鼠肺纤维化的影响。
方法：①构建靶向转化生长因子β1的siRNA质粒，转染内皮祖细胞，分为空白组、对照组及转化生长因子β1基因沉默组，Western blot检测转染第3天和第28天转化生长因子β1表达；②80只Wistar大鼠(北京维通利华动物实验技术有限公司提供)分为正常对照组、肺纤维化模型组、内皮祖细胞组、转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组，后3组大鼠气管内分别一次性注入0.3 mL博莱霉素溶液(5 mg/kg)以制备大鼠肺纤维化病理模型，造模后24 h，正常对照组和肺纤维化模型组大鼠尾静脉注射20 μL生理盐水，内皮祖细胞组及转化生长因子β1沉默组大鼠尾静脉注射20 μL细胞浓度为3×10⁶ L^-1的内皮祖细胞悬液或转化生长因子β1沉默内皮祖细胞悬液；③移植28 d后，ELISA测定大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞介素10、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子α水平，苏木精-伊红染色观察肺组织病理变化，RT-PCR、Western blot检测肺组织中转化生长因子β1及Smad-2、Smad-7的表达。
结果与结论：①在转染后第3天和第28天，转化生长因子β1基因沉默组的转化生长因子β1蛋白相对表达水平低于空白组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②内皮祖细胞组较肺纤维化模型组病理变化减轻，肺泡间隔厚度低，转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组病理变化进一步减轻；③内皮祖细胞组白细胞介素10、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子α水平较肺纤维化模型组降低(P < 0.05)，转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组进一步降低，但与内皮祖细胞组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；④与肺纤维化模型组相比，内皮祖细胞组和转化生长因子β1沉默组大鼠肺组织中转化生长因子β1和Smad-2的基因和蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，而Smad-7表达水平明显升高(P < 0.05)。转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组上述3种基因和蛋白表达水平均优于内皮祖细胞组(P < 0.05)；⑤结果表明，转化生长因子β1沉默内皮祖细胞移植对肺纤维化大鼠有保护作用，可能通过降低Smad-2及增强Smad-7表达，发挥抑制肺纤维化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-8618-5063(彭秋凤)

关键词: 肺纤维化, 内皮祖细胞, 转化生长因子β1, 基因沉默, Smad-2, Smad-7, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Abundant animal experiments have shown that transforming growth factor β1 (TGF- β1) gene is a hotspot of pulmonary fibrosis and an important target for drugs.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effect of the transplantation of endothelial progenitor cells with RNA interference targeting TGF-β1 in the rats with pulmonary fibrosis.
METHODS: (1) The siRNA plasmid directed to TGF-β1 was constructed and transfected into endothelial progenitor cells. It was divided into blank group, control group and TGF-β1-siRNA transfection group. The expression of TGF-β1 at 3 and 28 days after transfection was detected by western blot assay. (2) Eighty Wistar rats provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. were divided into control, model, endothelial progenitor cell, and TGF-β1 silent groups. The rat trachea in the latter three groups was injected with 0.3 mL of bleomycin (5 mg/kg) to establish the rat model of pulmonary fibrosis. At 24 hours after modeling, the control and model groups received the injection of 20 μL of normal saline via caudal vein, and the endothelial progenitor cell, and TGF-β1 silent groups subjected to the injection of 20 μL 3×10⁶/L endothelial progenitor cell suspension and TGF-β1 silent endothelial progenitor cell suspension, respectively. (3) After 28 days of transplantation, the levels of interleukin-10, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α in the rat bronchoalveolar lavage fluid were detected by ELISA. The pathological changes of lung tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Expression levels of TGF-β1, Smad-2, and Smad-7 were detected by RT-PCR, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The protein expression of TGF-β1 in the TGF-β1-siRNA transfection group was significantly lower than that in the blank and control groups at 3 and 28 days after transfection (P < 0.05). (2) Compared with the model group, the pulmonary fibrosis was relieved in the endothelial progenitor cell group with reduced alveolar interval thickness and further attenuated in the TGF-β1 silent group. (3) The levels of interleukin-10, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α in the endothelial progenitor cell group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). These factor levels in the TGF-β1 silent group were lower than those in the endothelial progenitor cell group (P > 0.05). (4) Compared with the model group, the mRNA and protein expression levels of TGF-β1 and Smad-2 in the endothelial progenitor cell and TGF-β1 silent groups were significantly decreased, the levels of Smad-7 were significantly increased (both P < 0.05). All above levels in the TGF-β1 silent group were significantly superior to those in the endothelial progenitor cell group (P < 0.05). (5) To conclude, TGF-β1 silent endothelial progenitor cell transplantation has a protective effect against pulmonary fibrosis in rats and probably inhibits pulmonary fibrosis by reducing Smad-2 and enhancing Smad-7 expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Pulmonary Fibrosis, Endothelial Cells, Gene Silencing, Transforming Growth Factor beta1, Smad2 Protein, Smad7 Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

彭秋凤，高静珍，叶奎，邢爱民 . 转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植抑制大鼠肺纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 90-95.

Peng Qiufeng, Gao Jingzhen, Ye Kui, Xing Aimin. Transplantation of endothelial progenitor cells with RNA interference targeting transforming growth factor beta1 inhibits pulmonary fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 90-95.

图/表（结果） 6

2.1 内皮祖细胞的形态 倒置显微镜下观察复苏培养贴壁的内皮祖细胞，大多数细胞呈短梭形，且细胞体积增大，贴壁细胞接近融合，融合细胞形成铺路石样改变，见图1A。CM-Dil标记的内皮祖细胞在荧光显微镜下呈红色荧光，阳性标记率达98%以上，见图1B。

2.2 Western-blot检测内皮祖细胞中TGF-β1的表达水平 见表1和图2。在转染后第3天和第28天，空白组与对照组细胞中TGF-β1的蛋白相对表达水平差异无显著性意义。TGF-β1基因沉默组的TGF-β1蛋白相对表达水平低于空白组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 ELISA检测肺泡灌洗液中细胞因子水平 见表2。正常对照组大鼠肺泡灌洗液中的白细胞介素10、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平均显著低于其他3组(P < 0.05)。内皮祖细胞组大鼠肺泡灌洗液中3种炎性因子水平均显著低于肺纤维化模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)。内皮祖细胞组大鼠肺泡灌洗液中3种细胞因子水平与TGF-β1沉默内皮祖细胞组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 荧光显微镜下观察内皮祖细胞的存活情况 见图3。对照组和肺纤维化模型组大鼠肺组织中并未见到有CM-Dil标记阳性细胞；内皮祖细胞组和TGF-β1沉默内皮祖细胞组大鼠肺部纤维化区域中可见较多的CM-Dil标记阳性细胞，TGF-β1沉默内皮祖细胞组[(45.62±5.17)个/高倍视野]明显高于内皮祖细胞组[(15.74±2.27)个/高倍视野]。

2.5 苏木精-伊红染色观察肺组织病理形态变化 见图4。与正常对照组肺泡间隔厚度[(50.18±2.27) μm]相比，肺纤维化模型组肺泡间隔增厚[(92.32±8.57) μm]，肺脏组织充血明显，肺泡内有纤维性蛋白浸润，此外还有大量炎性细胞。与肺纤维化模型组相比，内皮祖细胞组肺部纤维化病理变化明显减轻，肺泡间隔厚度显著降低[(79.56±6.42) μm]；TGF-β1沉默内皮祖细胞组肺部纤维化病理变化进一步减轻，肺泡间隔厚度进一步降低[(63.48±5.62) μm]。

2.6 RT-PCR和Western blot检测肺组织中转化生长因子β1、Smad-2、Smad-7的表达水平 见表3和图5。肺纤维化模型组肺组织中转化生长因子β1、Smad-2的mRNA和蛋白表达水平最高，正常对照组最低；与肺纤维化模型组比较，内皮祖细胞组、TGF-β1沉默内皮祖细胞组肺组织中转化生长因子β1、Smad-2的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。与内皮祖细胞组比较，TGF-β1沉默内皮祖细胞组肺组织中转化生长因子β1、Smad-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)。

肺纤维化模型组肺组织中Smad-7的mRNA和蛋白的表达水平最低，正常对照组最高；与肺纤维化模型组比较，内皮祖细胞组、TGF-β1沉默内皮祖细胞组肺组织中Smad-7的mRNA和蛋白的表达水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。与内皮祖细胞组比较，TGF-β1沉默内皮祖细胞组肺组织中Smad-7的mRNA和蛋白表达水平显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] 魏燕华,刘桂桃.肺纤维化的治疗进展[J].临床肺科杂志, 2014,19(2): 336-339.

[2] Kumagai S, Marumo S, Yamanashi K, et al. Prognostic significance of combined pulmonary fibrosis and emphysema in patients with resected non-small-cell lung cancer: a retrospective cohort study. Eur J Cardiothorac Surg. 2014;46(6):e113-119.

[3] 何爱明,金美芳,叶瑞洪.肺成纤维细胞在博来霉素致肺纤维化中的作用机制[J].心肺血管病杂志,2015,34(11):863-866.

[4] Pan Y, Fu H, Kong Q, et al. Prevention of pulmonary fibrosis with salvianolic acid a by inducing fibroblast cell cycle arrest and promoting apoptosis. J Ethnopharmacol. 2014;155(3):1589-1596.

[5] 肖梦.姜黄素对肺纤维化大鼠内皮祖细胞的影响[D]. 重庆:重庆医科大学, 2015.

[6] 陈玉凤.骨髓间充质干细胞对百草枯中毒导致肺纤维化的影响及机制[D]. 福州:福建医科大学,2015.

[7] 刘哲,张晓梅,尹婷,等.肺纤方提取物干预肺纤维化模型大鼠肺微血管内皮细胞新生血管形成的体外研究[J].北京中医药大学学报, 2015,38(4):233-235.

[8] 刘哲,张晓梅,秦慧慧,等.肺纤方提取物干预肺纤维化模型大鼠微血管内皮细胞黏附及游走迁移作用研究[J].中华中医药杂志, 2015,30(11):4042-4044.

[9] Mahmoudi T, Fathi F, Rezaei MJ, et al. Transgenic Mice Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis. International Congress of Immunology & Allergy of Iran, 2016.

[10] Zhou MI, Chen DL, Jiang T, et al. Effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells transfected with survivin on pulmonary fibrosis in mice. Exp Ther Med. 2015;10(5):1857-1864.

[11] Fikry EM, Safar MM, Hasan WA, et al. Bone Marrow and Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Alleviate Methotrexate-Induced Pulmonary Fibrosis in Rat: Comparison with Dexamethasone. J Biochem Mol Toxicol. 2015;29(7):321-329.

[12] 龚如.内皮祖细胞在缺血性脑血管疾病治疗中的研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志,2014,41(2):130-133.

[13] 李文华,张群辉,戎浩,等.内皮祖细胞与高血压病的应用研究进展[J].中国组织工程研究,2016,20(15):2273-2280.

[14] 毛梅,王健瑜,汪丽,等.内皮祖细胞对急性损伤肺组织的抗炎作用[J].第三军医大学学报,2015,37(24):2444-2447.

[15] Li C, Wilson PB, Levine E, et al. TGF-beta1 levels in pre-treatment plasma identify breast cancer patients at risk of developing post-radiotherapy fibrosis. Int J Cancer. 1999;84(2):155-159.

[16] Lu C, Zhang J, Zhang D, et al. EPCs in vascular repair: how can we clear the hurdles between bench and bedside. Front Biosci (Landmark Ed). 2014;19:34-48.

[17] Rurali E, Bassetti B, Perrucci GL, et al. BM ageing: Implication for cell therapy with EPCs. Mech Ageing Dev. 2016;159:4-13.

[18] Chong MS, Ng WK, Chan JK. Concise Review: Endothelial Progenitor Cells in Regenerative Medicine: Applications and Challenges. Stem Cells Transl Med. 2016;5(4):530-538.

[19] Sun K, Zhou Z, Ju X, et al. Combined transplantation of mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells for tissue engineering: a systematic review and meta-analysis. Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):151.

[20] Salmina AB, Morgun AV, Kuvacheva NV, et al. Endothelial progenitor cells in cerebral endothelium development and repair (review). Sovremennye Tehnologii. 2015;6(4):213-221.

[21] Ikutomi M, Sahara M, Nakajima T, et al. Diverse contribution of bone marrow-derived late-outgrowth endothelial progenitor cells to vascular repair under pulmonary arterial hypertension and arterial neointimal formation. J Mol Cell Cardiol. 2015;86:121-135.

[22] Doyle MF, Tracy RP, Parikh MA, et al. Endothelial progenitor cells in chronic obstructive pulmonary disease and emphysema. PLoS One. 2017;12(3):e0173446.

[23] Xu BJ, Chen J, Chen X, et al. High shear stress-induced pulmonary hypertension alleviated by endothelial progenitor cells independent of autophagy. World J Pediatr. 2015;11(2):171-176.

[24] 孙宏,刘显东,吕迪宇,等.转化生长因子-β/Smad信号通路对急性肺损伤小鼠免疫平衡的影响[J].中华危重病急救医学, 2016,28(11):967-972.

[25] Ji H, Li Y, Jiang F, et al. Inhibition of transforming growth factor beta/SMAD signal by MiR-155 is involved in arsenic trioxide-induced anti-angiogenesis in prostate cancer. Cancer Sci. 2014;105(12): 1541-1549.

[26] 顾刘宝,卞茸文,涂玥,等.虫草素调控eIF2α/TGF-β/Smad信号通路改善肾间质纤维化的机制[J].中国中药杂志, 2014,39(21):4096-4101.

[27] 邵笑,祝骥,赵峻峰,等.丹参酮ⅡA对大鼠肺纤维化细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响[J].浙江中西医结合杂志, 2016,26(5):414-417.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年3月至2018年1月在天津医科大学内分泌研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量200-250 g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(津)2014-0002。大鼠均饲养于25 ℃，湿度60%-70%的SPF环境下，自由饮水和采食。

1.3.2 实验细胞 冻存鼠内皮祖细胞购买于中国医学科学院。

1.3.3 实验试剂 胰蛋白酶(美国Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)；细胞培养箱(Heraeus Sepatech公司)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司)。

1.4 方法

1.4.1 鼠内皮祖细胞复苏与标记 将鼠内皮祖细胞冷冻管从液氮中取出，迅速投入37 ℃水浴融化。待到冻存的细胞悬液完全融化之后通过稀释、离心、弃上清、洗涤细胞等步骤，然后用完全培养液重悬细胞并将其浓度调整为1×10⁹ L^-1。在细胞培养箱中培养7 d后对其进行CM-Dil荧光标记：向细胞悬液中加入5 μL CM-Dil，在细胞培养箱中孵育25 min，重复此操作2次后显微镜下观察细胞形态和细胞标记情况。

1.4.2 TGF-β1-siRNA的转染 构建TGF-β1为靶向基因的mRNA和siRNA表达质粒pLenti X1 Puro-shTGF-β1-eGFP，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因。取培养第3代的5×10⁶个鼠内皮祖细胞接种于10 cm培养皿，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养12-16 h；转染24 h之前离心弃去旧的培养液，加入5 mL新鲜的完全培养液。将内皮祖细胞分为未经任何处理的空白组、转染对照慢病毒的对照组以及转染TGF-β1-siRNA慢病毒的TGF-β1基因沉默组。制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，将慢病毒和DNA-Lipofectamine 2000复合物分别滴加至对照组和TGF-β1基因沉默组细胞中，摇匀，培养48 h后收集并洗涤细胞继续培养备用。

1.4.3 Western blot检测内皮祖细胞中TGF-β1的表达 在病毒转染后的第3天和第28天，采用Western blot法检测内皮祖细胞中TGF-β1蛋白的表达水平。将细胞裂解并稀释至相同的蛋白浓度，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。每组取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h(或4 ℃过夜)；一抗(1∶500)室温孵育2 h(或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，PBS洗涤后用化学发光试剂显影，扫描图像并半定量分析，测定TGF-β1蛋白相对表达水平，以GAPDH为内参。

1.4.4 大鼠肺部纤维化模型建立及细胞移植 选取80只Wistar大鼠，随机分为正常对照组、肺纤维化模型组、内皮祖细胞组以及TGF-β1沉默内皮祖细胞组，每组20只。后3组大鼠气管内分别一次性注入0.3 mL博莱霉素溶液(5 mg/kg)以制备肺纤维化病理模型。造模后24 h，正常对照组和肺纤维化模型组大鼠尾静脉注射20 μL生理盐水，内皮祖细胞组和TGF-β1沉默内皮祖细胞组大鼠尾静脉注射20 μL细胞浓度为3×10⁶ L^-1的内皮祖细胞悬液或TGF-β1沉默内皮祖细胞悬液。

1.4.5 ELISA检测肺泡灌洗液中细胞因子水平 细胞移植4周后，每组选取4只大鼠左侧肺脏舌叶作为灌洗部位以获取支气管肺泡灌洗液，离心后采用酶联免疫法测定各组大鼠肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.6 荧光显微镜下观察内皮祖细胞的存活情况 细胞移植4周后，每组选取4只大鼠，取出肺部纤维化区域组织，制作冰冻切片并进行DAPI染色。显微镜下随机选取每张冰冻切片的3个视野进行拍照记录；假设每张照片的总亮度为1，每张照片选取一个光亮度点，利用ACDsee5.0软件确定其坐标值。在图像中随机选取8个视野，计数每个视野中CM-Dil标记的阳性细胞数。

1.4.7 苏木精-伊红染色观察肺部病理形态变化 细胞移植4周后，每组选取4只大鼠，取出肺部组织，用体积分数为10%的甲醛溶液固定，制备切片；分别进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋等步骤。用切片机切成5-8 μm厚薄片，放到加热的水中熨平，再贴到载玻片上，45 ℃恒温烘干，二甲苯脱蜡，进行苏木精-伊红染色。染色后的切片经纯乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封固。待树胶干燥后，荧光显微镜下观察各组大鼠肺组织病理形态变化。

1.4.8 RT-PCR检测肺组织中TGF-β1、Smad-2、Smad-7的基因表达水平 细胞移植4周后，每组选取4只大鼠，取各组大鼠同一部位的肺纤维化损伤组织，采用RT-PCR法检测肺组织中TGF-β1、Smad-2、Smad-7基因相对表达水平。每个检测重复3次。通过Oligo 7.36 Demo软件设计引物，TGF-β1上游引物：5'-GCT AAT GGT GGA CCG CAA C-3'，下游引物：5'-CAG TGA GCA CTG AAG CGA-3'，扩增片段212 bp；Smad-2上游引物：5'-TTT GCG GAA TAA TCG TGT-3'；下游引物：5'-AAG GTG CTT TAA TTG ATG AGA C-3'，扩增片段长度414 bp；Smad-7上游引物：5'-TTT TGA GGT GTG GTG GGT-3'；下游引物：5'-GAG GCA GTA AGA CAG GGA TGA-3'，扩增片段长度478 bp；内参GAPDH上游引物：5'-GTG CTG AGT ATG TCG TGG A-3'，下游引物：5'-CAC AGT CTT CTG AGT GGC A-3'，扩增片段121 bp。提取细胞RNA并反转录为cDNA，采用2^-ΔΔCt分析法，以GAPDH基因作为内参，测定TGF-β1、Smad-2、Smad-7的mRNA相对表达水平。

1.4.9 Western blot检测肺组织中TGF-β1、Smad-2、Smad-7的蛋白表达水平 细胞移植4周后，每组选取4只大鼠，取各组大鼠同一部位的肺纤维化损伤组织，采用Western blot法检测肺组织中TGF-β1、Smad-2、Smad-7蛋白相对表达水平。每个检测重复3次。将细胞裂解并稀释至相同的蛋白浓度，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。每组取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h (或4 ℃过夜)；一抗(1∶500)室温孵育2 h(或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，PBS洗涤后用化学发光试剂显影，扫描图像并半定量分析，测定各组肺纤维化损伤组织中TGF-β1、Smad-2、Smad-7蛋白质相对表达水平，以GAPDH作为内参。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α水平；②各组大鼠肺组织病理形态变化；③各组大鼠肺组织中转化生长因子β1、Smad-2、Smad-7的mRNA和蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-Q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肺纤维化常常被认为具有不可逆性，存活期较短。近年来就该病的研究多集中于炎症因子分泌的调控和纤维蛋白沉积的减少等方面，但是效果并不十分理想，而肺部血管病变可能是导致肺部纤维化进程加剧的一大关键因素。

内皮祖细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，其可与造血干细胞一样定居于骨髓中，在缺氧、缺血、炎症、外伤等因素的刺激下，脱离骨髓并向外周血中移行，定居于机体损伤组织，随后分化并辅助组织损伤的修复^[16-17]。大量研究已经表明内皮祖细胞在抵抗缺血性损伤、抑制肿瘤生长以及构建人工血管等医学和生物工程学方面均表现出了潜在应用价值^[18-20]。肺纤维化发生和发展过程中会产生多种免疫趋化因子，后者可以促使内皮祖细胞靶向性向损伤部位迁移趋化；随后内皮祖细胞可以在肺损伤部位分化为肺泡血管内皮细胞，另一方面可以抑制损伤过程中发生的炎症反应^[21-23]。TGF-β1是纤维化启动枢纽和关键因子。内皮祖细胞可以分泌较多的TGF-β1，可能会影响其移植治疗的效果，这可能是限制内皮祖细胞应用的一大因素。

该研究表明基因沉默28 d后，Western blot检测到TGF-β1低水平表达，由此可知TGF-β1基因沉默成功。通过气管内一次性注入0.3 mL博莱霉素建立大鼠肺纤维化模型，再将基因沉默的内皮祖细胞经尾静脉注射到模型大鼠体内，可见内皮祖细胞组和TGF-β1沉默内皮祖细胞组大鼠肺组织存在CM-Dil标记的阳性细胞，据此可知移植成功。移植后进行肺组织苏木精-伊红染色，与肺纤维化模型组相比，内皮祖细胞组大鼠肺组织病理变化明显减轻，肺泡间隔厚度显著降低；而TGF-β1沉默内皮祖细胞组病理变化减轻，肺泡间隔厚度进一步降低，该结果表明TGF-β1沉默的内皮祖细胞移植显著缓解了肺部纤维化损伤。肺部纤维化进程中，炎症反应是非常重要的一个环节，白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α水平是炎症反应的重要指标。ELISA检测表明，与肺纤维化模型组相比，内皮祖细胞组和TGF-β1沉默内皮祖细胞组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平显著降低。TGF-β1基因沉默内皮祖细胞组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平明显低于内皮祖细胞组，由此可知TGF-β1基因沉默有助于内皮祖细胞作用的发挥。

研究表明，与肺纤维化模型组相比，内皮祖细胞组和TGF-β1沉默内皮祖细胞组大鼠肺组织中TGF-β1和Smad-2的基因和蛋白表达水平明显较低，而Smad-7表达水平明显较高。TGF-β1沉默内皮祖细胞组的作用效果明显强于内皮祖细胞组。TGF-β1是肺部纤维化启动和进程的关键因子，因此通过基因沉默TGF-β1的表达可以显著缓解肺部纤维化的进程，Smad通路是TGF-β1信号转导中最重要的通路，TGF-β1首先与相应的TβR Ⅱ相结合，再连接TβRⅠ共同形成复合物，然后磷酸化激活受体激活型Smad某一成员，该成员再与Co-Smads结合形成复合物转入核内调节下游基因的转录^[24-25]，Smad-2是膜受体激活型的R-Smad，该蛋白的高表达显著提高了TGF-β1下游基因的表达水平，促进了肺部纤维化的进程^[26]。Smad-7是膜受体抑制型的Ⅰ-Smad，其可以竞争性地与Smad-2结合受体，从而阻断Smad信号转导通路中磷酸化进程，抑制下游基因的表达，缓解肺部纤维化^[27]，该研究TGF-β1沉默后直接通过Smad通路降低Smad-2表达以及增强Smad-7的表达从而发挥抑制肺纤维化的作用。

综上所述，TGF-β1基因沉默内皮祖细胞移植对博来霉素引起的大鼠肺纤维化具有明显的缓解和保护作用，减轻肺部炎症反应及组织病理学损伤，TGF-β1沉默后可能通过降低Smad-2表达以及增强Smad-7的表达从而发挥抑制肺纤维化的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程