真空冷冻干燥法制备聚乳酸/生物玻璃支架及性能研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1435

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (30): 4793-4798.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1435

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真空冷冻干燥法制备聚乳酸/生物玻璃支架及性能研究

马丽娟，邓久鹏，尹浩月，田宜文

华北理工大学口腔学院，河北省唐山市 063000

收稿日期:2019-03-22 出版日期:2019-10-28 发布日期:2019-10-28
通讯作者: 邓久鹏，副教授，华北理工大学口腔学院，河北省唐山市 063000
作者简介:马丽娟，女，1992年生，河北省唐山市人，汉族，硕士，主要从事口腔修复学研究。
基金资助:
河北省教育厅重点项目(ZD2015016)，项目名称：掺锶透钙磷石涂层对骨质疏松种植体骨结合的作用及机制研究，项目参与者：邓久鹏

Preparation of polylactic acid/bioactive glass composite material by vacuum freeze-drying technique and study on its performance

Ma Lijuan, Deng Jiupeng, Yin Haoyue, Tian Yiwen

School of Stomatology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2019-03-22 Online:2019-10-28 Published:2019-10-28
Contact: Deng Jiupeng, Associate professor, School of Stomatology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Ma Lijuan, Master, School of Stomatology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
the Major Project of Education Department of Hebei Province, No. ZD2015016 (to DJP)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

真空冷冻干燥技术：是将湿物料或溶液在较低的温度(-10-50 ℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3-13 Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。

聚乳酸/生物玻璃支架：实验中应用的二氯甲烷和1，4-二氧六环，利用二者与聚合物之间的化学反应及有机溶剂的易挥发性，在真空冷冻干燥机的使用下，保持了生物活性玻璃和聚乳酸物理化学性质不受改变的条件下，制备的支架结构避免了NaCl、NaHCO₃及其混合物等致孔剂残留的问题。

背景：有文献指出，向聚乳酸中加入生物活性玻璃颗粒可提高材料的力学性能。

目的：采用真空冷冻干燥法制备聚乳酸/生物活性玻璃骨组织工程支架材料，并分析其性能。

方法：以1，4-二氧六环与二氯甲烷为致孔剂，采用真空冷冻干燥技术制备含生物活性玻璃质量分数分别为10%，20%，30%的聚乳酸/生物活性玻璃复合材料，检测复合材料的孔隙率、抗压强度。将含10%，20%，30%生物活性玻璃复合材料浸泡于模拟体液中2周，观察支架浸泡前后的微观结构与元素变化。分别以聚乳酸浸提液、含10%，20%，30%生物活性玻璃复合材料浸提液与苯酚溶液(阳性对照)培养L929成纤维细胞，以常规培养的细胞为对阴性对照，培养1，3，5 d，采用MTT法检测细胞增殖。

结果与结论：①含10%，20%生物活性玻璃复合材料的孔隙率高于聚乳酸材料(P < 0.05)；②各聚乳酸/生物活性玻璃复合材料的抗压强度均高于聚乳酸材料(P < 0.05)，并且含20%生物活性玻璃复合支架组的抗压强度高于含10%，30%生物活性玻璃复合支架组(P < 0.05)；③扫描电镜显示，复合材料孔隙内壁上均有大量微孔结构，生物活性玻璃分散在材料中，孔隙大小不均，孔隙之间相互沟通，随着生物活性玻璃含量的增加，孔隙有堵塞现象；在模拟体液中浸泡2周后，复合材料有明显的羟基磷灰石生成，并且钙、磷、硅元素比例升高；④培养1，3，5 d，含10%，20%，30%生物活性玻璃复合支架组表面的细胞增殖快于阳性对照组 (P < 0.05)，与阴性对照组、聚乳酸组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，采用真空冷冻干燥法制备可制备具有良好孔隙率、抗压强度与细胞相容性的聚乳酸/生物活性玻璃复合支架。

ORCID: 0000-0002-8744-0003(马丽娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 聚乳酸/生物活性玻璃复合材料, 生物玻璃, 聚乳酸, 冷冻干燥法, 骨组织工程支架材料, 孔隙率, 抗压强度, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Bioactive glass added into polylactic acid can improve the mechanical property of the material.

OBJECTIVE: To prepare the tissue-engineered scaffold of polylactic acid/bioactive glass composites by vacuum freeze-drying technique and study its performance.

METHODS: For 1,4-dioxane and dichloromethane as pore-forming agents, polylactic acid containing 10%, 20% and 30% bioactive glass were prepared by vacuum freeze-drying technique. The porosity and compressive strength were detected. In order to observe the microstructure and element changes of composites before and after soaked into the simulated body fluid for 2 weeks. L929 fibroblasts were cultured with polylactic acid leach liquor, polylactic acid/bioactive glass composites leaching liquor and phenol solution, and the cells of being cultured in routine culture were used as control, respectively. After culture for 1, 3 and 5 days, MTT was used to detect cell proliferation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity of polylactic acid containing 10% and 20% bioactive glass was higher than that of polylactic acid (P < 0.05). (2) The compressive strength of polylactic acid/bioactive glass composite was higher than that of polylactic acid (P < 0.05), and the compressive strength of 20% bioactive glass composite was higher than that of 10% and 30% bioactive glass composites (P < 0.05). (3) Scanning electron microscopy showed that the inner pore wall of polylactic acid materials has a large amount of micropore structures, bioactive glass distributed in the composite, the pore size was uneven and the pores communicated with each other. As the increasing of bioactive glass contents, there were lots of blocked pores. After immersion in simulated body fluid for 2 weeks, polylactic acid/bioactive glass containing composites showed obvious hydroxyapatite formation, but there was no hydroxyapatite formation in polylactic acid. The immersion of polylactic acid was only the change of PH value, but the ratio of calcium and phosphorus was higher than that before soaking in composite materials. After soaking, there was a large amount of hydroxyapatite formation, and the proportion of calcium and phosphorus was reduced accordingly. At the same time, the Si in bioactive glass was released. (4) The cell proliferation in the polylactic acid/bioactive glass composite containing 10% and 20% bioactive glass was significantly faster than that of positive control group after 1, 3 and 5 days of culture (P < 0.05), which showed no significant difference compared with the negative control and polylactic acid groups (P > 0.05) (5) These results suggest that polylactic acid/bioactive glass containing composite scaffolds with good porosity, compressive strength and cellular compatibility can be prepared by vacuum freeze-drying technique.

Key words: polylactic acid/bioactive glass containing composite material, bioactive glass, polylactic acid, vacuum freeze-drying technique, bone tissue-engineered scaffold material, porosity, compressive strength, cell proliferation

中图分类号:

马丽娟，邓久鹏，尹浩月，田宜文. 真空冷冻干燥法制备聚乳酸/生物玻璃支架及性能研究[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(30): 4793-4798.

Ma Lijuan, Deng Jiupeng, Yin Haoyue, Tian Yiwen. Preparation of polylactic acid/bioactive glass composite material by vacuum freeze-drying technique and study on its performance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(30): 4793-4798.

图/表（结果） 5

2.1 生物活性玻璃含量对复合支架材料表面形貌的影响图1是聚乳酸支架的表面形貌，可看到孔隙内壁上均出现大量微孔结构。图2为聚乳酸/生物活性玻璃复合支架的扫描电镜图，随着生物活性玻璃含量的增加，复合支架的孔隙有堵塞现象。在模拟体液中浸泡2周后，复合材料表面均有类骨羟基磷灰石形成，图3为模拟体液中浸泡2周后，含20%生物活性玻璃复合支架浸泡后的扫描电镜图，可见大量类骨羟基磷灰石形成。

浸泡前，复合支架材料中钙、磷比例较高；浸泡后，

复合支架表面形成大量的羟基磷灰石，钙、磷比例升高，同时生物活性玻璃中的硅会释放出来，其比例有所增加，图4为含20%生物活性玻璃复合支架浸泡前后的能谱分析图。

2.2 生物活性玻璃含量对复合支架材料孔隙率的影响含10%，20%生物活性玻璃复合材料的孔隙率高于聚乳酸、含30%生物活性玻璃复合材料(P < 0.05)，聚乳酸与含30%生物活性玻璃复合材料的孔隙率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.3 生物活性玻璃含量对复合支架材料抗压强度的影响复合支架材料的抗压强度均高于聚乳酸(P < 0.05)，含20%生物活性玻璃复合材料的抗压强度高于含10%，30%生物活性玻璃复合材料(P < 0.05)，含10%，30%生物活性玻璃复合材料的抗压强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 X射线衍射分析结果图5a为各组材料的X射线衍射图谱，可看到聚乳酸材料峰值较宽，并且有少量弱结晶峰存在；复合材料峰值较聚乳酸发现了明显改变，宽度明显缩小，变得更加尖锐，说明支架结晶度很好，但随着生物活性玻璃含量的增加并没有出现明显峰值波动。从图5b中可看出，聚乳酸材料在20.713°、21.763°位置附近表现出典型的非晶态弥散峰，复合支架材料在(220)(004) (222)(420)(040)(240)晶面出现较强的衍射峰，通过比对标准卡片JCPDS发现这些衍射峰对应的是晶体(卡片号PDF42.1401)SiO₂，由此就可说明生物活性玻璃已成功加入到了聚乳酸中。

2.5 细胞相容性实验结果各组细胞增殖，见图6：培养1，3，5 d，含10%，20%，30%生物活性玻璃复合材料组表面的细胞增殖快于阳性对照组(P < 0.05)，与阴性对照组、聚乳酸组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；阴性对照组、聚乳酸组细胞增殖快于阳性对照组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验

1.2 时间及地点实验于2017年11月至2018年7月在华北理工大学完成。

1.3 材料鼠成纤维细胞L929(华北理工大学实验室提供)；胎牛血清(PAN，法国)；RPMI1640培养基(BI，以色列)；1，4-二氧六环(分析纯，天津光复)；二氯甲烷(分析纯，天津永大)；二甲基亚砜(DMSO, 西格马奥德里奇)；MTT (日本TCI)；X射线能谱仪(APD 2000，意大利)；真空冷冻干燥机(上海比朗)；万能电子试验机(AGS-X Unit型，日本SHIMDZU)；冷场发射扫描电子显微镜(S-4800型，日本日立)；酶标仪(上海永创)。生物活性玻璃、聚乳酸材料，见表1。

1.4 实验方法

1.4.1 复合材料的制备前期实验显示，当二氯甲烷/1，4-二氧六环质量比为15/85时，所得支架孔隙率最高。取烧杯4个，分别加入不同质量比的聚乳酸与生物活性玻璃，两者总质量为1 g：聚乳酸1 g、生物活性玻璃0 g(第1个烧杯)，聚乳酸0.9 g、生物活性玻璃0.1 g(第2个烧杯)，聚乳酸 0.8 g、生物活性玻璃0.2 g(第3个烧杯)，聚乳酸0.7 g、生物活性玻璃0.3 g(第4个烧杯)，分别制备聚乳酸支架、含10%，20%，30%生物活性玻璃的复合支架。向烧杯中滴加1，4-二氧六环3.4 mL与二氯甲烷0.6 mL，滴加溶剂后，恒温搅拌至透明溶液，烧杯口密封静置1 h，而后再超声荡洗5 min；待其到达室温后，放入-20 ℃的冰箱下1 h；之后放入真空冷冻干燥机中-45 ℃冷冻24 h。取出支架后加入无水乙醇，以去除残余二氯甲烷，每8 h更换一次无水乙醇，更换3次，在去离子水中浸泡2 d，再放入电热鼓风干燥箱中放置1 d，即可得到聚乳酸/生物活性玻璃骨组织工程支架。

1.4.2 孔隙率检测从每组材料各随机抽取5个，按照阿基米德原理检测孔隙率。

1.4.3 抗压强度检测从4组支架中各随机抽取5个样品，切割成5 mm×5 mm×3 mm长方体，各组分别然后用万能试验机以0.5 mm/min的加载速度进行抗压强度实验。

1.4.4 扫描电镜和X射线衍射分析从4组支架中各随机抽取2个样品，切割成10 mm×10 mm×1 mm的试件，其中1个用于扫描电镜观察及能谱分析；另一个用于X射线衍射观察分析晶相结构；之后再将支架浸泡在模拟体液2周，再次进行电镜和能谱分析。

1.4.5 细胞相容性实验

浸提液的制备：称取4组试件各0.1 g，以含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养基为浸提介质，参照《GB/T16886.12-2005/ISO10993-12：2002医疗器械生物学评价》第12部分：样品制备与参照样品，常温下按照 1∶100的比例浸提12 h，经0.22 μm过滤器除菌备用。

细胞相容性测试：取对数生长期的鼠成纤维细胞L929，放入96孔板培养，每孔100 µL，每孔计数细胞等级达到105，分6组培养，分别加入4组材料浸提液、苯酚溶液(阳性对照组)、含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养基(阴性对照组)各100 µL。培养1，3，5 d，各取出1块培养板，用移液枪吸出各个孔中的浸提液，避光下每孔加入20 µL MTT，在细胞培养箱中培养4 h；再次用移液枪吸出孔板中的液体，各孔中加入150 µL二甲基亚砜，于室温下小平板震荡器震动30 min，酶标仪测定溶液在492 nm波长位置的吸光度值。

1.5 主要观察指标聚乳酸/生物活性玻璃骨组织工程支架材料的孔隙率、抗压强度与细胞相容性。

1.6 统计学分析实验数据满足正态性计量资料以x(_)±s示，多组间的比较采用方差分析并进行两两比较，方差齐用LSD检验，方差不齐则Dunnett’s T3检验。P < 0.05(双侧检验)为差异有显著性义。统计分析用SPSS 20.0软件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在过去几年中，支架材料因含有生物降解聚合物和生物活性物质如羟基磷灰石、磷酸三钙、硅酸钙和生物玻璃等，越来越受到人们的关注^[15-16]。此次实验将45S生物活性玻璃与聚乳酸充分混合后加入二氯甲烷和1，4-二氧六环，通过真空冷冻干燥技术制备出高孔隙率、机械性能优良的聚乳酸/生物活性玻璃骨组织工程支架材料，扫描电镜下可见45S生物活性玻璃分散在复合支架材料中，孔隙大小不均，大孔中布满小孔且孔隙之间相互连通，这种结构有利于细胞和生长因子的培养及作为营养物质、新陈代谢的通道。当加入生物活性玻璃的质量分数为10%，20%时，二者孔隙率比较差异无显著性意义，也就是说多加入了10%的生物活性玻璃对支架孔隙率没有影响；当加入的质量分数达到30%后，支架的孔隙率下降。生物活性玻璃粉体之间会出现团聚，导致了部分孔隙的封闭，因而就部分解释了孔隙率随生物活性玻璃含量增加而下降的现象。

纯聚乳酸具有良好的热稳定性，在170-230 ℃就可通过多种方式对其加工，它的抗压强度仅在(5.87± 0.07) MPa之间。当生物活性玻璃的质量分数为10%时，复合材料的抗压强度为(29.84±0.39) MPa，当生物活性玻璃的质量分数为30%时，复合支架的抗压强度为(29.91± 0.59) MPa，两组间比较差异无显著性意义，说明加入10%，30%的生物活性玻璃对支架强度几乎没有影响。但加入了质量分数20%生物活性玻璃的支架强度则达到了(33.98±0.95) MPa，高于其他3组，由此可见，加入质量分数为20%生物活性玻璃放入复合支架具有较大的抗压强度。

骨组织工程支架材料可通过体内表面形成的磷灰石层生物化学结合到骨组织上，其中植入物表面上的磷灰石层在骨组织-材料界面形成中起着关键作用^[17-19]。聚乳酸/生物活性玻璃支架在模拟体液浸泡过后，扫描电镜和能谱分析显示，钙、磷、硅元素含量较未浸泡前明显增多^[20-22]，说明羟基磷灰石在骨组织工程支架的表面大量生成，由此验证了聚乳酸/生物活性玻璃组织工程支架具有生物活性。成纤维细胞中的琥珀酸脱氢酶可将MTT还原成蓝紫色甲臜结晶，DMSO溶解此结晶后用酶标仪可测定出吸光度值，而活细胞数目与吸光度值大小呈正比关系。此次实验中，成纤维细胞可在聚乳酸/生物活性玻璃支架表面增殖和生长^[23-25]，呈线性关系，说明实验制备的支架不存在细胞毒性；而苯酚作为阳性对照，细胞增殖基本无变化。

冷冻干燥技术在低温状态下能保持材料的理化性质和生物特性不受改变，而又无污染，操作简便^[26-29]，因此实验采用真空冷冻干燥法制备了高孔隙高强度的聚乳酸/生物活性玻璃骨组织工程支架。实验的不足之处在于未对成骨细胞和破骨细胞进行支架培养。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

真空冷冻干燥法制备聚乳酸/生物玻璃支架及性能研究

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