跨膜蛋白208可影响人软骨细胞的自噬和线粒体功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1228

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (23): 3636-3642.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1228

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跨膜蛋白208可影响人软骨细胞的自噬和线粒体功能

李翔，孟志超，焦阳，于兵孝，塔拉提百克•买买提居马，曹永平

(北京大学第一医院，北京市 100034)

收稿日期:2019-02-21 出版日期:2019-08-18 发布日期:2019-08-18
通讯作者: 曹永平，博士，主任医师，教授，北京大学第一医院，北京市 100034
作者简介:李翔，男，1990年生，山东省枣庄市人，汉族，北京大学第一临床医学院在读博士，医师，主要从事骨关节炎发病机理，膝骨关节炎的治疗研究。并列第一作者：孟志超，男，1984年生，辽宁省庄河市人，汉族，2011年北京大学医学部毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节领域相关研究。
基金资助:
北京市自然科学基金资助项目(7173270)，项目负责人：孟志超

Transmembrane protein 208 affects autophagy and mitochondrial function in chondrocytes

Li Xiang, Meng Zhichao, Jiao Yang, Yu Bingxiao, Talatibaike•Maimaitijuma, Cao Yongping

(Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)

Received:2019-02-21 Online:2019-08-18 Published:2019-08-18
Contact: Cao Yongping, MD, Chief physician, Professor, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
About author:Li Xiang, Doctoral candidate, Physician, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China Meng Zhichao, MD, Attending physician, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China Li Xiang and Meng Zhichao contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7173270 (to MZC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
跨膜蛋白208(Transmembrane protein 208，TMEM208)：是一个自噬抑制基因，可能通过对细胞内质网应激的抑制达到抑制自噬的作用。内质网能识别并降解未正确折叠的蛋白，内质网应激是指各种原因引起的细胞内质网发生功能紊乱, 导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的病理状态。
自噬：是一种通过溶酶体途径进行细胞质组分(蛋白质、细胞器)降解的过程，降解产物被用于能量供应及物质合成。同时，自噬也已被认为是维持软骨细胞功能正常的重要机制。自噬不仅可以调节软骨细胞生命周期的最后阶段，还可以调节软骨细胞进入成熟过程的速度。细胞的自噬水平和机体年龄、局部刺激都有关系。

摘要
背景：软骨细胞自噬水平下降是骨关节炎发病的重要机制之一。自噬抑制基因跨膜蛋白208在晚期膝骨关节炎患者软骨组织中表达升高，该基因可能通过抑制软骨细胞自噬促进骨关节炎发展。
目的：通过体外骨关节炎模型，观察软骨细胞跨膜蛋白208基因表达对自噬和线粒体功能的影响。
方法：软骨组织来源于膝关节表面置换患者术中废弃软骨，非负重面轻度病变软骨(OuterbridgeⅠ-Ⅱ级)作为早期组，负重面重度病变软骨(OuterbridgeⅢ-Ⅳ级)作为晚期组，检测不同软骨组织跨膜蛋白208含量。实验方案符合北京大学第一医院对研究的相关伦理要求，软骨组织供者及其家属在充分了解治疗方案的前提下签署了“知情同意书”。取第4代人正常关节软骨细胞，通过白细胞介素1β刺激人正常软骨细胞诱导骨关节炎体外模型；另外加入自噬激活剂雷帕霉素或自噬抑制剂3-MA预处理软骨细胞后，再加入白细胞介素1β刺激12，24，48 h，观察软骨细胞状态。Real Time PCR检测不同病变软骨组织跨膜蛋白208基因的表达；Western Blot检测自噬相关蛋白轻链蛋白3B、P62表达评价自噬水平；AnnexinV-FITC法评估软骨细胞的凋亡情况；MitoSOX Red dye和JC-1染料荧光显色评价线粒体损伤情况。
结果与结论：①骨关节炎患者重度退变软骨组织跨膜蛋白208表达升高；②用白细胞介素1β刺激软骨细胞12，24和48 h后，软骨细胞跨膜蛋白208表达水平先降后升，自噬水平先升后降，凋亡水平逐渐升高，线粒体损伤逐渐加重；③雷帕霉素能明显降低跨膜蛋白208的表达量，提高自噬水平，降低白细胞介素1β刺激后软骨细胞的凋亡和线粒体损伤；④结论：跨膜蛋白208可抑制软骨细胞自噬，其表达增高可能导致软骨细胞应激状态下的损伤增加。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2963-1802(李翔)；0000-0003-4165-6367(孟志超)

关键词: 软骨细胞, 跨膜蛋白208, 自噬, 骨关节炎, 凋亡, 线粒体损伤, 白细胞介素1β, 雷帕霉素, 北京市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Decreased level of autophagy in chondrocytes is an important mechanism of osteoarthritis. The autophagy inhibitory gene transmembrane protein 208 is elevated in late-stage osteoarthritis cartilage, and this gene may promote the development of osteoarthritis by inhibiting autophagy of chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the effects of chondrocyte transmembrane protein 208 gene on autophagy and mitochondrial function in osteoarthritis model in vitro.
METHODS: The cartilage tissue was from the discarded cartilage of patients undergoing knee arthroplasty. The mild lesion cartilage on non-weight-bearing face (Outerbridge I-II grade) was as early-term group, and the severe lesion cartilage on heavy-weight surface (Outerbridge III-IV grade) was as the late-term group. The content of transmembrane protein 208 in different cartilage tissues was detected. The study was in accordance with the ethical criteria of Peking University First Hospital, and the cartilage donors and their family members signed an informed consent form. Passage 4 normal human chondrocytes were obtained and then stimulated by interleukin-1β to establish the in vitro osteoarthritis. The chondrocytes were pretreated by autophagy activator rapamycin or autophagy inhibitor 3MA, followed by interleukin-1β added for 12, 24 and 48 hours to observe the morphology of chondrocytes. The content of transmembrane protein 208 gene was detected by real-time PCR. Western blot assay was used to detect autophagy-associated protein light chain proteins 3B and P62 to evaluate autophagy levels. The apoptosis of chondrocytes was detected by Annexin V-FITC method. Mitochondrial damage was assessed by fluorescent detection with MitoSOX Red dye and JC-1 dye.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of transmembrane protein 208 was significantly increased in severe osteoarthritis cartilage. (2) After stimulation with interleukin-1β for 12, 24 and 48 hours, the expression level of transmembrane protein 208 in chondrocytes decreased initially, and then increased. The level of autophagy rose initially and then fell. The apoptotic level gradually increased, and mitochondrial damage gradually became severe. (3) Rapamycin could significantly reduce the expression of transmembrane protein 208, increase the level of autophagy, and reduce the apoptosis and mitochondrial damage in chondrocytes after interleukin-1β stimulation. (4) To conclude, transmembrane protein 208 inhibits autophagy in chondrocytes, and increased expression of this gene may lead to increased damage of chondrocytes under stress.

Key words: transmembrane protein 208, autophagy, osteoarthritis, apoptosis, mitochondrial damage, interleukin-1β, rapamycin, the Natural Science Foundation of Beijing

中图分类号:

R446

李翔，孟志超，焦阳，于兵孝，塔拉提百克•买买提居马，曹永平. 跨膜蛋白208可影响人软骨细胞的自噬和线粒体功能[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(23): 3636-3642.

Li Xiang, Meng Zhichao, Jiao Yang, Yu Bingxiao, Talatibaike•Maimaitijuma, Cao Yongping . Transmembrane protein 208 affects autophagy and mitochondrial function in chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(23): 3636-3642.

图/表（结果） 2

2.1 跨膜蛋白208在重度病变骨关节炎软骨组织中表达增加膝关节骨关节炎患者中，轻度病变软骨组织(Outerbridge0-Ⅰ级)跨膜蛋白208的表达水平较低；重度病变软骨组织(OuterbridgeⅣ级)跨膜蛋白208的表达水平明显增高，见图1。

2.2 白细胞介素1β可改变软骨细胞自噬水平改变、细胞凋亡升高及线粒体损伤

2.2.1 软骨细胞自噬水平利用白细胞介素1β刺激软骨细胞建立骨关节炎体外模型，分别选取12，24，48 h 3个时间节点观察软骨细胞状态变化。白细胞介素1β刺激软骨细胞后，直接光镜观察发现软骨细胞的浓度下降、部分细胞形态发生改变，见图2。软骨细胞自噬水平在白细胞介素1β刺激早期(12 h)轻度升高，随刺激时间延长(24，48 h)，细胞自噬水平逐渐下降。

用Western Blot方法检测轻链蛋白3BⅡ/轻链蛋白3BⅠ相对表达量及P62蛋白表达量，评估软骨细胞的自噬水平。白细胞介素1β刺激12 h后，软骨细胞轻链蛋白3BⅡ/轻链蛋白3BⅠ较对照组显著升高，而细胞内P62水平较对照组显著降低，说明白细胞介素1β刺激12 h后，软骨细胞自噬水平有明显提升。白细胞介素1β刺激24，48 h后，软骨细胞轻链蛋白3BⅡ/轻链蛋白3BⅠ较12 h时显著降低，细胞内P62水平显著升高，说明更长时间的刺激(24，48 h)会导致软骨细胞自噬水平逐渐下降。见图3。

2.2.2 细胞凋亡水平利用AnnexinV-FITC法(流式细胞法)评估软骨细胞的凋亡水平，软骨细胞在应激状态下，凋亡水平升高，见图4。白细胞介素1β刺激时间越长，凋亡水平越高，雷帕霉素可以缓解白细胞介素1β刺激造成的细胞凋亡水平升高，而3-MA预处理会加重白细胞介素1β刺激对软骨细胞的伤害。

2.2.3 线粒体损伤情况利用JC-1染料检测细胞内线粒体膜电位，评估线粒体损伤情况。白细胞介素1β刺激可加重线粒体膜电位降低，见图5，且随白细胞介素1β刺激时间延长线粒体损伤加重，雷帕霉素预处理可缓解白细胞介素1β诱导的线粒体损伤，3-MA预处理可加重白细胞介素1β诱导的线粒体损伤。

2.3 白细胞介素1β应激导致软骨细胞跨膜蛋白208表达量随自噬水平变化白细胞介素1β刺激软骨细胞早期 (12 h)，跨膜蛋白208表达降低，随着刺激时间延长(24，48 h)，跨膜蛋白208表达逐渐增高，跨膜蛋白208表达量变化和自噬水平呈相反趋势。见图6。

2.4 自噬水平的改变可影响跨膜蛋白208的表达雷帕霉素刺激软骨细胞后，轻链蛋白3B表达增加，P62表达减少，说明雷帕霉素可明显提高软骨细胞的自噬水平，3-MA可明显降低自噬水平。雷帕霉素预处理后再进行应激状态诱导，软骨细胞跨膜蛋白208表达水平整体降低，3-MA预处理后，软骨细胞跨膜蛋白208表达水平升高，预处理虽然改变细胞的自噬水平，但跨膜蛋白208的表达量仍受白细胞介素1β刺激出现变化，呈现早期下降后期升高的趋势，见图7。

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引言

骨关节炎是一种退行性关节疾病，其确切的病理生理学改变仍然是未知的，其主要特征是关节软骨降解、滑膜炎症和软骨下骨改变。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞类型，对细胞外基质的合成、分泌和降解都有重要作用^[1]。关节软骨内软骨细胞的丧失是导致软骨降解的重要因素之一。目前已在骨关节炎软骨中检测到软骨细胞的凋亡^[2-3]，这与软骨基质降解和钙化都有关，这表明软骨细胞状态和功能的异常是骨关节炎发病的重要机制之一^[4]。

自噬是细胞的一种自我降解过程，对于在发育过程中的关键时刻和细胞应激反应非常重要，对软骨维持稳态很重要^[3]。骨关节炎发病过程中细胞凋亡和自噬之间的功能关系是复杂的。有研究发现，在创伤性骨关节炎模型中，自噬水平的升高早于关节半月板退变及软骨损伤^[5]。在骨关节炎的早期阶段，自噬可能作为一种避免细胞死亡的适应性反应被激活，而在骨关节炎的晚期，此过程也可以通过细胞凋亡共同激活，作为细胞死亡的替代途径^[6-8]。衰老伴随的自噬水平降低是包括骨关节炎在内的许多退行性疾病的重要发病机制之一^[9-10]。随着年龄增长，软骨细胞的自噬水平是不断下降的^[2]，而自噬水平降低加快了软骨的退行性改变^{[2，5，7-8，11]}。

雷帕霉素可以抑制哺乳动物雷帕霉素受体(mammalian target of rapamycin，mTOR)从而激活自噬。提高软骨细胞自噬水平可以在应激状态下有效保护软骨细胞^[3，12]，药物或基因敲除抑制mTOR从而激活自噬的方法，在骨关节炎动物模型中的治疗作用也是被广泛证实的^[13-17]。但mTOR抑制剂的给药方式、药物剂量及其带来的不良反应，限制了其应用到骨关节炎的临床治疗^[18]。提高软骨细胞自噬水平是骨关节炎很有前景的治疗靶点，新的自噬相关基因和更特异性的治疗靶点仍需深入探索。

跨膜蛋白208(Transmembrane protein 208，TMEM208)是一个自噬抑制基因，可能通过对细胞内质网应激的抑制达到抑制自噬的作用^[19]。内质网能识别并降解未正确折叠的蛋白，内质网应激是指各种原因引起的细胞内质网发生功能紊乱，导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca²⁺平衡紊乱的病理状态^[20]。自噬和内质网应激都是严格调节的细胞过程，在各种生理和病理条件中起着重要作用。有研究表明，内质网应激是自噬的有效诱导剂^[21-22]。跨膜蛋白208基因过表达抑制自噬水平，内质网应激和自噬过程的关键效应物和重要分子的表达降低；相反，跨膜蛋白208基因敲低促进了自噬，内质网应激和自噬过程中关键基因的表达水平增加。总之，跨膜蛋白208可能通过抑制内质网应激而抑制自噬过程^[19]。

研究通过组织学检测，发现晚期骨关节炎患者软骨组织中跨膜蛋白208表达量异常升高；随后通过细胞实验进一步验证，利用白细胞介素1β诱导骨关节炎体外模型，观察应激状态不同时期，软骨细胞跨膜蛋白208的表达量变化及软骨自身状态变化，从而明确跨膜蛋白208在骨关节炎软骨细胞中的变化和作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2016年8月至2018年4月在北京大学第一医院中心实验室进行。

1.3 材料

1.3.1 组织来源取因膝关节骨关节炎行膝关节表面置换患者术中废弃软骨，切取股骨侧和胫骨侧非负重面轻度病变软骨(OuterbridgeⅠ-Ⅱ级)作为早期组，负重面重度病变软骨(OuterbridgeⅢ-Ⅳ级)作为晚期组。实验方案符合北京大学第一医院对研究的相关伦理要求，软骨组织供者及其家属对实验过程完全知情同意，在充分了解治疗方案的前提下签署了“知情同意书”。

1.3.2 细胞来源选取原代人正常关节软骨细胞(ScienCell公司，货号4650)，培养传代至第4代软骨细胞进行实验。

1.3.3 实验用主要试剂及仪器 TMEM208抗体(Abcom，英国)；LC3抗体(Abcom，英国)；P62抗体(Abcom，英国)；IL-1β(Abcom，英国)；雷帕霉素(Sigama Aldrich，美国)；3-MA(Sigama Aldrich，美国)；MitoSOX Red dye染料(碧云天，中国)；JC-1染料(碧云天，中国)；Annexin-V/FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，中国)；Synergy H1全功能酶标仪(BioTek，美国)；INFLUX流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 不同病变程度软骨组织跨膜蛋白208表达量检测收集因膝骨关节炎进行膝关节置换患者的术中废弃软骨，切取股骨侧和胫骨侧非负重面轻度病变软骨作为早期组，负重面重度病变软骨作为晚期组。软骨组织低温状态下粉碎后，加入RIPA裂解液，提取细胞全蛋白。经BCA定量、上样、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育和ECL 显影等步骤，Real Time PCR检测不同软骨组织跨膜蛋白208表达。

1.4.2 软骨细胞的培养和传代培养原代人正常关节软骨细胞，用含体积分数10% FBS的DMEM培养液培养，在体积分数5%CO₂饱和湿度、37 ℃条件下培养，每2 d更换培养液1次，待软骨细胞铺满瓶底的80%至90%后，进行传代培养。培养传代至第4代软骨细胞进行实验。

1.4.3 软骨细胞的药物刺激细胞以1×10⁵/孔铺到24孔板中，铺板24 h，待细胞长到对数生长期，开始加药处理。白细胞介素1β改变软骨细胞状态：将第4代人关节软骨细胞接种在培养瓶中，当细胞汇合接近60%-70%时，更换培养基，加入白细胞介素1β(培养基终浓度为5 μg/L)诱导骨关节炎体外模型，刺激12，24，48 h，观察软骨细胞状态。

自噬调节药物改变软骨细胞自噬水平：将第4代人关节软骨细胞接种在培养瓶中，当细胞汇合接近60%-70%时，更换培养基，加入自噬激活剂雷帕霉素(培养基终浓度 10 nmol/L)或自噬抑制剂3-MA(培养基终浓度2 nmol/L)预处理软骨细胞2 h后，加入白细胞介素1β刺激12，24，48 h，观察软骨细胞状态。

1.4.4 软骨细胞自噬水平的检测收集各组细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞全蛋白。应用Western Blot技术，经BCA定量、上样、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育和ECL 显影等步骤，检测各组细胞内自噬相关蛋白轻链蛋白3B、P62的表达。细胞实验重复3次。

1.4.5 软骨细胞凋亡水平的检测用含0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化液消化细胞使细胞脱落，离心，弃上清，收集沉淀，PBS洗涤3次，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL AnnexinV-FITC 混匀后，加入5 μL Propidium lodide混匀；室温避光，反应5-15 min；流式细胞仪分析(激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm)，测定各组细胞凋亡情况。细胞实验重复3次。

1.4.6 细胞线粒体状态的检测

MitoSOX Red dye检测ROS含量：加入终浓度5 μmol/L MitoSOX，37 ℃避光孵育30 min，洗涤后，利用荧光分光光度计检测细胞MitoSOX荧光强度。激发波长488 nm，发射波长580 nm，所有样品拍摄条件固定。MitoSOX荧光强度反映线粒体超氧化物生成的量。

JC-1染料检测线粒体膜电位：软骨细胞接种在培养瓶中，当细胞汇合接近60%-70%，吸除培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL细胞培养液，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 min。在孵育期间，按照每1 mL JC-1染色缓冲液(5×)加入4 mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1×)，并放置于冰浴。37 ℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次。加入2 mL细胞培养液后，进行流式细胞仪分析。细胞实验重复3次。

1.4.7 Real Time PCR方法测定跨膜蛋白208基因转录水平取第4代软骨细胞，加入1 mL Trizol裂解细胞，加 0.2 mL的氯仿震荡离心，取水相加入0.5 mL的异丙醇，离心弃去上清液，体积分数75%的乙醇清洗后自然干燥沉淀RNA，DEPC水溶解RNA后测量含量及纯度(纯度控制在1.8-2.0)。取Total RNA 1 μg，加入Random Primer Mix 2 μL及Nuclease free H₂O，加至液体总量为8 μL，短暂离心后，放于65 ℃保温5 min，然后冰浴5 min。短暂离心将液体集中于管底，然后再依次加入ProtoScript Ⅱ Reaction Mix(2×)10 μL，ProtoScript ⅡReaction Mix(10×) 2 μL。轻轻混匀后，先在25 ℃保温5 min，然后42 ℃保温1 h，再在80 ℃保温5 min，得到cDNA 20 μL，选择20 μL的反应体系，分别应用跨膜蛋白208以及GAPDH 的上、下游引物(跨膜蛋白208：F 5’-TCT ACC TGC GGA TCA TAC TGG-3’，R 5’-TAG CTG GCC CCA TAC ACT G-3’； GAPDH：F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’)，对反转录的cDNA进行Real Time PCR反应。反应体系为上、下游引物(10 mol/L)各1 μL，模板cDNA 2 μL，dd H₂O 6 μL，SYBR Green10 μL。采用两步法进行PCR反应，反应条件：95 ℃、10 min，1个循环；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，40个循环。反应结束后，采用ABI 7300 Real time PCR软件分析PCR过程，检测样本的Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物荧光信号超过基线值(进入指数增长期)时的循环数。以GAPDH为内参照基因，通过2^-^??Ct法进行相对定量分析。细胞实验结果重复3次。

1.5 主要观察指标 ①骨关节炎体外模型软骨细胞跨膜蛋白208的表达；②骨关节炎体外模型软骨细胞自噬相关蛋白轻链蛋白3B、P62的表达，以及细胞凋亡和线粒体损伤情况；③药物干扰细胞自噬水平时，软骨细胞跨膜蛋白208的表达及细胞状态变化。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.0(IBM SPSS，US)统计软件进行数据处理，多样本均数比较应用单因素方差分析，两样本均数比较应用独立样本t检验(Independent- Samples T Test)。P < 0.05视为差异有显著性意义。计量资料均采用x(_)±s表示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

细胞通过自身物质的调节以适应不断变化的环境条件，这个过程称为稳态维持。其中，蛋白质的降解吸收与重新利用是维持细胞稳态的重要机制。在骨关节炎的发病过程中，衰老、炎症、创伤等多重因素可导致软骨细胞稳态受到影响^[1]。而软骨细胞作为软骨组织中唯一的细胞类型，负责软骨细胞外基质的合成和转换，其健康状态直接影响骨关节炎患者软骨组织的退变程度。

自噬是维持细胞稳态的重要机制^[23]。自噬是一种通过溶酶体途径进行细胞质组分(蛋白质、细胞器)降解的过程，降解产物被用于能量供应及物质合成。同时，自噬也已被认为是维持软骨细胞功能正常的重要机制。自噬不仅可以调节软骨细胞生命周期的最后阶段，还可以调节软骨细胞进入成熟过程的速度^[24]。细胞的自噬水平和机体年龄、局部刺激都有关系。Caramés等^[2]学者在GFP-LC3转基因小鼠中观察软骨组织的自噬变化，与年轻小鼠相比，老年小鼠软骨细胞中自噬体的数量和面积显着减少。有研究发现，在正常软骨表层区域的软骨细胞表达高水平的自噬相关蛋白BECN1，ATG5和MAP1LC3。骨关节炎早期，软骨细胞分解代谢和营养应激增加，软骨细胞的自噬增加，软骨细胞中轻链蛋白3B和Beclin-1的表达增加^[2⁵^]。瞬时增加的自噬是对细胞应激的代偿性反应，但长时间的应激会导致软骨细胞发生损伤，导致软骨细胞骨关节炎相关基因表达增加及软骨细胞凋亡^[2⁶^]。在此次研究中，采用白细胞介素1β刺激人正常关节软骨细胞12 h后，软骨细胞自噬水平较空白对照组有明显提升，随刺激时间延长，白细胞介素1β刺激24 h和48 h后，软骨细胞自噬水平呈逐渐下降趋势。所选取的3个作用时间点，较准确地模拟了病变早期、中期、晚期骨关节炎软骨细胞的状态。结果发现软骨细胞接受应激刺激的早期，虽然自噬水平相比无应激时代偿性升高，但软骨细胞凋亡相关基因、线粒体损伤程度、细胞内活性氧水平均较无应激细胞明显升高。所以认为，对于软骨细胞受到的应激性刺激，自噬只能对软骨细胞产生代偿性的保护作用，而不是完全性的保护作用。

通过遗传或药理学干预抑制mTOR信号通路来增强自噬可延长寿命^[2⁷^]。mTOR在骨关节炎治疗中，也被发现有明确作用。有研究发现，在膝骨关节模型小鼠中，雷帕霉素治疗可降低小鼠软骨退变、维持软骨细胞性并降低关节软骨中ADAMTS-5和白细胞介素1β的表达^[¹⁴^]。此次研究发现，应用雷帕霉素预处理的软骨细胞在接受白细胞介素1β刺激时，表现出较低的细胞凋亡及骨关节炎相关病变。说明通过药物提高自噬水平的确可以维持应激状态下细胞的稳态水平。虽然mTOR是预防和治疗骨关节炎的很有前景的靶点，但系统应用mTOR抑制剂可能出现体质量减轻、皮疹、伤口愈合延迟或戒断反应等副作用^[1⁸^]，局部应用雷帕霉素对骨关节炎的治疗有效，但安全性尚有待证明。

跨膜蛋白208是一个自噬抑制基因，作者发现跨膜蛋白208在晚期骨关节炎患者软骨组织中表达异常升高，软骨细胞实验证明跨膜蛋白208在接受应激刺激的软骨细胞中表达早期下降晚期升高。说明跨膜蛋白208在骨关节炎发病过程中，调节这软骨细胞自噬水平的变化。雷帕霉素可使跨膜蛋白208表达下降而自噬水平升高，3-MA可使跨膜蛋白208表达升高而自噬水平下降。

作者猜想，跨膜蛋白208是一个在mTOR下游的受mTOR信号调控的自噬抑制基因，是在骨关节炎发病过程中调节软骨细胞自噬水平的重要基因，可能是软骨细胞自噬水平调节的新靶点。对于跨膜蛋白208调节软骨细胞自噬水平的机制，还需要更深入的研究。

此次研究尚存一些不足之处：①研究选取轻链蛋白3B和P62作为自噬水平的评估指标，未能全面评估自噬的具体情况，需进一步研究；②研究在药物刺激实验中，仅选取单一浓度进行实验，未能评估多浓度梯度软骨细胞状态。

综上所述，研究发现自噬抑制基因跨膜蛋白208在晚期骨关节炎患者软骨组织中表达异常升高，细胞实验证明，软骨细胞受到应激刺激时，跨膜蛋白208表达早期下降，晚期升高，细胞自噬水平早期升高，晚期下降。跨膜蛋白208是软骨细胞的自噬抑制基因，是骨关节炎病变过程中控制软骨细胞自噬水平的重要基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

跨膜蛋白208可影响人软骨细胞的自噬和线粒体功能

Transmembrane protein 208 affects autophagy and mitochondrial function in chondrocytes

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