雌激素受体抑制下氯化锂对成骨细胞AKT-mTOR通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1246

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (19): 3002-3006.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1246

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雌激素受体抑制下氯化锂对成骨细胞AKT-mTOR通路的影响

徐轶尔1，孙贵才2，陈水林2，樊祥伟2

(1哈药集团技术中心，黑龙江省哈尔滨市 150000；2南昌大学第四附属医院骨科，江西省南昌市 330003)

收稿日期:2019-01-20 出版日期:2019-07-08 发布日期:2019-07-08
通讯作者: 孙贵才，博士，主任中医师，南昌大学第四附属医院骨科，江西省南昌市 330003
作者简介:徐轶尔，男，1985年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2012黑龙江中医药大学毕业，硕士，研究员，主要从事中药药理及分子生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81473503)，项目负责人：孙贵才

Effect of lithium chloride on AKT-mTOR signal pathway in osteoblasts after estrogen receptor inhibition

Xu Yier1, Sun Guicai2, Chen Shuilin2, Fan Xiangwei2

(1Technology Center of Harbin Pharmaceutical Group Co., Ltd., Harbin 150000, Heilongjiang Province, China; 2Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Jiangxi Province, China)

Received:2019-01-20 Online:2019-07-08 Published:2019-07-08
Contact: Sun Guicai, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Jiangxi Province, China
About author:Xu Yier, Master, Researcher, Technology Center of Harbin Pharmaceutical Group Co., Ltd., Harbin 150000, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81473503 (to SGC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
雌激素受体：可位于细胞膜、细胞质或细胞核。经典的核受体位于细胞核，其蛋白质在翻译后短暂位于胞浆，故可在细胞质检测到。扩散到细胞核的雌激素与其核受体结合后引发基因调控机制，调节下游基因的转录。
启动子：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，启动子本身不被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。

摘要
背景：氯化锂可以通过Wnt通路激活来治疗骨质疏松，并能激活诱导骨细胞自噬，推测提高氯化锂在Akt ，mTOR磷酸化表达可以作为提高成骨细胞分化的作用机制之一。
目的：分析雌激素受体抑制下氯化锂对大鼠成骨细胞AKT-mTOR通路作用机制。
方法：SPF级出生3 d的SD乳鼠，购买于黑龙江中医药大学动物实验中心。麻醉下分离乳鼠颅骨成骨细胞，采用酶消化法和茜素红染色法获得和鉴定成骨细胞。将成骨细胞随机分为空白组(正常培养细胞)、抑制剂组(ICI182780)、治疗组(氯化锂+ ICI182780)。倒置显微镜下观察细胞形态；加入不同浓度的氯化锂(0，1，2，5 nmol/L)处理细胞24 h，采用CCK-8检测各组细胞增殖情况；采用茜素红染色及碱性磷酸酶活性检测成骨细胞分化情况；Western blot法测定成骨细胞中p-AKT，p-mTOR的表达。
结果与结论：①倒置显微镜下观察细胞多为单核、多边形及梭形，局部有细胞密集的细胞团；②不同浓度的氯化锂都能对成骨细胞增殖产生促进作用，在一定范围内随着氯化锂浓度的增加促进作用逐渐增强；③与空白组比较，抑制剂组成骨细胞矿化能力明显降低，与抑制剂组比较，治疗组成骨细胞矿化结节能力明显增加；④与空白组比较，抑制剂组中碱性磷酸酶活性明显降低，与抑制剂组比较，治疗组中碱性磷酸酶活性明显增加；⑤与空白组比较，抑制剂组中细胞p-AKT，p-mTOR蛋白表达明显降低，与抑制剂组比较，治疗组中p-AKT，p-mTOR蛋白表达显著增加；⑥结果说明，雌激素受体抑制下氯化锂可以通过激活AKT-mTOR通路促进成骨细胞增殖分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8031-7160(徐轶尔)

关键词: 氯化锂, 成骨细胞, 雌激素受体, 骨质疏松, 成骨细胞自噬, 成骨细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Lithium chloride treats osteoporosis by activating Wnt signaling pathway, and can induce autophagy. Thereafter, improving the expression of lithium chloride in Akt and mTOR phosphorylation can promote osteoblast differentiation.
OBJECTIVE: To analyze the effect of lithium chloride on AKT-mTOR signal pathway in osteoblasts after estrogen receptor inhibition.
METHODS: Sprague-Dawley newly born 3-day rats, SPF grade (provided by Laboratory Animal Center of Heilongjiang University of Chinese Medicine) were selected. The osteoblasts were isolated from rat cranial bone by enzyme digestion, and then identified by alizarin red staining. The osteoblasts were randomized into blank control (normal culture), inhibitor (ICI182780), and treatment (lithium chloride plus ICI182780) groups. The cell morphology was observed under inverted microscope. Different concentrations of lithium chloride (0, 1, 2, 5 nmol/L) were added and cultured for 24 hours, and the cell proliferation was detected by cell counting-kit 8 assay. The osteoblast differentiation was detected by alizarin red staining and alkaline phosphatase activity. The contents of p-AKT and p-mTOR in osteoblasts were determined by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Inverted microscope showed that most of cells were mononuclear, polygonal and fusiform, with local cell-dense cell clusters. (2) Different concentrations of lithium chloride could promote osteoblast proliferation in a concentration-dependent manner. (3) Compared with the blank control group, mineralization ability of osteoblasts in the inhibitor was significantly decreased. Compared with the inhibitor group, the mineralization ability of osteoblasts in the treatment group was significantly increased. (4) The alkaline phosphatase activity in the inhibitor group was significantly lower than that in the blank control and treatment groups. (5) The expression levels of p-AKT and p-mTOR in the inhibitor group were significantly lower than those in the blank control and treatment groups. (6) To conclude, lithium chloride can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts by activating the AKT-mTOR pathway with estrogen receptor inhibition.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: lithinm chloride, osteoblasts, estrogen receptor, osteoporosis, osteoblast autophagy, osteoblast differentiation

中图分类号:

R446

徐轶尔，孙贵才，陈水林，樊祥伟. 雌激素受体抑制下氯化锂对成骨细胞AKT-mTOR通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 3002-3006.

Xu Yier1, Sun Guicai2, Chen Shuilin2, Fan Xiangwei2 . Effect of lithium chloride on AKT-mTOR signal pathway in osteoblasts after estrogen receptor inhibition[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 3002-3006.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态

倒置显微镜观察：细胞接种24 h后进行显微镜观察，发现其部分细胞出现了贴壁的情况，且部分细胞出现了伸展的情况。很多细胞(培养4 d)出现了较多突起的情况，见图1A。部分细胞(培养7-10 d)为单层细胞，且细胞形态多样，大多呈现单核、三角形、梭形以及多边形等，有较多突起，呈“铺路石”样排列，细胞紧凑密集的细胞团见图1B。符合成骨细胞特点。

2.2 氯化锂对成骨细胞的增殖作用见表1。CCK-8法检测结果显示，不同浓度的氯化锂都能对成骨细胞增殖产生不同程度作用，生长率随着氯化锂的浓度升高而增加，在 0-5 nmol/L内具有有线性关系。其余各组与0 nmol/L比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 茜素红染色结果汇合时的细胞大多呈现出多层重叠生长的情况，局部细胞会堆集成灶状，对钙结节采取茜素红染色，将其染成橘红色，结果均表明此方法所得细胞均具有生物学以及成骨细胞形态学活性。

茜素红染色结果表明，治疗组比抑制剂组成骨细胞矿化能力明显增加。见图2。各组成骨细胞碱性磷酸酶活力检测结果表明，在诱导21 d时空白组碱性磷酸酶活力最强，对比其余2组差异均有显著性意义(P < 0. 05)，治疗组碱性磷酸酶活力显著强于抑制剂组(P < 0. 05)。见图3。

2.4 各组对成骨细胞中p-Akt，p-mTOR表达影响与空白组比较，抑制剂组可以明显降低p-Akt，p-mTOR表达(P < 0.05)；相比于抑制剂组，治疗组氯化锂能够显著增加p-Akt，p-mTOR蛋白的表达(P < 0.05)。说明氯化锂可以拮抗雌激素受体抑制剂作用。见图4。

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引言

绝经后引起的骨质疏松特征是骨强度减弱和骨密度降低^[1-3]，雌激素降低导致骨吸收和骨重建之间出现不平衡，最终导致整体骨量减少^[4-5]。如双膦酸盐类药物作为骨吸收抑制剂广泛用于治疗骨质疏松症，但长期使用会产生严重的肌肉骨骼疼痛和低钙血症等不良反应^[6]。因此，寻找治疗骨质疏松症的新型药物成为医药工作者们亟待解决的问题。

mTOR信号通路是调节细胞增殖与分化的重要因子，有调节生长因子、氧化等细胞传感器的作用。mTOR磷酸化并调节丝氨酸/苏氨酸核糖体蛋白S6激酶B1(S6K1)的活性，mTOR信号可以调节激素环境等(COTA等)^[7]。有证据表明雌激素/雌激素受体信号可以抑制破骨细胞骨吸收，还可以促进成骨细胞增殖分化。研究表明氯化锂也具有类似的功能，进一步证明氯化锂能有效改善去势大鼠的骨丢失，改善骨微结构和骨强度^[8]。氯化锂对人类早期重要器官发育有重要的影响^[9]，氯化锂的主要靶点是肌醇磷酸酶和糖原合成酶激酶3。糖原合成酶激酶3是经典Wnt的关键枢纽信号传导途径^[10]。氯化锂抑制细胞的表达和活化糖原合成酶激酶3^[11]。

氯化锂作为糖原合成酶激酶3β抑制剂可以促进细胞生长发育，抑制细胞凋亡及促进启动子的表达，并保护受损组织^[12-13]，这些研究表明氯化锂可能对细胞起到的保护作用，是通过抑制糖原合成酶激酶3β而发挥的。一些研究发现，锂具有促进成骨细胞增殖及促进间充质干细胞增殖的作用^[14]。对比Wang等^[15]与刘伟等^[16]发现单纯的雌激素受体抑制下氯化锂对成骨细胞治疗机制的研究比较少。基于这些研究，作者试图确定在雌激素受体抑制时氯化锂对成骨细胞作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2018年1至6月在黑龙江中医药大学方剂实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选取在黑龙江中医药大学动物实验中心购买的SPF级新生3 d的SD乳鼠，实验动物合格证号SCXK黑2015004。动物饲养环境：温度(23±2)℃；相对湿度(55±15)%；实验室风速：0.1-0.2 m/s。

1.3.2 实验用主要药物与试剂氯化锂(sigma，62476- 100G-F，美国)，胎牛血清、MEMα培养基、青霉素-链霉素混合液和胰酶(Hyclone，美国)；雌激素受体抑制剂ICI182780(上海浩然生物技术有限公司)；CCK8(同仁，CK04，日本) ；P-AKT(Abcam，ab38449，美国)；P-MTOR(Abcam，ab84400，美国)；抗GAPDH抗体购苏州瀛睿生物技术有限公司；维生素C(sigma，A4403，美国)；β-甘油磷酸钠(sigma，Sigma-50020，美国)；地塞米松(sigma，D4902，美国)；茜素红染液(索莱宝，G1452，中国)；PNPP(大连美伦，MB3188，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 乳鼠颅骨成骨细胞分离在无菌条件下进行乳鼠颅骨成骨细胞分离操作，分离完毕后在冷PBS中将结缔组织去除。随后使用PBS对其进行重复吹打清洗两三次，需要清洗直至头骨呈现透明状，清洗完毕后将其剪成小组织块(< 1 mm×1 mm×1 mm)，将小组织块放置于1.5 mL离心管，加入3倍体积Trypsin(0.1%)，将离心管放置于恒温摇床(37 ℃)中进行15-20 min的振荡消化，使得离心管内的血清能够终止消化。消化终止后将其静置于4 ℃的环境下5 min，弃上清，同时向其中加入Collagenase I(0.2%)，将离心管放置于恒温摇床(37 ℃)中进行60 min的振荡消化，消化终止后，对其进行反复吹打，同时过滤将骨碎片去除，收集滤液，离心的速度为1 000 r/min，时间为10 min，弃上清，置于培养箱中培养；每两三天更换1次，通过倒置显微镜仔细观察细胞生长情况以及细胞状态。

1.4.2 CCK8检测成骨细胞增殖取对数生长期成骨细胞，调整细胞浓度为1×10⁸L^-1，接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养24 h后，加入不同浓度的氯化锂(0，1，2，5 nmol/L)处理24 h，结束后每孔加入10 μL的CCK8继续孵育3 h，然后在波长490 nm处用酶标仪测定每孔吸光度值。

1.4.3 成骨细胞分组取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁸L^-1，接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养24 h 后。设对照组(正常培养细胞)、抑制剂组(10^-7 mol/L ICI182780)、治疗组(5 nmol氯化锂+ 10^-7 mol/L ICI182780)分别继续培养24 h^[5]。

1.4.4 钙化结节染色(茜素红法) 首先需要在矿化诱导培养基培养下(100 nmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸，7 mol/L地塞米松)对第3代细胞进行矿化诱导，各组分别加入相应浓度药物：设对照组(矿化诱导培养基)、抑制剂组 (10^-7mol/L ICI182780)、治疗组(5 nmol氯化锂+10^-7mol/L ICI182780)。对细胞进行诱导处理21 d后弃去培养液，用PBS反复冲洗培养板，再以体积分数95%乙醇固定15 min，再以双蒸水反复冲洗3次，使用0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)染色处理，在37 ℃的环境下孵育1 h以上，双蒸水冲洗3次。采取PNPP法测定碱性磷酸酶活性，连续培养21 d后去培养液，使用PBS进行漂洗，对其进行3次以上的反复冻融(1% Triton X-100)，在磷酸盐底物中将细胞裂解物孵育30 min，之后将1 mol/L NaOH药剂加入来终止反应。

1.4.5 成骨细胞中p-AKT及p-mTOR蛋白含量的测定选取处于对数期的成骨细胞，在6孔培养板上接种2×10⁴ /孔，2 mL/孔，待细胞贴壁后舍弃上清液。实验分为空白组、治疗组和抑制剂组，各组处理方法同上。提取细胞总蛋白，定量蛋白含量，采取SDS-PAGE(12.5%)进行电泳分离，分离后在二氟乙烯((PVDF)膜上将其转移，使用脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液(5%)在室温下进行至少1 h的孵育，孵育后在其中加入1∶100的一抗工作液稀释，4 ℃环境下过夜，使用TBS缓冲液冲洗3次以上，10 min/次，使用1∶200的二抗工作液(加入生物素标记)进行孵育1 h以上，使用TBST缓冲液冲洗3次以上，10 min/次，采用ECL法进行显色处理。最后采取凝胶成像系统对相关组织进行摄片观察，观察的结果以目的条带与内参条带(GAPDH)吸光度的比值表示。

1.5 主要观察指标 ①细胞形态；②CCK-8检测细胞增殖情况；③采用茜素红染色及碱性磷酸酶活性检测成骨细胞分化情况；④Western blot法测定成骨细胞中p-AKT，p-MTOR的表达。

1.6 统计学分析将相关数据记录于统计学软件SPSS 19.0中，结果采取x(_)±s表示，进行t 检验及卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨是由多个细胞组成的矿化组织。雌激素参与骨重建过程，骨重建主要由成骨细胞与破骨细胞共同作用的结果^[17]。骨质疏松分为原发性和继发性两类，绝经后骨质疏松是最常见的原发性骨质疏松症^[3]，雌激素缺失引起骨吸收和骨形成不平衡，过度骨吸收导致骨质疏松^[18]。一般治疗骨质疏松类药物主要是骨吸收抑制剂，例如双膦酸盐类药物、降钙素^[19]。雌激素作为治疗骨质疏松症的药物在改善骨量方面的有效性非常小^[20]。而且，氯化锂作为一种双向调节骨形成与骨吸收的潜在药物是治疗骨质疏松症的新途径，刘兴宇等^[21]研究发现氯化锂可以通过Wnt通路激活来治疗骨质疏松，以及前期研究发现氯化锂可激活诱导骨细胞自噬，所以作者推测氯化锂提高其在Akt，mTOR磷酸化表达也可以作为提高成骨细胞分化的作用机制之一。

雌激素受体归属于核受体家族，雌激素受体分为有α和β两种亚型，分布在人体内有不同组织中，与骨质疏松疾病相关^[22]，ICI182780作为雌激素受体调节剂^[23]，ICI182780可以完全阻断雌激素的效应^[24]。CCK-8结果显示治疗组对比抑制剂组细胞增殖具有显著性差异，说明氯化锂可以在雌激素受体抑制时提高成骨细胞增殖。茜素红与碱性磷酸酶结果显示通过用ICI182780阻断雌激素后发现，氯化锂可以促进成骨细胞矿化能力与碱性磷酸酶活性，可见在雌激素受体抑制时的氯化锂可以提高骨分化。

雷帕霉素特异性靶点(mTOR)是动物的生长和发育所必须的^[25]，近年来发现也可调控哺乳动物骨发育、骨形成、骨重构的重要分子复合物^[26]。研究结果显示：对比抑制剂组结果，治疗组可以提高成骨细胞p-Akt，p-mTOR表达水平，而空白组对比抑制剂组成骨细胞p-Akt，p-mTOR表达水平显著降低，提示氯化锂在ICI182780抑制剂情况下可提高Akt，mTOR磷酸化水平，p-Akt，p-mTOR水平提高说明敏感的mTOR复合体(mTORC1)活化^[27-32]。这些作用可激活蛋白的翻译，促进细胞的分化^[33-35]。进而调控成骨细胞的生长及能量代谢，从而对成骨细胞的增殖与分化发挥促进作用。

结合前期研究发现在雌激素受体抑制下氯化锂可通过提高p-Akt及p-mTOR表达提高Beclin1进而促进成骨细胞自噬与分化。mTOR激活还有助于骨髓基质细胞分化成成骨细胞^[36-37]。通过以上这些结果表明，在雌激素受体抑制下氯化锂可以通过提高Akt/mTOR信号通路中的Akt及mTOR磷酸化水平刺激成骨分化及碱性磷酸酶活力。研究为明确雌激素缺失下引发骨质疏松类疾病提供机制研究。

研究提示在雌激素受体抑制下氯化锂可激活成骨细胞中Akt及mTOR的磷酸化。研究具有一定的局限性，在哺乳动物整个生命周期中骨骼的不断更新过程称为骨重塑，在这个过程中，既包括破骨细胞骨吸收过程也包括成骨细胞骨再生过程，实验仅在单一细胞中进行了验证，下一步将在破骨细胞中进行研究，以及在成骨细胞与破骨细胞共培养中进行研究。研究为雌激素缺失下引发骨质疏松类疾病提供一种治疗手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

雌激素受体抑制下氯化锂对成骨细胞AKT-mTOR通路的影响

Effect of lithium chloride on AKT-mTOR signal pathway in osteoblasts after estrogen receptor inhibition

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