溶血磷脂酸刺激可影响成骨细胞表达结缔组织生长因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1240

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
溶血磷脂酸：是一种具有多种生物活性的磷脂，在人体内广泛存在，可参与一系列的生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、生存、趋化和肿瘤细胞侵袭等。骨折后局部形成血肿，血肿中活化的血小板可释放出大量的溶血磷脂酸，这些局部聚集的溶血磷脂酸可能参与骨折的愈合过程，但其在骨折中所起的作用仍不清楚。体外研究证实溶血磷脂酸可诱导间充质干细胞向成骨细胞向分化，并促进其形成矿化结节的能力。
结缔组织生长因子2：是富含半胱氨酸的多肽，是CCN蛋白家族中的一员，是强力的促结缔组织增生的生长因子，最初的研究发现其参与多种包括细胞增殖、迁移、黏附和生存、分化及细胞外基质合成。大量的研究表明其与多种器官的纤维化密切相关，在多种组织内广泛表达，并在发育中起主要作用，包括骨组织的发育和形成。

摘要
背景：溶血磷脂酸可刺激上皮细胞和成肌细胞表达结缔组织生长因子2，但涉及的分子机制至今仍不清楚。成骨细胞是骨发育和骨折愈合中的重要细胞，其也表达溶血磷脂酸的受体，骨折局部高表达溶血磷脂酸和成骨细胞，且结缔组织生长因子2在骨折愈合中发挥主要作用。
目的：研究外源性溶血性磷脂酸对成骨细胞中结缔组织生长因子2表达水平的影响及其分子机制。
方法：①体外培养MC3T3-E1细胞，将细胞分为对照组和实验组，对照组仅给予矿化诱导液，实验组在矿化诱导液中加入终浓度为20 μmol/L的溶血磷脂酸，刺激0.5，1，2，4，6，8及12 h，提取RNA并检测结缔组织生长因子2 mRNA表达水平；②MC3T3-E1细胞预先经蛋白激酶A抑制剂(H-89)和蛋白激酶C抑制剂(Staurosporine)处理0.5 h，再加入溶血磷脂酸。定量PCR检测结缔组织生长因子2 mRNA表达水平、Western Blot法检测结缔组织生长因子2蛋白表达水平，Western blot法和免疫荧光检测细胞蛋白激酶C转位情况。
结果与结论：①溶血磷脂酸作用于MC3T3-E1细胞后，可迅速引起细胞内结缔组织生长因子2 mRNA和蛋白表达水平提高，刺激后2 h其表达量达到峰值，随后表达水平随时间逐渐降低，至8 h和12 h已基本恢复至刺激前的表达水平；②Staurosporine可明显减弱溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2的能力；而H-89则可以使溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2的能力进一步增强；③成骨细胞经溶血磷脂酸刺激15 min后，溶血磷脂酸可明显提高细胞膜蛋白激酶C表达水平，同时胞浆中蛋白激酶C表达水平降低；④结果提示，溶血磷脂酸可刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2，这一过程可能涉及蛋白激酶A和蛋白激酶C途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4803-2242(胡广)

关键词: 溶血磷脂酸, 骨折愈合, 成骨细胞, 骨形成, 结缔组织生长因子, 蛋白激酶A, 蛋白激酶C, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Lysophosphatidic acid stimulates the expression of connective tissue growth factor 2 in
epithelial and myoblast cells, but the molecular mechanisms involved are still unclear. Osteoblasts are important cells in bone development and fracture healing, the expression of the lysophosphatidic acid receptor, whereas fracture local high expression of lysophosphatidic acid and connective tissue growth factor 2 in primary osteoblasts and fracture healing.
OBJECTIVE: To investigate the molecular mechanism in which lysophosphatidic acid stimulates the expression of connective tissue growth factor 2 in osteoblasts.
METHODS: (1) MC3T3-E1 cells were cultivated in vitro, cells were divided into control (mineralized solution) and experimental (mineralized solution plus 20 μmol/L lysophosphatidic acid) groups for 0.5, 1, 2, 4, 6 and 8 and 12 hours. Then, total RNAs were extracted and the expression of connective tissue growth factor 2 was tested. (2) MC3T3-E1 cells were pretreated by protein kinase A inhibitor H-89 and protein kinase C inhibitor staurosporine for 0.5 hours, followed by adding lysophosphatidic acid. The expression levels of connective tissue growth factor 2 mRNA and protein were detected by quantitative PCR and western blot assay. The translocation of protein kinase C was detected by western blot and immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Lysophosphatidic acid could trigger connective tissue growth factor 2 mRNA and protein expression transiently in MC3T3-E1 cells, which peaked at 2 hours after stimulation, followed by a decrease, and restored to the baseline level at 8 and 12 hours. (2) Staurosporine could reduce the ability of lysophosphatidic acid stimulating connective tissue growth factor 2 in osteoblasts, while H-89 increased the ability of lysophosphatidic acid stimulating connective tissue growth factor 2 in osteoblasts. (3) The amount protein kinase C expressed in the cell membrane in MC3T3-E1 cells treated with lysophosphatidic acid was increased significantly. At the same time, the amount of protein kinase C expressed in cytoplasm was reduced. (4) To conclude, lysophosphatidic acid induces the expression of connective tissue growth factor may be via protein kinase A and C pathways.

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Key words: lysophosphatidic acid, fracture healing, osteoblasts, osteogenesis, connective tissue growth factor, protein kinase A, protein kinase C, bone defect

中图分类号:

胡广，张开伟，徐远坤. 溶血磷脂酸刺激可影响成骨细胞表达结缔组织生长因子[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 2959-2964.

Hu Guang, Zhang Kaiwei, Xu Yuankun. Lysophosphatidic acid affects the expression of connective tissue growth factor in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 2959-2964.

图/表（结果） 4

2.1 溶血磷脂酸对原代成骨细胞形成矿化结节能力的影响原代成骨细胞分实验组和对照组，矿化诱导28 d后，茜素红染色大体观察可见对照组和实验组均有明显的红色结节，但实验组较对照组红色结节更多、面积更大，见图1A-D；镜下观察，实验组和对照组成骨细胞周围均可见鲜红色或褐色钙化结节，实验组钙化红色结节面积较对照组更大。

2.2 溶血磷脂酸对MC3T3-E1细胞结缔组织生长因子2 mRNA表达水平的影响溶血磷脂酸作用于MC3T3-E1细胞后，可迅速引起细胞内结缔组织生长因子2 mRNA表达水平提高，0.5 h即有明显的增加(2.13±0.14 vs.1.00±0.01，P < 0.05)，这一增高效应在刺激后2 h 5.62±0.48达到最大，随后结缔组织生长因子2 mRNA表达水平逐渐降低，至8 h (1.53±0.19)和12 h(1.23±0.22)、24 h(1.13±0.12)已基本恢复至刺激前的表达水平，见图2。

Staurosporine可明显减弱溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2的能力(5.98±0.72 vs. 1.64±0.28，P < 0.05)；而H-89则可以使溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2的能力增强(5.98±0.72 vs. 7.64±0.49，(P < 0.05)，即H-89与溶血磷脂酸联合应用时结缔组织生长因子2表达水平明显高于单独应用溶血磷脂酸时的水平。

2.3 溶血磷脂酸对MC3T3-E1细胞结缔组织生长因子2蛋白表达水平的影响溶血磷脂酸刺激成骨细胞6 h后检测到结缔组织生长因子2蛋白水平明显提高(P < 0.05)，与mRNA相似，见图3。MC3T3-E1细胞预先经Staurosporine和H-89处理0.5 h再加入溶血磷脂酸刺激，结果与mRNA变化相似，Staurosporine可消弱溶血磷脂酸对结缔组织生长因子2的刺激作用(P < 0.05)，而H-89则可增强溶血磷脂酸对成骨表达结缔组织生长因子2的刺激效应(P < 0.05)。

2.4 溶血磷脂酸对细胞蛋白激酶C膜转位的影响 Western blot结果显示溶血磷脂酸可明显提高细胞膜蛋白激酶C表达水平，同时胞浆中蛋白激酶C表达水平降低，说明溶血磷脂酸作用下，成骨细胞中蛋白激酶C从胞浆转位至胞膜，见图4A。免疫荧光结果显示，对照组成骨细胞胞浆中蛋白激酶C表达水平较高，呈现明显的红色；实验组，其胞浆中蛋白激酶C表达水平较对照组低，红染程度较对照组弱，包膜上有明显的红色聚集圈，说明包膜中蛋白激酶C表达水平较高，见图4B。这一结果与蛋白质电泳结果相符。

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引言

溶血磷脂酸是一种具有多种生物活性的磷脂，在人体内广泛存在^[1-2]。溶血磷脂酸可参与一系列的生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、生存、趋化和肿瘤细胞侵袭等^[3-4]。骨折后局部形成血肿，血肿中活化的血小板可释放出大量的溶血磷脂酸，这些局部聚集的溶血磷脂酸可能参与骨折的愈合过程，但其在骨折中所起的作用目前尚不清楚^[5]。体外研究证实溶血磷脂酸可诱导间充质干细胞向成骨细胞向分化，并促进其形成矿化结节的能力^[6]，但其在生物体内是否能促进骨折的愈合和骨缺损的修复至今未见报道。若体内研究证实溶血磷脂酸能促进骨折的愈合，将可能为骨组织工程提供新的细胞因子。

结缔组织生长因子是一种富含半胱氨酸的多肽，又名结缔组织生长因子2，是CCN蛋白家族中的一员^[7]。结缔组织生长因子2是强力的促结缔组织增生的生长因子，最初的研究发现，结缔组织生长因子2参与多种包括细胞增殖、迁移、黏附和生存、分化及细胞外基质合成。随后关于结缔组织生长因子2的研究主要集中于其在纤维化疾病中促进细胞外基质形成^[8]。结缔组织生长因子2在多种组织内广泛表达，并在发育中起主要作用，包括骨组织发育和形成。骨折后局部结缔组织生长因子2的表达随时间变化，表现出先增加，至第8天达到高峰，随后逐渐回落到正常水平。这些结果说明结缔组织生长因子2可能在骨折愈合中起到某种作用^[9]，在骨折愈合早期，其表达明显增高，可能参与骨折的愈合过程，并在其中发挥作用。

溶血磷脂酸可结合细胞表面的溶血磷脂酸受体诱导体外培养的成肌细胞和上皮细胞表达结缔组织生长因子2。溶血磷脂酸可刺激多种细胞表达结缔组织生长因子2，但其是否会影响在骨折愈合中发挥重要作用的成骨细胞中结缔组织生长因子2的表达水平仍然不清楚，此外关于溶血磷脂酸刺激细胞表达结缔组织生长因子2相关机制的研究报道甚少。小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞中表达溶血磷脂酸多种受体，尤其是溶血磷脂酸1。因此推测：溶血磷脂酸可影响MC3T3-E1细胞结缔组织生长因子2的表达，那么是否溶血磷脂酸也能诱导成骨细胞表达结缔组织生长因子2，鉴于骨折局部高表达的溶血磷脂酸、成骨细胞和结缔组织生长因子2在骨折愈合的主要作用，当前实验致力于研究体外培养的成骨是否会对溶血磷脂酸刺激表现出增加结缔组织生长因子2表达，并探讨相关分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。

1.2 时间及地点于2017年5月至8月在贵阳中医学院第一附属医院医学实验室完成。

1.3 材料

细胞系：MC3T3-E1细胞系(小鼠颅骨前成骨细胞系)由贵阳中医学院第一附属医院医学实验室提供。

实验用主要试剂：溶血磷脂酸、双抗(青霉素+链霉素)、胰蛋白酶、地塞米松、维生素C磷酸盐、β-磷酸甘油、茜素红、蛋白激酶A和C特异性抑制剂、结缔组织生长因子2一抗(Sigma 公司，美国)；α-MEM培养基、低糖-DMEM培养基(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(GIBCO公司，美国)；Total RNA Kit(omega公司，美国)；反转录试剂盒；(ThermoScientific公司，美国)；普通PCR Mixture(上海莱风生物科技有限公司，中国)；细胞膜蛋白细胞浆蛋白提取试剂盒(天津三箭，中国)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、Western blot电泳液、转膜液(谷歌生物，中国)；蛋白质分子标准品、ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher，美国)；PVDF膜-0.22 μm(Life Technologies，美国)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司，日本)。

实验用主要仪器：T25、T75培养瓶、6孔、24孔细胞培养板、15、50 mL塑料离心管(NEST，中国)；细胞培养箱(Thermo Forma，美国)；超净工作台(北京中化生物技术研究所，中国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；普通PCR仪(PE9 700，日本)；台式离心机(Beckman，美国)；低温高速离心机(GS-15RBeckman，美国)；分光光度计(BIO-RAD，美国)；Realtime-PCR仪(ABIPRISM7 500，美国)；酶标仪(BIO-TECK，美国)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及鉴定复苏冻存于液氮的MC3T3-E1细胞；含体积分数10%胎牛血清、双抗的α-MEM培养基在37 ℃，体积分数5%CO₂条件下连续培养，每3 d换液，至80%融合后传代。将第3代成骨细胞以1×10⁵/孔的细胞浓度接种于6孔板中，含体积分数10%胎牛血清、双抗的低糖DMEM培养基于37 ℃，体积分数5%CO₂条件下连续培养，每3 d换培养液；待细胞铺满孔板底部时，加入矿化诱导液(含50 mg/L维生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+ 10^-8 mol/L地塞米松的完全培养基)，设置对照组和实验组，每组各3个复孔。对照组仅给予矿化诱导液，实验组在矿化诱导液中加入终浓度为20 μmol/L的溶血磷脂酸刺激。培养时间为28 d。

1.4.2 茜素红定量检测茜素红染色后的矿化结节称取茜素红1 g，溶解于100 mL双蒸水中，调节pH值至7.2，过滤，常温保存。将6孔板内的培养基弃净，用PBS浸洗2次，每次5 min，小心吸掉PBS，每孔加入体积分数95%乙醇2 mL，固定10 min，小心吸掉，双蒸水漂洗3次，每次3 min。加入体积分数1%茜素红染液，37 ℃预热，孵育30 min。蒸馏水漂洗(不要浸泡)，去除多余浮色。观察并照相记录实验结果。

1.4.3 琼脂糖凝胶-PCR检测溶血磷脂酸作用于MC3TE-E1后结缔组织生长因子2 mRNA表达水平将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中使用完全培养基在37 ℃，体积分数5%CO₂条件下连续培养；待细胞贴壁后用无血清的α-MEM培养基饥饿8 h；更换新的α-MEM培养基，加入无菌过滤的牛血清白蛋白。分别于0.5，1，2，4，6，8及12 h，每组各3个复孔提取RNA。引物序列见表1。

表1 PCR所用引物序列

Table 1 Primer sequences for PCR

基因	序列
结缔组织生长因子2	5'-GCC TAC CGA CTG GAA GAC ACA TTT-3'
	5'-TTA CGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT-3'
GAPDH	5'-AAT GTG TCC GTC GTG GAT CTG A-3'
	5'- AGT GTA GCC CAA GAT GCC CTT C-3'

用琼脂糖和TAE配置一定浓度的琼脂糖凝胶，其中TAE均加25 mL。微波炉使琼脂糖充分溶解，之后加入1 μL EB染料，充分混匀，待琼脂糖凝胶冷却至70 ℃左右时，将液体轻轻倒入预先放置了梳子的制胶板中，室温下凝固，然后拔去梳子。加样：将制胶板放入到电泳槽中，加入电泳缓冲液(1×TAE)，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶液面1.0-2.0 mm。在加样孔中加入DNAmarker和样品各5 μL。电泳：盖上电泳槽，接通电源，调节电压至90 V，电泳至溴酚蓝走到凝胶2/3长度时停止电泳。拍照观察：电泳完毕，取出凝胶置于紫外检测仪或者凝胶成像系统中观察，拍照，保存，记录结果。

之后使用MC3T3-E1细胞预先经蛋白激酶C特异性抑制剂Staurosporine或蛋白激酶A特异性抑制剂H-89处理0.5 h后再加入溶血磷脂酸刺激，溶血磷脂酸刺激操作步骤同上。

1.4.4 Western blot法检测溶血磷脂酸作用于MC3TE-E1后结缔组织生长因子2蛋白的表达水平提取每组细胞中的总蛋白进行常规凝胶电泳，蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。经电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加5%脱脂奶粉稀释好的一抗加于膜上，室温反应60 min，用TBST洗膜，10 min×3次，加二抗37 ℃孵育45 min用TBST洗膜10 min×3次，ECL试剂盒检测蛋白的表达，以GAPDH作为内参。

之后使用MC3T3-E1细胞预先经Staurosporine或蛋H-89处理0.5 h后再加入溶血磷脂酸刺激，溶血磷脂酸刺激操作步骤同上。

1.4.5 溶血磷脂酸对成骨细胞蛋白激酶C转位的影响

Western blot法：将MC3T3-E1细胞接种于T25培养瓶中，使用完全培养基在37 ℃，体积分数5%CO₂条件下连续培养，设置对照组和实验组，每组3个复孔；细胞贴壁后无血清饥饿8 h；对照组加无血清培养基和牛血清白蛋白，实验组加入无血清培养基和牛血清白蛋白及溶血磷脂酸，刺激15 min；去除培养基，冷PBS冲洗2次，加入胞膜胞浆蛋白提取液，按试剂盒标准步骤分别提取细胞膜蛋白和胞浆蛋白；BCA法测定蛋白激酶C蛋白浓度。37 ℃孵育1 h，酶标仪测定λ=570的吸光度值。

免疫荧光法：在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的兔抗鼠结缔组织生长因子2一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；加羊抗兔银光标记二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的羊抗兔银光标记二抗，湿盒中20-37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3次，每次3 min(注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行)。复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂封固，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.5 主要观察指标 ①结缔组织生长因子2 mRNA和蛋白表达水平；②Western blot和免疫荧光检测细胞蛋白激酶C转位情况。

1.6 统计学分析用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以x(_)±s表示，均数的组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Student’s t-test分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

溶血磷脂酸可刺激多种细胞表达结缔组织生长因子2，但其是否会影响在骨折愈合中发挥重要作用的成骨细胞中结缔组织生长因子2的表达水平仍然不清楚，此外关于溶血磷脂酸刺激细胞表达结缔组织生长因子2相关的机制的研究报道较少^[10-11]。小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞中表达溶血磷脂酸多种受体，尤其是溶血磷脂酸1^[12-14]。因此推测：溶血磷脂酸可影响MC3T3-E1细胞细胞结缔组织生长因子2的表达。

溶血磷脂酸作用于MC3T3-E1细胞细胞后，可迅速引起细胞内结缔组织生长因子2 mRNA表达水平提高，这一增高效应在刺激后2 h达到最大，随后结缔组织生长因子 2 mRNA表达水平逐渐降低，至8 h和12 h已基本恢复至刺激前的表达水平。蛋白水平的变化和mRNA变化相似，即溶血磷脂酸刺激成骨细胞6 h后检测到结缔组织生长因子2蛋白水平明显提高。

鉴于溶血磷脂酸能刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2，随后研究了其中的机制。溶血磷脂酸受体属于G蛋白偶联受体(GPCRs)^[15-18]。配体与受体结合激活受体，激活的GPCRs作用于其下游的效应分子，改变第二信使的含量与分布，第二信号分子激活相应的靶分子，靶分子结构改变产生生物学效应。经典的GPCRs介导的信号转导涉及至少数条途经，例如cAMP-蛋白激酶A途经、IP3/DAG-蛋白激酶C途经等。溶血磷脂酸与受体结合，刺激大鼠成骨细胞DNA复制，并使成骨细胞数目增加，这一过程涉及到溶血磷脂酸1和蛋白激酶C^[19-22]，说明蛋白激酶C可能是溶血磷脂酸1的下游分子。Ca²⁺是细胞内重要的第二信使，参与细胞信号转导^[23-26]。多数研究显示，溶血磷脂酸与受体结合可诱导成骨细胞内Ca²⁺浓度快速增加^[27-28]，而蛋白激酶C的激活是Ca²⁺依赖性的。

因此实验进一步检测溶血磷脂酸通过溶血磷脂酸受体刺激成骨表达结缔组织生长因子2是否涉及上述蛋白激酶C及蛋白激酶A两条途经。当MC3T3-E1细胞预先经蛋白激酶A和蛋白激酶C激酶抑制剂处理0.5 h后，再加入溶血磷脂酸刺激。结果发现上述两条途经均可能与溶血磷脂酸刺激MC3T3-E1细胞表达结缔组织生长因子2有关。Staurosporine孵育后的MC3T3-E1细胞对溶血磷脂酸刺激的反应减弱。H-89孵育后的MC3T3-E1细胞对溶血磷脂酸的刺激反应增强，结缔组织生长因子2表达量更高。上述结果说明溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2可能涉及到GPCRs/蛋白激酶C和GPCRs/蛋白激酶A两条通路。

为进一步证实蛋白激酶C通路与溶血磷脂酸刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2有关，课题组随后研究了溶血磷脂酸对成骨细胞蛋白激酶C膜转位的影响。蛋白激酶C广泛存在于多种组织、器官和细胞中，静置细胞中的蛋白激酶C主要存在于胞浆中，属于无活性的状态；当细胞受到相应的刺激后，蛋白激酶C激活，从胞浆到胞膜或者核内，并磷酸化特异性的蛋白质，因此蛋白激酶C的膜转位被认为是蛋白激酶C激活的标志^[29-30]。成骨细胞经溶血磷脂酸刺激15 min后，分别提取实验组分对照组胞膜和胞浆蛋白激酶C，行蛋白电泳分析。结果表明，溶血磷脂酸可明显提高细胞膜蛋白激酶C表达水平，同时胞浆中蛋白激酶C表达水平降低，说明溶血磷脂酸作用下，成骨细胞中蛋白激酶C从胞浆转位至胞膜，即溶血磷脂酸可激活成骨细胞内蛋白激酶C。抑制蛋白激酶C后，溶血磷脂酸对成骨细胞结缔组织生长因子2的诱导能力明显降低，因此推断蛋白激酶C是溶血磷脂酸诱导成骨细胞表达结缔组织生长因子2的信号通路中重要的中间分子。

综上所述，溶血磷脂酸可刺激成骨细胞表达结缔组织生长因子2，这一过程可能涉及蛋白激酶A和蛋白激酶C途经。溶血磷脂酸可激活成骨细胞内蛋白激酶C，抑制蛋白激酶C可拮抗溶血磷脂酸对MC3T3-E1细胞中细胞结缔组织生长因子2表达的刺激作用。抑制蛋白激酶A可协同溶血磷脂酸刺激细胞结缔组织生长因子2的表达。

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