基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白
基因敲除小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1248

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (19): 3013-3018.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1248

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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白
基因敲除小鼠模型

袁涛1，王勇卓1，黄远章1，席刚1，魏垒1，2，张民1

(1山西医科大学附属第二临床医学院，骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030001；2美国布朗大学医学院骨科/罗德岛州医院骨科，RI02903美国罗德岛州)

收稿日期:2018-10-31 出版日期:2019-07-08 发布日期:2019-07-08
通讯作者: 张民，副教授，山西医科大学附属第二临床医学院，骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030001
作者简介:袁涛，男，1990年生，山西省太原市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事骨关节炎、骨与软骨损伤修复的研究。
基金资助:
国家国际科技合作专项项目(2015DFA33050)，项目参与者：张民；山西省人社厅择优资助重点项目(2017-19)，项目负责人：张民

Establishment of Indian hedgehog protein conditional knockout mouse models based on Cre/LoxP system

Yuan Tao1, Wang Yongzhuo1, Huang Yuanzhang1, Xi Gang1, Wei Lei1, 2, Zhang Min1

(1Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury Repair, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Brown University Hospital/Rhode Island Hospital, Rhode Island RI02903, USA)

Received:2018-10-31 Online:2019-07-08 Published:2019-07-08
Contact: Zhang Min, Associate professor, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury Repair, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Yuan Tao, Master candidate, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury Repair, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National International Science and Technology Cooperation Project, No. 2015DFA33050 (to ZM); the Key Project of Shanxi Provincial Department of Human Resources and Social Sciences, No. 2017-19 (to ZM)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
印第安刺猬蛋白(Indian hedgehog，Ihh)基因：是刺猬蛋白(Hedgehog，Hh)家族中的一员，其主要在软骨细胞中表达，并在软骨细胞增殖和分化的过程中起着重要的调控作用。
基因敲除(knockout)：是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

摘要
背景：印第安刺猬蛋白(Ihh)条件性基因敲除小鼠动物模型的建立，实现了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除能够在时间和组织上具有选择性，能够为进一步研究与生长板有关的严重遗传病提供实验基础。
目的：基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型，并进一步观察其表型变化差异。
方法：SPF级亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠，均由美国布朗大学魏垒教授赠予。将亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠杂交，获得基因型Col2a1- CreERT2，Ihhfl/-小鼠；再将此基因型小鼠自交，获得刚出生的小鼠。通过琼脂糖凝胶电泳对刚出生小鼠进行基因鉴定，随机分为2组：实验组小鼠于出生后第1天开始腹腔注射玉米油溶解的20 g/L 他莫昔芬10 μL，连续注射3 d；对照组小鼠腹腔注射等量玉米油。出生后第6天RT-qPCR检测印第安刺猬蛋白基因的敲除率；第8天小鼠膝关节行番红固绿染色、Von Kassa染色进行初步表型观察；第8周行小鼠大体形态观察、记录后肢股骨/胫骨长度，后肢X射线片观察。
结果与结论：①通过RT-qPCR证实了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除率为76.83%，8周龄小鼠大体形态表现为肢体短小畸形(P < 0.01)；②X射线显示敲除小鼠胫骨明显缩短且骨骺端发育异常；③番红固绿染色显示印第安刺猬蛋白条件性敲除表达在发育中的小鼠胫骨生长板软骨组织这一特定区域；④Von Kassa染色显示Ihhd/d小鼠生长板过早闭合；⑤初步建立了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除小鼠模型，印第安刺猬蛋白条件性基因敲除后引起小鼠生长板区软骨细胞增殖紊乱，生长板区软骨细胞提前矿化，生长板过早骨化闭合，小鼠表现为肢体短小畸形。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4599-4091(袁涛)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 软骨生长板, 条件基因敲除, 动物模型, 他莫昔芬, 小鼠, Ihh

Abstract:

BACKGROUND: The establishment of an animal model of Indian hedgehog protein (Ihh) conditional knockout mice can realize the time and tissue selectivity of Ihh conditional gene knockout, which can provide an experimental basis for further research on some serious genetic diseases related to growth plates.
OBJECTIVE: To establish a cartilage tissue-specific Ihh knockout mouse model by Cre/LoxP system, and further observe the difference in phenotypic changes.
METHODS: Ihhfl/fl and Col2a1-CreERT2 mice, SPF grade, were provided by Prof. Wei Lei from Brown University. Ihhfl/fl and Col2a1-CreERT2 mice were hybrided to obtain Col2a1-CreERT2, and Ihhfl/- mice, and then self-matched to obtain newly born mice. Genetic identification of newly born mice was performed by agarose gel electrophoresis, and then randomized into two groups. The mice received intraperitoneal injection of 20 g/L tamoxifen (10 μL) dissolved in corn oil at the first day after born for 3 consecutive days (experimental group). The controls were given the same volume of corn oil. The knockdown rate of the Ihh gene was detected by RT-qPCR at 6 days after birth. The initial phenotype of the mouse knee was observed by Safranin O and Von Kassa staining on day 8. The gross morphology of the 8-week-old mice was observed, the length of femur and tibia in the hind limb was recorded, and the lower extremity was observed by X-ray film.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Ihh conditional gene knockout rate was 76.83% by RT-qPCR. The result of gross morphology showed short limb deformity (P < 0.01). (2) X-ray showed that the tibia of the knockout mice was significantly shortened. (3) Safranin O staining showed that Ihh conditional knockout was expressed in a specific region of the developing mouse tibia growth plate cartilage tissue. (4) Von Kassa staining showed that Ihhd/d mouse growth plates closed prematurely. The Ihh conditional knockout mouse model was initially established. (5) After the Ihh conditional gene knockout, the chondrocyte proliferation disorder in the growth plate area of mice was induced. The cells in the growth plate area were mineralized in advance, the growth plate was prematurely ossified, and the mice showed short limb deformities.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: tissue construction, bone tissue engineering, cartilage growth plate, conditional gene knockout, animal model, tamoxifen, mice, Ihh

中图分类号:

R446
R318

袁涛，王勇卓，黄远章，席刚，魏垒，张民 . 基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白
基因敲除小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 3013-3018.

Yuan Tao1, Wang Yongzhuo1, Huang Yuanzhang1, Xi Gang1, Wei Lei1, 2, Zhang Min1. Establishment of Indian hedgehog protein conditional knockout mouse models based on Cre/LoxP system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 3013-3018.

图/表（结果） 2

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引言

印第安刺猬蛋白(Indian hedgehog，Ihh)是刺猬蛋白(Hedgehog，Hh)家族中的一员。该家族在脊椎动物中还包括：Shh(Sonic hedgehog)、Dhh(Desert hedgehog)^[1]。其中，Ihh主要在软骨细胞中表达，并在软骨细胞增殖和分化的过程中起着重要的调控作用^[2]。生长板是位于骨骺与干骺端之间的软骨组织，其在软骨内骨化的所有阶段均与软骨细胞相关^[3]。生长板移植实验表明：生长板骨化过程主要由局部因素调控^[4]，其中Ihh起着中心性调节的作用^[5-6]。同时，Ihh对骨骼系统的影响和导致骨骼发育不良的分析通常采用动物模型，早前的体内研究使用突变的Ihh小鼠模型，但是此模型小鼠在围生期致死率极高，小鼠在出生前后极易死亡；后来使用Ihh-null模型，此模型小鼠出生后竞争力差，存活率低，导致小鼠难以存活到所需观察时间^[7]；2种方法均不能对Ihh进行深入研究，而更进一步的研究也均是在生长板形成后进行的^[3]。

直至1981年Sternberg等^[8]提出Cre-LoxP重组酶系统，实现了Ihh条件性基因敲除能够在时间和组织上具有选择性^[9]。但是，在后续的操作过程中也存在着造模方法不一导致的Ihh基因敲除率过低、造模过程中小鼠异常死亡等问题。因此，建立Ihh条件性基因敲除小鼠的模型，总结操作及鉴定方法的经验，为后续进一步研究与生长板有关的严重遗传病^[10](如Jensen干骺端发育不良、Laron综合征等)提供实验基础。

研究拟应用Cre-LoxP系统建立Ihh条件性基因敲除小鼠模型，需要2种转基因动物，一种是在靶向敲除组基因序列中引入LoxP序列的Ihh转基因小鼠，另一种是通过Col2a1启动子驱动的CreERT2转基因小鼠^[11]。在获得全身携带Ihh^fl/fl条件性等位基因小鼠后，与Col2a1-CreERT2转基因小鼠交配，对子代进行基因型鉴定获得Col2a1- CreERT2；Ihh^fl/fl基因小鼠后，小鼠腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen ^TM)得到Ihh^d/d小鼠，为后续的研究奠定基础。

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材料方法

1.1 设计 Ihh条件性基因敲除小鼠动物模型的建立。

1.2 时间及地点实验于2017年3至11月在山西医科大学第二医院骨与软骨组织损伤修复实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物亲代Ihh^fl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠，均由美国布朗大学魏垒教授赠予。饲养于山西医科大学动物实验中心，配以标准的恒温恒湿SPF级房间，喂以标准饲料。

1.3.2 小鼠的饲养和繁殖将亲代Ihh^fl/fl小鼠与Col2a1- CreERT2小鼠杂交，获得基因型Col2a1-CreERT2，Ihh^fl/-小鼠；再将基因型Col2a1-CreERT2，Ihh^fl/-小鼠自交，获得刚出生的小鼠。以观察到母鼠体内阴道栓为受孕第1天标志，大概21 d分娩。在模型小鼠繁育过程中，雄性和雌性小鼠以1∶2或1∶3的比例合笼交配。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠子代基因型鉴定根据打靶载体构建时Flox区域所在的位置，利用PCR扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳并根据基因片段长度和产物的有无判断小鼠的基因型。

1.4.2 DNA的提取切取刚出生小鼠尾部约5 mm，置于200 μL EP管中(同时剪去仔鼠脚趾以作为标记并编号，尽量避免出血)，每管加入50 μL鼠尾消化酶(按表1配置)，确保鼠尾没入消化酶中，使用普通PCR进行DNA提取。条件：56 ℃ 2 h；95 ℃ 10 min；4 ℃ 5 min。取上清液于1.5 mL EP管中低温高速离心，条件：4 ℃ 13 000 r/min 10 min。

表1 鼠尾组织消化酶的配置

Table 1 Preparation of tail tissue digestive enzymes

试剂	计量(μL)
10×Gitscher Buffer	5
10×β-mercaptoethanol	5
10×Tritonx-100	5
10×Proteinase K	5
dH₂O	30

1.4.3 鼠尾Cre、Ihh基因的扩增 PCR反应体系(引物序列见表2)总计25 μL，前引物(10 μmol/L)1 μL，后引物 (10 μmol/L)1 μL，DNA原液1 μL，Maxima SYBR Green 12.5 μL，RNase-free H₂O 9.5 μL。PCR扩增条件：Ihh 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，5个循环；94 ℃ 30 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。Cre 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，5个循环；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。

表2 PCR扩增引物序列

Table 2 Primer sequence for PCR amplification

名称	引物序列(5’-3’)
Ihh^fl/fl(F)	5′-GAT GCC AAA CGG CTT GTA ATG ACC A-3′
Ihh^fl/fl(R)	5′-CCA TCG AAG CAT CGC CAC CTGC-3′
Cre(F)	5′-ATC CGA AAA GAA AAC GTT GA-3′
Cre(R)	5′-ATC CAG GGT ACG GAT ATA GT-3′

1.4.4 扩增产物电泳 2 g琼脂糖溶于100 mL1×TBE(Tris硼酸)中配置2%琼脂糖溶液，煮胶、备板、倒胶后，扩增产物与6×loading buffer按5∶1混匀，取20 μL上样，胶板右端空槽加5 μL DNA marker，电泳结束后凝胶成像系统观察。电泳条件：90 V，45 min。

1.4.5 构建Col2a1-CreERT2 Ihh^d/d基因小鼠模型取基因型为Ihh^fl/fl；Col2a1-CreERT2小鼠随机分为实验组与对照组，每组各12只，实验组小鼠于出生后第1天开始腹腔注射玉米油溶解的20 g/L他莫昔芬10 μL，连续注射3 d。对照组小鼠腹腔注射等量玉米油。

1.4.6 实验动物分组实验组与对照组均在相同的时间采用相同的检测方法进行实验，见表3。

表3 两组动物实验检测流程

Table 3 Experimental flow chart

时间	数量(小鼠数/后肢数)	实验情况
出生后第6天	6/12	RT-qPCR测定Ihh敲除率
出生后第8天	2/4	番红固绿及Von Kassa染色
出生后第8周	4/8	大体形态观察及X射线检测
共计	12/24

1.4.7 RT-qPCR测定Ihh基因敲除率

(1)组织总RNA提取：取出生后第6天实验组及对照组小鼠各6只，切取双后肢骨骺与干骺端间软骨生长板，每2个软骨生长板为一个标本；液氮研磨，1 mL Trizol裂解， 4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清200 μL氯仿抽提， 4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清加等体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心5min，可观察到管壁上呈羽毛状白色沉淀，1 mL DEPC水配置体积分数75%乙醇清洗沉淀并晾干(因沉淀晾干后透明，可在管壁上用记号笔标记)，20 μL RNase-free H₂O溶解沉淀，测定总RNA浓度及260/280比值。

(2)总RNA反转录为cDNA：使用Takara反转录试剂盒，配置20 μL体系，总RNA 1 mg/总RNA浓度，5×Prime Script Buffer 4 μL，RNase-free H₂O补齐至20 μL。Real-time PCR条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 h。

(3)RT-qPCR检测Ihh表达：使用Takara扩增试剂盒，配置20 μL体系(引物序列见表4)，SYBR Green 10 μL，前引物(10 μmol/L)1 μL，后引物(10 μmol/L)1 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H₂O 6 μL。条件：预变性95 ℃ 15 s；变性95℃ 5 s，退火延伸59℃ 30 s，40个循环(QuantStudio 6)。GAPDH为内参基因。

表4 RT-qPCR扩增引物序列

Table 4 Primer sequence for RT-qCR amplification

名称	引物序列(5’-3’)
Ihh(F)	5′-CCA CCT CCG GGC CAC ATT TG-3′ 5′-GGC CAC CAC ATC CTC CAC CA-3′ 5′-AGC AGT CCC GTA CAC TGG CAA AC-3′ 5′-TCT GTG GTG ATG TAA ATG TCC TCT -3′
Ihh(R)
GAPDH(F)
GAPDH(R)

1.4.8 番红固绿染色将出生后8 d小鼠膝关节(包括股骨与胫骨)切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化后，蒸馏水水洗转入染液。苏木精1 min，0.2%固绿5 min，番红O染液1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固后3DHistech数字切片扫描分析系统(Pannoramic MIDI)扫片观察，记录并照相。

1.4.9 Von Kassa染色将出生后8 d小鼠膝关节(包括股骨与胫骨)切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化后，蒸馏水水洗转入染液。5%硝酸银滴染，紫外线照射1 h，5%硫代硫酸钠3 s，1%中性红溶液70 s，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固后3DHistech数字切片扫描分析系统(Pannoramic MIDI)扫片观察，记录并照相。

1.4.10 外观照及X射线片取8周实验及对照组小鼠各3只拍照观察外观大体形态，拍摄X射线片观察并记录小鼠股骨、胫骨长度，采用SPSS 20.0进行统计学分析。

1.5 主要观察指标 ①PCR基因型分析；②RT-qPCR检测Ihh基因的敲除率；③番红固绿染色结果：④Von Kassa染色；⑤外观形态及后肢X射线观察结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行分析，组间比较进行t 检验。

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讨论

传统基因敲除小鼠模型中，某些对生命活动至关重要的基因被完全敲除后，小鼠常出现胚胎致死或出生后不久就死亡的现象，限制了实验的进一步研究，而条件性基因敲除技术是基于Cre-LoxP系统介导下的一种位点基因特异性重组技术，使得对小鼠基因的修饰处于时空可调控的状态。通过基因重组工程，Ihh^fl/fl与CreERT2基因重组，构建于表达Col2a1的组织内，ERT2为雌激素受体，当雌激素他莫昔芬代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT2结合后，启动Cre插入Ihh^fl/fl的floxed基因之间，同时Ihh基因位于同向同链染色体上，从而实现了条件性敲除Ihh基因^[12]。Col2a1及Cre基因表达于软骨膜细胞和软骨细胞，Ihh主要表达于软骨细胞，因此条件性敲除主要敲除软骨细胞来源的Ihh基因^[13]。

CreERT2在无他莫昔芬诱导的情况下，在细胞质内处于无活性的状态，当他莫昔芬诱导后，他莫昔芬的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT2结合，可使CreERT2进核发挥重组酶活性。不同的研究采用不同的注射计量^[14]，Maeda等^[7]采用出生后第1天，单次注射0.2 mg的他莫昔芬，Hilton等^[15]采用100 μg的注射量。此次研究实验室通过预实验，最终采用20 g/L于出生后1，2，3 d连续腹腔注射3 d，每次10 μL。实验过程中进行剪足趾、标记及腹腔注射他莫昔芬时，应尽量做到动作轻柔仔细，否则易出现母鼠吞食幼崽的情况。

此次研究成功建立了Ihh条件性基因敲除小鼠模型，为研究Ihh基因自身的功能和分子调控机制提供了可靠的在体试验模型。结果发现Ihh基因敲除后，小鼠四肢长骨明显缩短，表现为短小畸形。生长板区域细胞增殖分化紊乱，生长板提前异常骨化，可能与软骨细胞过早肥大化，成血管相关因子及成骨细胞破骨细胞的早期入侵有关^[16]。Vortkamp等^[17]发现Ihh与甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)在软骨内成骨过程中通过负反馈调节软骨细胞的增殖与分化，基于这一发现，后续研究证明了Ihh-PTHrP信号轴在软骨内成骨中中枢性的调节作用^[18]，在这个信号轴周围，有许多生长因子，如骨形态发生蛋白、Sox9、转化生长因子β等参与调控软骨及成骨细胞增殖分化，下调Ihh表达可激活转化生长因子β抑制软骨细胞分化^[19]；PTHrP抑制Runx2转录，通过负反馈的方形式抑制Ihh表达^[20]；Ihh通过抑制Sox9阻止软骨细胞肥大化^[21]；通过下调骨形态发生蛋白6表达抑制软骨细胞成熟^[22]。因此，Ihh基因在转录调控及信号传导通路的作用机制仍有待进一步研讨，Ihh条件性基因敲除小鼠模型的建立，将为阐述上述因素在软骨生长板中的作用，并为诸如Jensen干骺端发育不良、Laron综合征、人类Ihh基因突变导致的A1型短指症等疾病的发病机理提供扎实的技术基础^[23]。

此外，实验存在着一些不足：①实验样本量偏少，降低了结论的可信度，仍有待于进行大样本、大动物实验等来验证结论的可靠性；②实验所用的种鼠系由美国布朗大学魏垒教授所赠，在模型小鼠的繁育过程中需要不断地对刚出生进行基因鉴定，降低了实验进展速度；③实验所采用的切片染色观察均是定性观察，未进行定量研究和统计

学分析。当然，在此基础上，实验提供了完整的Ihh基因敲除小鼠模型建立的方法，并进行了相对系统的验证，为后续Ihh基因的在体研究提供了可靠的实验基础。

结论：实验成功建立了Ihh条件性基因敲除小鼠模型，发现Ihh条件性基因敲除后小鼠生长板区软骨细胞增殖紊乱，生长板区软骨细胞提前矿化，生长板过早骨化闭合，小鼠表现为四肢短小畸形。为进一步研究Ihh信号传导通路调控机制奠定了基础。

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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白
基因敲除小鼠模型

Establishment of Indian hedgehog protein conditional knockout mouse models based on Cre/LoxP system

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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白 基因敲除小鼠模型

Establishment of Indian hedgehog protein conditional knockout mouse models based on Cre/LoxP system

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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白
基因敲除小鼠模型