胎盘间充质干细胞培养上清对CD4+T细胞和Treg细胞免疫功能的调节

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0696

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胎盘间充质干细胞：是多能干细胞的一种，具有多项分化能力，且参与多项免疫调节。实验所采用的胎盘间充质干细胞由作者所在实验室独立培养，收集第4代胎盘间充质干细胞培养上清液培养人外周血单核细胞，检测其对Treg细胞的调节能力。
Treg：是一群具有免疫调节功能的T细胞亚群，免疫表型为CD4⁺CD25⁺C127⁺或CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺，细胞核转录因子为Foxp3。该研究为探讨人胎盘间充质干细胞培养上清对CD4⁺T细胞和Treg细胞功能及免疫调节能力的影响，制备人胎盘间充质干细胞培养上清和外周血单个核细胞的共培养体系。实验证实人胎盘间充质干细胞培养上清抑制了Treg细胞的表达比例并降低其主要细胞因子转化生长因子β的表达含量。

摘要
背景：Treg细胞是一种抑制性CD4⁺T细胞，人胎盘间充质干细胞具有T细胞免疫调节功能。
目的：探讨人胎盘间充质干细胞上清液对CD4⁺T细胞和Treg细胞比例以及免疫调节功能的影响。
方法：分离培养人胎盘间充质干细胞，建立其稳定传代细胞系。收集第4代人胎盘间充质干细胞及细胞上清培养液，流式细胞术检测细胞表面标志物CD90、CD73、CD45、HLA-DR的表达。采用人胎盘间充质干细胞上清液与细胞因子刺激剂联合培养正常人外周血单个核细胞6 h，流式细胞术检测CD4⁺T细胞和Treg细胞比例；ELISA方法检测细胞培养上清中转化生长因子β水平。
结果与结论：①成功建立人胎盘间充质干细胞原代细胞系，且可稳定传代；②人胎盘间充质干细胞上清液能够显著降低CD4⁺T细胞表达比例(P < 0.05)，增强Treg细胞的表达比例(P < 0.05)，并上调其主要细胞因子转化生长因子β水平(P < 0.01)；③结果表明，人胎盘间充质干细胞上清液可以通过诱导CD4⁺T细胞向Treg细胞的转化而发挥免疫调节作用，有望成为一种免疫治疗的新选择。

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ORCID: 0000-0002-7254-1266(李伟伟)

关键词: 胎盘间充质干细胞, CD4⁺T细胞, Treg细胞, 转化生长因子β, 免疫调节, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Treg cells belong to inhibitory CD4⁺T cells. Human placenta mesenchymal stem cells (hPAMSCs) have T cell immunomodulatory function.
OBJECTIVE: To investigate the CD4⁺T and Treg cells immunomodulatory ability after culture with the supernatant of hPAMSCs.
METHODS: hPAMSCs were isolated and cultured, and the stable cell lines were then established. Passage 4 hPAMSCs and its supernatant were collected, and the expression of cell surface markers CD90, CD73, CD45 and HLA-DR were detected by flow cytometry. Cell activation cocktail stimulated peripheral blood mononuclear cells from healthy donor were co-cultured with hPAMSCs supernatant for 6 hours. The percentage of CD4⁺T cells and Treg cells was detected by flow cytometry. ELISA was used to test the level of transforming growth factor β in the cell supernatant.
RESULTS AND CONCLUSION: Successfully established primary hPAMSCs cell lines had stable passage. Supernatant of hPAMSCs significantly inhibited the percentage of CD4⁺T cells (P < 0.05), while significantly enhanced the percentage of Treg cells (P < 0.05). Meanwhile, the level of transforming growth factor β was significantly up-regulated (P < 0.01). In conclusion, the supernatant of hPAMSCs has the immunomodulatory function via inducing the conversion from CD4⁺T to Treg cells, which is expected to be a new therapeutic treatment for immune disorders.

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Key words: Placenta, Mesenchymal Stem Cells, CD4-Positive T-Lymphocytes, T-Lymphocytes, Regulatory, Transforming Growth Factor beta, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞水平体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1月至2018年3月在辽宁省血液中心细胞研究中心实验室完成。

1.3 材料 MSCBM基础培养基(北京达科为生物有限公司)；Helids添加物(美国Biolegend公司)；RPMI-1640、胎牛血清(美国GIBCO公司)；细胞培养刺激因子套装：cell activation cocktail(with brefeldin A)(美国Biolegend公司)；流式抗体：FITC-CD90、FITC-CD73、PE-CD45、FITC-HLA-DR、PE-CD3、FITC-CD4、APC-CD25、PE-CD127(美国Biolegend公司)；转化生长因子βELISA试剂盒(达科为生物治疗有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 hPAMSCs的分离培养和鉴定 无菌条件采集足月剖宫产新生儿胎盘组织10 cm³，将其剪成小于0.5 mm³小组织块放入无菌50 mL离心管中，加生理盐水至45 mL，配平离心1 500 r/min×10 min，弃上清，重复上述步骤2次；用2 mL细胞培养基重悬沉淀物，轻柔混匀加细胞培养基(MSCBM基础培养基+Helids添加物)至35 mL，转移至175 cm²大培养瓶中，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内培养，3 d更换1次培养液；14 d左右可明确观察到绝大多数胎盘组织块周围有成纤维样梭形细胞生长，待细胞密度达75%左右时，用0.25%的温浴胰蛋白酶消化贴壁细胞(尽量只收集细胞克隆，不收集贴壁牢固的组织块)；充分洗涤后传代培养，第3代细胞以后，细胞倍增传代时间稳定在四五天。收集第4代细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-1，采用流式细胞技术检测细胞表面标志物CD90、CD73、CD45、HLA-DR的表达。

1.4.2 hPAMSCs培养上清的收集与预处理 收集第4代hPAMSCs上清液放入50 mL离心管中，1 000 r/min×10 min去除死细胞及细胞碎片等，吸取上清放入新的无菌离心管中，分装后冻存，下游实验待用。

1.4.3 正常人外周血单个核细胞分离 取400 mL健康献血员外周血过白细胞滤盘，无菌接驳一袋1 000 mL生理盐水。采用白细胞滤盘反冲法收集外周血单个核细胞：将所有反冲液分装入50 mL离心管中，混匀；1 200 r/min×10 min，弃上清，混匀后，每管使用移液器定容至30 mL；取50 mL无菌离心管，每管分装15 mL Ficoll分离液；将30 mL细胞混悬液轻柔加至15 mL Ficoll分离液上层，1 900 r/min× 20 min；吸取灰白层细胞，生理盐水定容至45 mL，1 200 r/min×10 min，清洗外周血单个核细胞，弃上清，重复上述步骤2次；加入10 mL含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，计数后待用。

1.4.4 hPAMSCs上清液培养外周血单个核细胞 实验设立4组：①实验组：RPMI-1640基础培养基+体积分数为10%胎牛血清+hPAMSCs上清液+cell activation cocktail；②阴性对照组：RPMI-1640基础培养基+体积分数为10%胎牛血清+cell activation cocktail；③基础培养基对照组：RPMI-1640基础培养基；④hPAMSCs上清液对照组：RPMI-1640基础培养基+体积分数为10%胎牛血清+hPAMSCs上清液。将5×10⁶外周血单个核细胞种接种于6孔板，加入相对应的细胞培养基培养6 h，收集各组复孔细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD73、CD45、HLA-DR的表达；收集各组复孔细胞上清，1 000 r/min×

10 min去除死细胞及细胞碎片等，吸取上清放入新无菌离心管中，ELISA实验检测转化生长因子β水平。

1.4.5 流式细胞术检测各组外周血单个核细胞中CD4⁺/ Treg细胞比例 标记流式细胞管：分别为空白管、CD4⁺单标管、CD3⁺CD4⁺双标管、CD25⁺单标管、CD127⁺单标管、CD4⁺CD25⁺CD127⁺三标管。每管加入细胞100 μL(1×10⁶个)和1test相对应荧光标记流式抗体，室温孵育20 min，加入2 mL生理盐水，1 500 r/min×6 min，离心洗涤，弃上清，重复上述步骤2次；轻轻扣干细胞沉淀，加入500 μL生理盐水，吹打混匀；预设CD3⁺CD4⁺T细胞为待检CD4⁺T细胞，CD4⁺CD25⁺C127⁺细胞为待检Treg细胞。流式细胞仪上机检测各组外周血单个核细胞中CD4⁺T细胞和Treg细胞比例。

1.4.6 ELISA方法检测各组外周血单个核细胞培养上清中转化生长因子β水平 按转化生长因子βELISA检测试剂盒说明书进行操作，于450 nm处测各孔吸光度值；绘制标准曲线并计算回归方程，进行各样本浓度换算，检测细胞因子转化生长因子β水平。

1.5 主要观察指标 hPAMSCs对CD4⁺T细胞和Treg细胞体外增殖能力的影响。

1.6 统计学分析 使用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。实验数据描述为x(_)±s，两组样本均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

hPAMSCs属免疫抑制性细胞且不具有免疫原性，被认为是再生医学和肿瘤免疫治疗中的潜在治疗载体和工具^[15-17]。hPAMSCs具有免疫调节功能，通过归巢和旁分泌作用对多种经典免疫细胞^[18-19]，如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Th17、Treg细胞等具有免疫调节作用。hPAMSCs还具有良好的造血支持功能，将其作为饲养支持细胞与多种造血干细胞共培养，均可发现脐血造血干细胞、骨髓造血干细胞等种子细胞集落数量显著增殖，造血能力提升^[20-21]。hPAMSCs在多种心血管疾病^[22]，如心肌梗死、扩张性心脏病、病毒性心肌炎等中也有改善心肌功能、促进心肌供血、延缓心肌纤维化等保护作用。间充质干细胞可以产生大量功能性外泌体和多种细胞因子而作为细胞间重要信息传递物质，参与间充质干细胞介导的损伤修复及免疫调节。hPAMSCs培养上清液是上述物质的富集体，能否介导调节CD4⁺T细胞与Treg细胞之间的转化与平衡尚无深入研究。

Treg细胞是CD4⁺T细胞的重要抑制性功能亚群，是维持人体免疫耐受的最重要的抑制性免疫调节细胞，核转录因子为Foxp3。转化生长因子β是机体内重要的调节因子，激活的Smads可通过与转录因子结合，调节各种不同的生物学效应，导致细胞状态特异性转录调节^[23-26]，还可抑制淋巴细胞增殖，是诱导Foxp3表达的组成性与关键性调控因子^[27]。Foxp3的表达受到转化生长因子β的调控，其表达水平高低可调控Treg细胞的增殖，且Treg细胞分泌的转化生长因子β又可发挥正反馈作用而进一步促进Treg细胞的增殖^[28-30]。脐带间充质干细胞可通过自身分泌和上调转化生长因子β的分泌，调节Treg的增殖分化并同时降低CD4⁺T细胞的表达比例，促进CD4⁺T细胞向Treg细胞转化。hPAMSCs是否也具有同样的调节作用，该实验进行了初步的研究探讨^[31-33]。

综上，hPAMSCs上清液可以显著抑制正常人外周血CD4⁺T细胞的比例，Treg细胞增殖明显，且转化生长因子β的分泌量增加。hPAMSCs上清在活化因子的共同作用下可以促进CD4⁺T细胞向Treg细胞转化。实验初步证实hPAMSCs上清可以促进CD4⁺T细胞向Treg细胞转化，为进一步应用hPAMSCs及其相关产物治疗肿瘤、自身免疫性疾病、造血系统疾病等多种疾病积累了一定的实验基础，为相关疾病的有效防治提供了新的免疫治疗新靶点。

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