虎潜丸诱导肩袖撕裂损伤模型大鼠血清外泌体中白细胞介素1受体拮抗剂释放促进肩袖腱骨愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1247

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
白细胞介素1受体拮抗剂：能够竞争性结合白细胞介素1受体，导致白细胞介素1受体失活，抑制白细胞介素1的作用。研究显示白细胞介素1受体拮抗剂抑制基质金属蛋白酶释放，减少蛋白聚糖的降解，从而延缓骨和软骨的破坏。
腱骨愈合：肌腱与骨骼连接部损伤后的愈合，腱骨连接部是各类腱病好发部位。

摘要
背景：腱骨愈合不良是导致肩袖修补术后再撕裂的最主要原因。
目的：研究虎潜丸促进肩袖腱骨愈合的机制。
方法：SPF级雄性SD大鼠50只，购自北京维通利华动物技术有限公司。对SD大鼠行单侧肩关节肩袖撕裂造模，造模后1个月重建肩袖，重建后分为2组：对照组和虎潜丸组(灌胃虎潜丸水煎液)。重建4周取肩关节行冈上肌破坏拉力载荷测试；重建 4周后取肩关节石蜡切片，行番红固绿染色观察蛋白聚糖表达和Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学染色观察；取重建后虎潜丸灌胃48 h大鼠血清提取外泌体，Western blotting检测外泌体水平及白细胞介素1受体拮抗剂蛋白表达。
结果与结论：①虎潜丸组冈上肌拉力破坏载荷明显高于对照组；②番红固绿染色发现虎潜丸组大鼠腱骨移行区面积和蛋白聚糖沉积增加；③免疫组织化学发现虎潜丸组Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达明显增加；④虎潜丸组大鼠血清外泌体水平明显增加，白细胞介素1受体拮抗剂蛋白表达增加；⑤结果说明：虎潜丸通过诱导大鼠体内外泌体和白细胞介素1受体拮抗剂的分泌促进冈上肌止点部腱骨愈合，促进了肩袖撕裂的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0578-1024(黄瑶)

关键词: 虎潜丸, 肩袖撕裂, 外泌体, 白细胞介素1受体拮抗剂, 腱骨愈合

Abstract:

BACKGROUND: Nonunion of tendon-bone healing is the main reason of rotator cuff re-tear after reconstruction.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of rotator cuff tendon-bone healing induced by Huqian Pill.
METHODS: Fifty male Sprague-Dawley rats, SPF grade (provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) were used to construct unilateral rotator cuff tear model, and were reconstructed the rotator cuff after 1 month. Then the rats were randomly divided to control and Huqian Pill (water decoction via gavage) groups. At 4 weeks, the shoulder joint was removed for supraspinatus failure load test. The paraffin sections of shoulder joints were taken for Safranin O-fast green staining to detect the expression of proteoglycan and for immunohistochemical staining to detect the expression of collagen types I and III. Exosomes were extracted from the serum of the rats at 48 hours after Huqian Pill treatment, and the quantity of exosomes and protein expression of interleukin-1 receptor antagonist were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The supraspinatus failure load in the Huqian Pill group was higher than that in the control group. (2) The transitional area and proteoglycan deposition appeared larger in the Huqian Pill group compared with the control group. (3) Immunohistochemical staining revealed significantly high expression of collagen types I and III in the Huqian Pill group. (4) The serum exosomes content and expression level of interleukin-1 receptor antagonist in the Huqian Pill group were significantly increased. (5) So, Huqian Pill promotes tendon-bone healing of supraspinatus end point through inducing the secretion of exosomes and interleukin-1 receptor antagonist in rats, contributing to the repair of rotator cuff tears.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Huqian pill, rotator cuff tear, exosomes, interleukin-1 receptor antagomist, tendon healing

中图分类号:

R496
R318

黄瑶，何兵，束昊，章春生，张富城，彭晨健，孙鲁宁. 虎潜丸诱导肩袖撕裂损伤模型大鼠血清外泌体中白细胞介素1受体拮抗剂释放促进肩袖腱骨愈合[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 3007-3012.

Huang Yao1, He Bing1, Shu Hao1, Zhang Chunsheng1, Zhang Fucheng1, Peng Chenjian1, Sun Luning2. Huqian Pill accelerates rotator cuff tendon-bone healing through inducing interleukin-1 receptor antagonist release from exosomes of rat serum [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 3007-3012.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠50只，分为2组，实验过程中对照组大鼠死亡5只，虎潜丸组死亡4只，最终实验组20只，虎潜丸组21只进入结果分析。

2.2 虎潜丸组冈上肌拉力破坏载荷明显高于对照组在冈上肌重建术后4周取材后测试冈上肌破坏载荷。发现虎潜丸组破坏载荷明显高于对照组；虎潜丸组的拉力破坏载荷在16.5-23.9 N，而对照组的拉力破坏载荷在11.1-16.7 N，两组数据差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2C。

2.3 虎潜丸促进腱骨结合区域的蛋白聚糖、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达基于拉力破坏载荷的差异，考虑虎潜丸是否促进腱骨愈合。腱骨愈合的关键在于肌腱-骨之间的移行区，腱骨移行区面积和蛋白聚糖是反应腱骨愈合的重要指标。番红固绿染色发现在虎潜丸组中，腱骨移行区的面积大于对照组，并且蛋白聚糖表达强于对照组，见图 3a，b，均有明显统计学意义，见图3c，番红固绿染色表明虎潜丸促进了腱骨移行区的生长愈合。虎潜丸组冈上肌破坏载荷大于对照组也同时说明冈上肌肌腱弹性模量大于对照组，肌腱主要由胶原组成，95%的胶原是Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白是维持肌腱正常结构和弹性最重要的组分，行免疫组织化学发现在虎潜丸组中，Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达量增加，见图4，5。结果证实虎潜丸组冈上肌肌腱生长愈合优于对照组。将冈上肌远端3 mm腱性部分行Western blotting半定量分析，发现虎潜丸促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达，见图6。

2.4 虎潜丸促进大鼠体内外泌体及白细胞介素1受体拮抗剂分泌大鼠在重建肩袖术后灌胃虎潜丸水煎液48 h，提取血清外泌体后，行电镜及Western blotting证实外泌体，见图7A。虎潜丸灌胃48 h检测大鼠血清中外泌体表达，发现外泌体表面标志物CD63、CD9和CD81的表达明显增加，差异有统计学意义，见图7 B，C，由此可知虎潜丸促进了大鼠体内外泌体的表达。基于外泌体对细胞的免疫和新陈代谢调控，推测外泌体携带有调控炎症因子的蛋白，因此检测对白细胞介素有重要调控作用的白细胞介素1受体拮抗剂，发现虎潜丸组外泌体中白细胞介素1受体拮抗剂表达增加，见图8，针对大鼠重建后4周肩关节免疫组织化学检测白细胞介素1受体拮抗剂，同样发现虎潜丸组腱骨移行区的白细胞介素1受体拮抗剂表达较对照组的明显增加，差异有统计学意义，见图9。

参考文献

[1] Gulotta LV,Nho SJ,Dodson CC,et al.Prospective evaluation of arthroscopic rotator cuff repairs at 5 years: part II--prognostic factors for clinical and radiographic outcomes.J Shoulder Elbow Surg. 2011; 20(6): 941-946.

[2] Ko S,Choi C,Kim S,et al.Prevalence and Risk Factors of Neuropathic Pain in Patients with a Rotator Cuff Tear. Pain Physician.2018; 21(2): E173-E180.

[3] Yamaguchi K,Ditsios K,Middleton WD,et al.The demographic and morphological features of rotator cuff disease. A comparison of asymptomatic and symptomatic shoulders. J Bone Joint Surg Am. 2006;88(8): 1699-1704.

[4] Harryman DT 2nd,Hettrich CM,Smith KL,et al.A prospective multipractice investigation of patients with full-thickness rotator cuff tears: the importance of comorbidities, practice, and other covariables on self-assessed shoulder function and health status.J Bone Joint Surg Am.2003; 85-A(4): 690-696.

[5] Colvin AC,Egorova N,Harrison AK,et al.National trends in rotator cuff repair.J Bone Joint Surg Am.2012; 94(3): 227-233.

[6] Iyengar JJ,Samagh SP,Schairer W,et al.Current trends in rotator cuff repair: surgical technique, setting, and cost. Arthroscopy.2014; 30(3): 284-288.

[7] Park MC,ElAttrache NS,Tibone JE,et al.Part I: Footprint contact characteristics for a transosseous-equivalent rotator cuff repair technique compared with a double-row repair technique. J Shoulder Elbow Surg.2007; 16(4): 461-468.

[8] Duquin TR,Buyea C,Bisson LJ.Which method of rotator cuff repair leads to the highest rate of structural healing? A systematic review.Am J Sports Med.2010; 38(4): 835-841.

[9] Bishop J,Klepps S,Lo IK,et al.Cuff integrity after arthroscopic versus open rotator cuff repair: a prospective study.J Shoulder Elbow Surg. 2006; 15(3): 290-299.

[10] Tashjian RZ, Hollins AM, Kim HM, et al. Factors affecting healing rates after arthroscopic double-row rotator cuff repair.Am J Sports Med.2010; 38(12): 2435-2442.

[11] Kim HM,Caldwell JM,Buza JA,et al.Factors affecting satisfaction and shoulder function in patients with a recurrent rotator cuff tear.J Bone Joint Surg Am.2014; 96(2): 106-112.

[12] Eljabu W,Klinger HM,von Knoch M.The natural history of rotator cuff tears: a systematic review. Arch Orthop Trauma Surg.2015; 135(8): 1055-1061.

[13] Ye C,Zhang W,Wang S,et al.Icariin Promotes Tendon-Bone Healing during Repair of Rotator Cuff Tears: A Biomechanical and Histological Study. Int J Mol Sci. 2016;17(11). pii: E1780.

[14] Trevino EA,McFaline-Figueroa J,Guldberg RE,et al.Full-thickness rotator cuff tear in rat results in distinct temporal expression of multiple proteases in tendon, muscle, and cartilage. J Orthop Res. 2018 Nov 20.

[15] Lu LY,Ma M,Cai JF,et al.Effects of Local Application of Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction on Tendon-Bone Healing after Rotator Cuff Tear in Rabbits. Chin Med J (Engl).2018; 131(21): 2620-2622.

[16] Phinney DG,Di Giuseppe M,Njah J,et al.Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun.2015;6: 8472.

[17] Bernardo ME, Fibbe WE. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell.2013;13(4): 392-402.

[18] 李茹,孟毅,郜妞妞,等.虎潜丸的临床应用现况[J].中医临床研究，2017, 9(16): 137-139.

[19] 王鑫,孙滨,张婧婧.虎潜丸对骨髓基质干细胞BMSCs增长分化的影响[J].世界最新医学信息文摘,2016, 16(83): 140.

[20] Mardpour S,Hamidieh AA,Taleahmad S,et al.Interaction between mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles and immune cells by distinct protein content. J Cell Physiol. 2018 Oct 30.

[21] Toh WS,Zhang B,Lai RC,et al.Immune regulatory targets of mesenchymal stromal cell exosomes/small extracellular vesicles in tissue regeneration. Cytotherapy.2018; 20(12): 1419-1426.

[22] Seo N,Akiyoshi K,Shiku H.Exosome-mediated regulation of tumor immunology. Cancer Sci. 2018; 109(10): 2998-3004.

[23] Omi R,Gingery A,Steinmann SP,et al.Rotator cuff repair augmentation in a rat model that combines a multilayer xenograft tendon scaffold with bone marrow stromal cells.J Shoulder Elbow Surg [J]. 2016; 25(3): 469-477.

[24] 孙国荣,尤冬春,石鑫,等.经皮椎体后凸成形术联合虎潜丸治疗骨质疏松性胸腰椎压缩骨折45例[J]. 中医药导报,2015,21(02): 67-69.

[25] 谢义松,尤冬春,朱建华,等.虎潜丸对去势大鼠骨密度及BMP-2水平影响的研究[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(12): 1407-1410.

[26] Lee KW, Lee JS, Kim YS, et al. Effective healing of chronic rotator cuff injury using recombinant bone morphogenetic protein-2 coated dermal patch in vivo.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2017; 105(7): 1840-1846.

[27] Dinarello CA.Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases. Blood. 2011; 117 (14): 3720-3732

[28] Yang G,Im HJ,Wang JH.Repetitive mechanical stretching modulates IL-1beta induced COX-2, MMP-1 expression, and PGE2 production in human patellar tendon fibroblasts. Gene.2005;363:166-172

[29] Attur MG,Dave MN,Leung MY,et al.Functional genomic analysis of type II IL-1beta decoy receptor: potential for gene therapy in human arthritis and inflammation.J Immunol.2002;168(4): 2001-2010

[30] Genevay S,Finckh A,Mezin F,et al.Influence of cytokine inhibitors on concentration and activity of MMP-1 and MMP-3 in disc herniation. Arthritis Res Ther.2009;11(6):R169.

引言

肩袖撕裂是最常见的导致肩关节疼痛和功能障碍的疾病^[1-2]。肩袖撕裂常需要手术治疗以减轻疼痛和恢复功能^[3-4]。在美国每年有近27万患者接受肩袖重建手术，并且接受手术患者的数量持续在增长^[5-6]。尽管肩袖修复的技术日益精进^[7-8]，但研究显示仍有30%-94%的修复失败率^[9-11]，失败的原因不仅仅在于机械应力，腱骨界面的愈合能力低也是一个重要原因^[12]。腱骨结合部分为3层结构：肌腱、腱骨移行区和骨，肩袖撕裂主要发生在腱骨移行区，腱骨移行区的愈合对于肩袖修复至关重要^[13]。腱骨移行区的愈合与诸多因素相关，诸如血供、细胞因子、细胞外基质等。腱骨移行区为乏血管组织，诸多促炎因子和细胞外基质的降解导致腱骨移行区愈合不良或再撕裂^[14-15]。细胞外微小囊泡中的外泌体能作为旁分泌或自分泌的调节因子，完成细胞间的信息传递，进而调控免疫反应和组织新陈代谢^[16-17]。由此，推测外泌体对于肩袖腱骨愈合存在重要作用，关于外泌体与肩袖腱骨愈合的关系目前缺乏研究。虎潜丸首载于元代朱丹溪的《丹溪心法》中，功善滋阴降火，强壮筋骨，多用来治疗肝肾不足、阴虚内热导致的骨痿，广泛应用于临床多种疾病^[18]，并且研究发现虎潜丸促进间充质干细胞的分化和增殖^[19]，基于间充质干细胞分泌大量的外泌体，进而调节细胞内信号通路及新陈代谢等^[20-22]。由此推测虎潜丸可以通过作用于外泌体，进而影响肩袖腱骨愈合。该研究旨在探索虎潜丸诱导的大鼠体内外泌体的表达变化，以及促进大鼠肩袖腱骨愈合的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验；力学和组织学观察。

1.2 时间及地点 2017年9月至2018年9月在江苏省中医院动物实验基地完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，5周龄，体质量(150±10)g，购自北京维通利华动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。室温22-24 ℃，湿度50%-60%，自然光照，进食饮水自由。实验方案经南京中医药大学动物实验伦理委员会批准(ACU170706)。

1.3.2 药物虎潜丸由江苏省中医院药剂科提供，药物组成：黄柏(酒炒)240 g、龟甲(酒炙)120 g、知母(酒炒)60 g、熟地黄60 g、陈皮60 g、白芍60 g、锁阳45 g、狗骨(酒炙) 30 g、干姜15 g。虎潜丸水煎液，含生药0.5 g/mL。

1.4 实验方法

1.4.1 肩袖撕裂模型建立体积分数10%水合氯醛 (3 mL/kg)腹腔注射，麻醉成功后，取肩关节外侧切口，拨开斜方肌，显露冈上肌，暴露冈上肌位于肱骨头止点，离断冈上肌止点，剪去2 mm冈上肌远端肌腱，缝合皮肤，见图1。4周后，4-0薇荞可吸收线穿骨固定冈上肌肌腱至肱骨头大结节部。

1.4.2 动物分组干预将肩袖冈上肌重建后大鼠随机分为2组，对照组25只喂养自来水；虎潜丸组25只。重建当日即开始水煎液灌胃，1次/d，虎潜丸给药按水煎液 5 g/(kg•d)体质量灌胃。

实验动物造模过程的相关问题
造模目的：	研究虎潜丸促进肩袖腱骨愈合的机制
借鉴已有标准实施动物造模：	参考文献[15]的方法，对SD大鼠行单侧肩关节肩袖撕裂造模
选择动物的条件：	①SPF级SD大鼠；②雄性；③5周龄；④体质量(150±10) g
动物来源及品系：	SD大鼠购自于北京维通利华动物技术有限公司
模型与所研究疾病的关系：	①观察虎潜丸诱导后模型大鼠体内外泌体的表达变化；②探讨其促进大鼠肩袖腱骨愈合的机制
造模技术描述：	麻醉成功后，取肩关节外侧切口，拨开斜方肌，显露冈上肌，暴露冈上肌位于肱骨头止点，离断冈上肌止点，剪去2 mm冈上肌远端肌腱，缝合皮肤
动物数量及分组方法：	随机分为2组：对照组n=25；虎潜丸组n=25
造模成功评价指标：	离断冈上肌止点，剪去2 mm冈上肌远端肌腱
造模后实验观察指标：	①冈上肌拉力破坏载荷测试结果；②番红固绿染色检测腱骨结合区域的蛋白聚糖的表达；③免疫组织化学染色检测腱骨结合区域的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达；④Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达，大鼠体内外泌体表面标志物CD63、CD9和CD81的表达及白细胞介素1受体拮抗剂分泌结果
造模过程中动物死亡原因：	麻醉意外
造模后动物处理：	重建术后4周麻醉后剪取肱骨及冈上肌并心脏取血
伦理委员会批准文件：	实验方案经南京中医药大学动物实验伦理委员会批准(ACU170706)

1.4.3 生物力学测试重建术后4周(每组8肩)行生物力学测试。于肱骨下端离断，小心保留冈上肌及其止点，并剔除除外冈上肌的其他肌肉，形成冈上肌-肱骨复合体，见图2A。标本制作后立刻置于40 g/L多聚甲醛溶液中。肩关节组织固定在INSTRON(Instron，Boston，MA，USA)生物力学测试仪上，固定牢固后，仪器进行加载，位移速度 5 mm/min，测试肩袖组织最大拉力载荷量，见图2B。

1.4.4 番红固绿染色肩关节固定脱钙后，石蜡包埋，冠状位5 μm切片，脱蜡后水化，固绿染色：切片入固绿染液5-10 min，水洗去多余染液，至软骨呈无色，分化液稍浸泡，自来水稍洗。番红染色：切片入番红染液15-30 s，三缸无水乙醇快速脱水。透明封固：干净的二甲苯透明5 min，中性树胶封固。检测腱骨结合区域的蛋白聚糖的表达，软骨呈红色或橙红色，背景绿色。

1.4.5 免疫组织化学染色法组织固定后石蜡包埋(肩关节需经脱钙)，冠状位5 μm切片，脱蜡后水化，封闭后一抗(均为Abcam，抗体浓度按照说明书推荐使用)4 ℃过夜。第2天，弃一抗后，二抗(Thermo)室温1 h，DAB(中衫金桥)染色，苏木精复染，酸化后梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。检测腱骨结合区域的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达。

1.4.6 外泌体提取大鼠在重建肩袖术后灌胃虎潜丸水煎液48 h，麻醉大鼠心脏取血，离心后取血清。血清中外泌体以超速离心提取法：血清以300×g离心10 min去除细胞碎片，取上清，再经29 500×g离心20 min进一步去除细胞碎片和杂质，取上清，上清经0.22 μm一次性无菌过滤器过滤，120 000×g离心90 min，弃上清，取下方沉淀，沉淀以100 μL的PBS溶解，分装后-80 ℃保存。

1.4.7 Western blotting检测肌腱组织(取冈上肌肌腱远端3mm)和外泌体提取物定量后，每孔上样总蛋白10 μg，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300 mA电泳转移至PVDF膜上，5%BSA封闭液封闭1 h，一抗(均为Abcam，抗体浓度按照说明书推荐使用)4 ℃孵育过夜，漂洗后二抗(羊抗兔IgG，1∶5 000，Thermo Fisher)室温孵育2 h，漂洗后显影分析。检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达，大鼠体内外泌体表面标志物CD63、CD9和CD81的表达及白细胞介素1受体拮抗剂分泌结果。

1.5 主要观察指标 ①冈上肌拉力破坏载荷测试结果；②番红固绿染色检测蛋白聚糖的表达；③免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达；④Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达，外泌体表面标志物的表达及白细胞介素1受体拮抗剂分泌结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件统计。计量资料以 x(_)表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05认为差异有统计学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程±s

讨论

试图在祖国医药中寻找解决肩袖撕裂愈合困难的办法，研究虎潜丸与肩袖愈合的关系以及内在机制。研究发现虎潜丸促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化^[19]，间充质干细胞的增殖与分化被认为可以促进肩袖修复^[23]。另外虎潜丸能够增加骨密度，被应用于抗骨质疏松^[24]，基础研究发现虎潜丸促进大鼠体内骨形态发生蛋白2的表达^[25]。在肩袖撕裂研究中发现骨形态发生蛋白2能够促进肩袖腱骨愈合^[26]。基于以上研究，推测虎潜丸能够促进肩袖腱骨愈合。

在大鼠肩袖撕裂模型中，作者发现虎潜丸提高了肩袖冈上肌破坏载荷，推测虎潜丸促进腱骨愈合。番红固绿证实腱骨移行区面积和蛋白聚糖的表达增加；进一步推断虎潜丸促进冈上肌肌腱生长愈合，肌腱内胶原95%为Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白较粗呈紧密排列，为肌腱抵抗张力的主要成分，Ⅲ型胶原蛋白较细，呈网状排列，交联分子间结构。因此实验主要观察肌腱内Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达。免疫组织化学和Western blotting同样证实虎潜丸组大鼠肩袖撕裂部位Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达增加。

基于虎潜丸对于骨髓间充质干细胞的增殖和分化促进作用，以及间充质干细胞分泌外泌体调控靶细胞的免疫和新陈代谢等作用，推测虎潜丸是否能够促进大鼠体内外泌体释放？进一步研究证实虎潜丸明显提高了大鼠体内外泌体水平。基于此，推测外泌体携带有促进腱骨愈合的物质。炎症因子中的白细胞介素1被认为是肌腱退变和撕裂的重要原因，白细胞介素1是腱骨愈合中重要的负性调控因素^[27]，另外白细胞介素1诱导产生基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶是软骨内蛋白聚糖和肌腱内胶原降价的最主要原因^[28]。由此可见调控白细胞介素1对于腱骨愈合具有重要意义。生物体内的白细胞介素1/白细胞介素1受体拮抗剂保持动态平衡状态，白细胞介素1受体拮抗剂能够竞争性结合白细胞介素1受体，导致白细胞介素1受体失活，抑制白细胞介素1的作用；研究显示白细胞介素1受体拮抗剂抑制基质金属蛋白酶释放，减少蛋白聚糖的降解，从而延缓骨和软骨的破坏^[29]；另外，白细胞介素1受体能够减少炎症因子诱导的胶原降解^[30]。因此，提高白细胞介素1受体拮抗剂表达能够促进腱骨愈合，基于此，作者认为虎潜丸诱导白细胞介素1受体拮抗剂分泌进而促进肩袖腱骨愈合，大鼠外泌体中白细胞介素1受体拮抗剂的Western blotting检测证实白细胞介素1受体拮抗剂表达升高，继续在肩关节中检测白细胞介素1受体拮抗剂的表达，证实虎潜丸组肩袖腱骨移行区的白细胞介素1受体拮抗剂表达较对照组明显升高，同时发现腱骨移行区中白细胞介素1受体拮抗剂表达越多，腱骨移行区的面积更大更规则，见图9a。

目前对于肩袖重建术后的再撕裂缺乏有效预防及治疗手段，中医药对肩袖撕裂治疗几近于空白，近年来的研究热点外泌体和白细胞介素1受体拮抗剂在肩袖撕裂中的作用同样缺乏研究。此次研究意义在于首次阐明虎潜丸促进肩袖腱骨愈合，对于中药治疗肩袖撕裂具有非常积极的意义，并初步探讨了虎潜丸通过诱导外泌体及白细胞介素1受体分泌促进腱骨愈合，首次证实外泌体通过白细胞介素1受体拮抗剂促进肩袖腱骨愈合。研究的局限在于未能阐述虎潜丸作用于干细胞分泌外泌体的相关机制；外泌体和白细胞介素1受体拮抗剂诱导的腱骨愈合机制缺乏深入研究；另外虎潜丸有效成分有待继续研究，以及实验中所用虎潜丸剂量较大，应用于人体尚需进一步探讨。但此次研究为探索外泌体和白细胞介素1受体对于肩袖撕裂开启了新的思路。

结论：虎潜丸通过诱导大鼠体内外泌体和白细胞介素1受体拮抗剂的分泌促进冈上肌止点部腱骨愈合，促进了肩袖撕裂的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程