脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1520

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
富血小板纤维蛋白：是新一代血小板浓缩物，无需外源添加化学制剂，通过离心自体外周血即可获得含有大量血小板纤维蛋白和白细胞的生物材料，含有多种生长因子和基质蛋白。富血小板纤维蛋白主要是通过各种细胞因子发挥促进表皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞向创面聚集，加速细胞外基质的合成转移与塑形，刺激血管再生与细胞有丝分裂，调控内皮细胞的迁移、增殖与分化等作用，在组织工程研究中拥有巨大临床应用潜力，给亟待解决的皮肤等创面修复问题带来希望。
皮肤损伤的干细胞治疗：皮肤损伤愈合是一个复杂的程序化生理过程，需要多种类型细胞和内源性活性物质的参与。临床上用于大面积皮肤损伤修复的主要方法是自体皮瓣移植，常常由于局部缺血缺氧导致移植失败。干细胞移植逐渐成为治疗皮肤损伤的新途径，其不仅可以诱导分化为损伤修复的各类型细胞，还能通过自分泌和旁分泌作用于损伤原位细胞，促进伤口愈合。然而，干细胞的安全性和移植存活率尚需进一步评估，无细胞治疗成为新方向。

摘要
背景：富血小板纤维蛋白可促进软组织愈合，间充质干细胞分泌的可溶性因子具有促进皮肤再生的作用，两者联合应用促进皮肤损伤修复尚未见报道。
目的：探讨脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白对小鼠皮肤创伤愈合的影响。
方法：制作C57/BL6小鼠(西南医科大学实验动物中心提供)全层皮肤损伤模型，随机分为4组，每组10只。自造模后即开始治疗，各组分别涂抹脂肪间充质干细胞专用培养基、脂肪间充质干细胞条件培养液、富血小板纤维蛋白、脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白，3次/d，连续7 d。在治疗后的1，3，7，10 d测量创面大小并计算治疗后3，7 d的创面愈合率；治疗后第14天进行创面愈合的组织学分析。
结果与结论：①与脂肪间充质干细胞专用培养基组相比，其他3组创面愈合时间缩短；②治疗后3，7 d，脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于其他3组，脂肪间充质干细胞条件培养液组和富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于脂肪间充质干细胞专用培养基组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③组织学分析显示，脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组小鼠创面白细胞及成纤维细胞聚集、血管新生、肉芽组织重塑、上皮化均比其他3组明显，伤口愈合效果最好；④结果表明，脂肪间充质干细胞条件培养液与富血小板纤维蛋白联合应用能有效促进小鼠皮肤损伤的修复，效果优于单独应用脂肪间充质干细胞条件培养液或富血小板纤维蛋白。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5812-8507(黄敏)

关键词: 皮肤损伤, 脂肪间充质干细胞, 条件培养液, 富血小板纤维蛋白, 创面愈合, 小鼠, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich fibrin can promote soft tissue healing, and soluble factors secreted by mesenchymal stem cells can promote skin regeneration, but their combination effects on skin repair are little reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of conditioned medium of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells combined with platelet-rich fibrin on the healing of skin wound in mice.
METHODS: Full-thickness skin injury models were established in C57/BL6 mice and randomly divided into four groups, 10 mice in each group. After the modeling, each group was smeared with the specific medium of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, the conditioned medium of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, the platelet-rich fibrin, the conditioned medium of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells combined with platelet-rich fibrin, thrice daily for 7 consecutive days. The wound size was measured at 1, 3, 7 and 10 days after treatment and the wound healing rate was calculated at 3 and 7 days after treatment. Histological analysis of wound healing was performed at 14 days after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the specific culture medium of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, the wound healing time in the other three groups was shorter. The wound healing rate of adipose-derived mesenchymal stem cell conditioned medium combined with platelet-rich fibrin group was significantly higher than that in the other three groups at 3 and 7 days after treatment (P < 0.05). The adipose-derived mesenchymal stem cell conditioned medium group and platelet-rich fibrin group showed higher healing rate than the adipose-derived mesenchymal stem cell specific medium group (P < 0.05). Histological findings showed that the aggregation of white blood cells and fibroblasts, angiogenesis, granulation tissue remodeling and epithelization in the conditioned medium of adipose mesenchymal stem cells combined with the platelet-rich fibrin group were more obvious than those in the other three groups, in which the best wound healing effect was found. These results suggest that the combination of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell conditioned medium and platelet-rich fibrin can effectively promote the repair of skin injury in mice, and the effect is better than that of conditioned medium or platelet-rich fibrin alone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Skin, Wounds and Injuries, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Culture Media, Conditioned, Platelet-Rich Plasma, Tissue Engineering

中图分类号:

黄敏，颜洪. 脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 18-23.

Huang Min, Yan Hong. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell conditioned medium combined with platelet-rich fibrin repairs skin injury in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 18-23.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠ADSCs的原代培养及鉴定结果 将由小鼠脂肪组织分离获得的ADSCs接种到培养皿中4 h后，倒置相差显微镜下观察发现贴壁细胞呈梭形，培养5 d后呈漩涡状排列的细胞形成较大集落，铺满培养皿底90%，见图1A。约5 d传1代，取第3代ADSCs成脂诱导14 d，油红O染色显示细胞内布满染成红色的脂滴，大小不一，见图1B；成骨诱导21 d，茜素红染色显示深红色结节散在分布于细胞集落中，见图1C，提示分离培养的ADSCs具有多向分化能力。流式细胞术检测结果显示，分离培养的小鼠ADSCs表达CD90和CD44，不表达CD31和CD34，见图1D，提示分离培养的细胞具有间充质干细胞的特性。

2.2 实验小鼠数量分析 40只小鼠在造模和治疗过程中均无死亡等异常发生，所有实验数据均计入结果分析。

2.3 创面愈合过程中的组织学分析 ADSCs条件培养液+ PRF组小鼠创面的愈合效果优于其他3组，治疗14 d后，肉芽组织表面的上皮增厚并分层，结构与周围正常皮肤相似，真皮层细胞聚集明显，血管增多，说明创面发生肉芽组织重塑和上皮化；ADSCs专用培养基组只有成纤维细胞和胶原纤维组成的细密结缔组织，表层上皮未明显分层；ADSCs条件培养液组和PRF组局部增厚，肉芽组织较少，见图2。

2.4 小鼠创面愈合情况及创面愈合率 各组小鼠的创面在7 d内形成痂皮，14 d内创面均愈合，在治疗过程中均未发生感染，ADSCs条件培养液+PRF组在治疗后10 d可见完整的组织修复，而ADSCs专用培养基组约在治疗后14 d完成修复，ADSCs条件培养液组与PRF组均在治疗后12 d左右完成修复；治疗7 d后，与ADSCs专用培养基组相比，其他3组小鼠创面面积均有缩小，ADSCs条件培养液+PRF组创面面积缩小最明显，见图3A；为了进一步比较对创面愈合的影响，计算各组治疗3 d和7 d的创面愈合率，ADSCs条件培养液+PRF组创面愈合率高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3B。

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引言

皮肤不仅是人体最大的器官，也是机体与外界环境之间的屏障，主要由表皮和真皮两部分组成，既有角化的复层扁平上皮也有结缔组织^[1]。各种原因导致的皮肤损伤都会破环屏障的完整性，降低其防御能力，失血和感染启动的自我修复过程缓慢，特别是较大损伤很难恢复伤口部位皮肤的初始生物学特性^[2]。皮肤损伤愈合是一个复杂的程序化生理过程，需要多种类型细胞和内源性活性物质的参与，涉及角质形成细胞在创面边缘的募集和增殖以及肉芽组织的形成^[3]。已有研究证实外源添加细胞因子和生长因子能促进皮肤伤口愈合^[4]。

富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是含有大量血小板纤维蛋白和白细胞的新一代血小板浓缩物，制备简便，在不添加化学制剂的前提下通过离心自体外周血即可获得^[5]。研究发现，PRF中含有表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子、纤维连接蛋白及血小板反应蛋白等，其结构与人真皮及皮下结缔组织中的纤维蛋白立体网状结构相似，结构疏松及孔隙大有利于细胞迁移与增殖^[6-8]。PRF不仅能促进结缔组织中间充质干细胞的分化，还能促进免疫细胞的募集与免疫调节因子的释放^[9]。PRF主要通过各种因子发挥促进表皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞向创面聚集，加速细胞外基质的合成转移与塑形，刺激血管再生与细胞有丝分裂，调控内皮细胞的迁移、增殖与分化等作用，其参与软组织损伤的修复，在组织工程研究中拥有巨大临床应用潜力，给亟待解决的皮肤等创面修复问题带来希望^[10-12]。然而，基础组织形态学研究发现，PRF主要通过促进血管内皮细胞再生和加快瘢痕组织形成来缩短创面愈合时间，但对创面上皮修复的促进作用不理想^[13]。

研究证实，间充质干细胞不仅可通过重建表皮细胞及皮肤附属器来促进皮肤伤口愈合，还能通过血管重建促进难愈性创面的愈合，且不形成明显的瘢痕，其主要作用机制包括分化形成创伤修复所需的各种细胞、旁分泌生物活性物质促进再上皮化和肉芽组织形成^[14-17]，但间充质干细胞的安全性受到质疑，其旁分泌及免疫调节作用可能为肿瘤的形成提供条件^[18]。间充质干细胞条件培养液逐渐引起研究者的重视^[19]，其不含有间充质干细胞但能获得间充质干细胞旁分泌的生物活性物质。作者设想，将间充质干细胞条件培养液与PRF联合应用在促进创面修复过程中既能缩短愈合时间又能减小瘢痕形成。因此，该研究应用全层皮肤缺损小鼠模型从损伤修复机制方面探讨脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)条件培养液与PRF在皮肤损伤愈合过程中的作用，以期为组织损伤再生修复的临床治疗提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年1至12月在西南医科大学附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级6-8周龄C57BL/6小鼠55只，体质量18-22 g，由西南医科大学实验动物中心提供。

1.3.2 实验试剂和仪器 ADSCs专用培养基(广州赛业公司)；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、油红O、茜素红S(美国Sigma公司)；成脂诱导培养基、成骨诱导培养基(广州赛业公司)；兔抗小鼠CD31、CD44、CD34、CD90单克隆抗体(美国Abcam公司)；山羊抗兔IgG-FITC、IgG-PE抗体(美国Santa Cruz公司)；二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司)；光学显微镜(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠ADSCs分离、培养与鉴定

小鼠ADSCs分离培养：根据文献[20-21]报道方法进行改良，10%水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠15只，无菌条件下取小鼠腹股沟部位皮下脂肪组织，PBS冲洗3次后剪碎，用0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃震荡30 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目筛网过滤，收集滤液，1 500 r/min离心10 min，将细胞团用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基制成细胞悬液，使用无血清的ADSCs专用培养液于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养，24 h后全量换液，当细胞融合达90%后进行传代。

流式细胞术检测小鼠ADSCs表面标记物：根据文献[22]报道方法，取第3代ADSCs，经过0.25%胰蛋白酶消化、完全培养基终止消化、PBS洗涤、用PBS制成细胞悬液等步骤，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，向含细胞悬液的各离心管中加入抗小鼠CD31-FITC、CD44-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC单克隆抗体和同型对照IgG抗体，4 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤，上流式细胞仪检测。

小鼠ADSCs成脂肪和成骨分化鉴定：根据文献[21-22]方法，取第3代ADSCs，经过0.25%胰蛋白酶消化、完全培养基终止消化、PBS洗涤等步骤，以1×10⁶ L^-1细胞浓度将细胞接种于培养皿中，分别用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养，培养第14天和第21天收集细胞，用预冷40 g/L多聚甲醛固定15 min，70%异丙醇洗涤，油红O染液染色15 min或茜素红S染液染色30 min，70%异丙醇洗涤，PBS洗涤，晾干，显微镜下观察并摄片。

1.4.2 ADSCs条件培养液制备 根据文献[23-24]方法，将生长状态良好的第3代ADSCs以1×10⁶ L^-1细胞浓度接种于培养瓶中，待细胞铺满瓶底80%后，PBS洗涤3次，使用无血清ADSCs专用培养液继续培养48 h，收集培养瓶中上清液，2 000 r/min离心5 min，0.22 µm滤膜过滤分装，-70 ℃保存备用。

1.4.3 PRF制备 根据文献[25]方法，上述取脂肪组织的15只小鼠进行颈动脉取血约10 mL，3 000 r/min离心5 min，离心管内血液分3层，中间层呈淡黄色凝胶为PRF，小心吸出分装，-70 ℃保存备用。

1.4.4 小鼠皮肤全层损伤模型的建立 取40只C57BL/6小鼠建立皮肤全层损伤模型，根据文献[23-24]方法，用10%水合氯醛以3 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉，脱去小鼠背部毛，用1 cm的打孔活检工具制作一个圆形全层皮肤机械损伤创面，模型建立当天定为实验记录第0天。

1.4.5 小鼠分组与治疗 40只模型小鼠随机分为4组，每组10只。造模当日即开始治疗，分别吸取ADSCs专用培养基500 μL、ADSCs条件培养液500 μL、PRF 500 μL以及ADSCs条件培养液+PRF各250 μL混匀，均匀滴于创面上，待完全吸收后再将小鼠放回饲养笼，每日治疗3次，连续治疗7 d。

1.4.6 游标卡尺测量创面面积 分别于治疗后第1，3，7，10天用游标卡尺测量创面，根据公式计算创面愈合率。创面愈合率=(治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小×100%^[26]。

1.4.7 创面组织苏木精-伊红染色 分别于治疗后第14天每组取6只小鼠处死，切取创面组织，100 g/L多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续4.0-5.0 μm切片、37 ℃烤片60 min、脱蜡、透明、蒸馏水冲洗、苏木精染色10 min、蒸馏水冲洗、伊红染色3 min、盐酸乙醇分化、梯度乙醇脱水、透明、封固、显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①创面面积；②创面愈合率；③创面组织学形态。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量数据采用x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

皮肤损伤修复是一个多因素共同参与的生理过程，肉芽组织的重塑和上皮化是其主要环节，主要包括炎性渗出与白细胞聚集、成纤维细胞与毛细血管内皮细胞增殖、肉芽组织重塑与上皮新生3个阶段，其中肉芽组织重塑对皮肤再生过程中组织稳定性的维持、缩小创面面积、减少瘢痕产生起重要作用^[26-29]。尽管伤口愈合情况在某种程度上受损伤的大小和严重程度影响，只要具有促进肉芽组织重塑和上皮化作用的新药物或方法都能加速创面高质量愈合并降低瘢痕发生率^[30]。研究发现，在皮肤伤口愈合过程中细胞的增殖、迁移与凋亡、新生血管的形成以及细胞间的相互作用主要由局部微环境中细胞因子与生长因子的共同作用。作者设想将尽可能多的与皮肤再生密切相关的生长因子与细胞因子外涂给药，模拟皮肤组织内环境，有可能有效促进损伤修复^[31]。该研究结果表明ADSCs条件培养液与PRF联合应用确实对小鼠皮肤伤口的愈合有积极作用。

近年来，研究者在干细胞移植医学领域找到了治疗多种疾病的方法^[32]。最初认为，这些干细胞归巢并在损伤的组织内分化成特定的细胞。而现在看来，只有一小部分移植细胞在宿主组织中整合并存活^[33]。因此，干细胞参与组织修复的最重要机制似乎与它们的营养因子有关。实际上，干细胞为微环境提供了广泛的生长因子、细胞因子和趋化因子，这些因子可以广义地定义为干细胞分泌体。在体外条件下，这些因子可以从培养细胞收获的废弃培养基中获得^[34]。因此，条件培养液在再生医学中成为一种新的治疗模式，在一些疾病中显示出有效的治疗结果。大量的临床前数据显示干细胞条件培养液治疗皮肤创伤具有可能性和有效性^[35]。

近年来，随着ADSCs促进皮肤创伤修复研究的深入，基础研究证实ADSCs除了能在体外特定条件下分化为成纤维细胞系、表皮细胞系及内皮细胞系，为损伤修复提供广泛充足的细胞来源外，还能通过自分泌与旁分泌产生血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子β等促进成纤维细胞的增殖与迁移、血管新生及上皮爬行等，白细胞介素、肿瘤坏死因子等炎症因子通过调节白细胞的活化与浸润程度控制修复组织炎性反应的范围，并且促进血管内皮细胞的增殖与迁移，进而促进皮肤的再上皮化^[36]。动物体内实验也证实，移植到皮肤创面的ADSCs存活很少，创面修复的主要机制是通过旁分泌方式特异性作用于损伤部位原有各种细胞^[36-37]。还有研究发现，ADSCs培养上清液中也存在上述各种生长因子并能发挥有效作用^[38]。如前所述，PRF中也含有多种与组织修复相关的生长因子，在外科手术中，一直被作为组织再生及创面愈合的首选辅助材料，故该研究从损伤修复的组织学特征方面探讨ADSCs条件培养液与PRF联合应用对伤口愈合的促进作用，结果显示，联合治疗组小鼠伤口的愈合速度明显提高，在治疗后10 d可见完整的组织修复，而ADSCs专用培养基组愈合最慢，约在治疗后14 d完成，ADSCs条件培养液组与PRF组均在治疗后12 d左右完成修复；ADSCs条件培养液与PRF组小鼠创面新生血管也较其他3组增多，说明ADSCs条件培养液与PRF联合应用不仅加速了伤口愈合，还提高了修复效果。创面愈合情况及创面愈合率也与上述结果一致，ADSCs条件培养液+PRF组在治疗3，7 d的创面愈合率均明显高于其他3组，进一步提示ADSCs条件培养液可能通过分泌各种生长因子和PRF共同作用于损伤修复部位的成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、中性粒细胞及角质形成细胞，促进细胞的增殖和肉芽组织的塑形与上皮化，其具体机制有待于应用特殊染色等组织学分子生物学技术深入进行。

上述研究结果说明，ADSCs条件培养液与PRF参与皮肤损伤再生过程的各个环节，加速创面愈合并减小瘢痕形成，为无细胞治疗创伤性损伤、手术后创面提供了新的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程