骨关节炎是一种非炎性滑膜关节退行性疾病，其特点主要以关节软骨退化丢失、软骨下骨硬化、囊性变以及骨赘形成为主^[1]，影响关节正常功能，降低患者生活质量，严重时可致残疾，是影响中老年人健康最常见的关节疾患之一^[2]。作为一种常见高致病率退行性疾病，骨关节炎最常见的症状为关节疼痛，常起于晨间，活动后略有减轻，但活动过多又会引起疼痛难耐，反复发作令患者痛不欲生。另一症状是关节僵硬，通常发生在早晨起床时或者白天长时间保持某种体位时。当检查受影响关节时可发现关节肿胀、肥大，局部有压痛，并且当关节活动时可有摩擦感，严重者可出现肌肉萎缩和关节畸形等并发症。骨关节炎可涉及身体的所有关节，通常侵犯身体承重关节如髋关节、膝关节和脊柱(如颈椎和腰椎)，亦可累及手足指(趾)间关节，严重影响患者的身体健康与生活质量。中国流行病学调查研究显示，国内骨关节炎的患病率约为18%，总体致残率为2%-6%^[3]。随着年龄的增长，骨关节炎患病率增长迅速^[4]。中国老年人残疾致病因素中，因骨关节炎引起的残疾仅次于心血管疾病^[5]。骨关节炎的发病机制复杂，难以用单一因素解释。因此探讨骨关节炎的发病原因及机制，寻找预防及治疗骨关节炎的有效方法显得尤为重要。

骨关节炎的病理变化大多都伴随着因细胞外基质合成与降解失衡而引起的软骨破坏^[6]。基质金属蛋白酶是一组能够降解细胞外基质蛋白并且具有同源性结构的内肽酶总称，在软骨破坏过程中起着至关重要的作用，直接参与骨关节炎的进程^[7]。基质金属蛋白酶3由软骨细胞、滑膜细胞分泌，是基质金属蛋白酶家族重要成员之一，其不仅能降解细胞外基质中多种基质蛋白底物如细胞外蛋白多糖、Ⅸ型胶原等，更为重要的是作为激活基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的关键酶，可产生级联放大效应，加速软骨破坏^[8]，从而推动骨关节炎的进程。半乳糖凝集素3是半乳糖凝集素家族的一员，在正常组织和肿瘤组织都有表达，并参与机体的多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞黏附及新生血管形成和肿瘤侵袭与转移等^[9]。有学者通过向小鼠关节腔注射高浓度的半乳糖凝集素3，发现小鼠的关节软骨及软骨下骨都有不同程度的破坏，这说明半乳糖凝集素3在骨关节炎的发展过程中可能起重要的作用。几乎所有的半乳糖凝集素都至少含有一个在C端的糖识别域，而半乳糖凝集素3却是唯一一个拥有与富含络氨酸、甘氨酸和脯氨酸N-端结构域连接的独特糖识别域，基质金属蛋白酶同样拥有此类结构，如此相似的结构使得半乳糖凝集素3成为基质金属蛋白酶的作用底物^[10]，两者共同作用于人体多种生理及病理过程。许多研究表明，半乳糖凝集素3与基质金属蛋白酶1，2，9在多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌中的表达呈正相关，它们共同参与肿瘤疾病的发展^[11]，提示半乳糖凝集素3与基质金属蛋白酶家族关系紧密。但作者通过查阅大量文献资料未发现半乳糖凝集素3与基质金属蛋白酶3如何相互作用的研究，因此提供了一个新的思路。

在骨关节炎早期阶段，滑膜组织的增生、纤维化，以及基质金属蛋白酶、炎症递质的释放是其致病的主要因素^[12]，随着骨关节炎的进一步发展，滑膜炎症及病变也一直贯穿在其病理过程中。因此，研究骨关节炎患者关节滑膜的改变也同样重要。于是作者试图通过观察骨关节炎患者滑膜中基质金属蛋白酶3与半乳糖凝集素3的表达变化，研究二者在骨关节炎中的作用以及相互关系，从而进一步了解骨关节炎的发展过程。 

1  对象和方法  Subjects and methods

1.1  设计  对比观察实验。

1.2  时间及地点  于2017年9月至2018年9月在石河子大学医学院第一附属医院骨科中心关节外科及病理科完成。

1.3  对象  研究对象均选自2017年9月至2018年9月在石河子大学医学院第一附属医院骨科中心关节外科住院的患者，标本取自手术过程中常规切除的滑膜组织。研究对象分组：骨关节炎观察组共60例，取自膝关节置换或关节镜诊治术患者，均符合2007年版《骨关节炎诊治指南》诊断标准^[13]；非骨关节炎对照组共20例，取自截肢术健康患者或急性损伤导致的半月板或膝关节韧带损伤行关节镜诊治术患者。按西安大略和麦克马斯特大学(Western Ontario and McMaster University，WOMAC)骨关节炎指数将骨关节炎观察组分为轻度、中度、重度3组，每组20例。在手术过程中收集患者切除的滑膜标本，立即放入液氮罐保存，后置于-80 ℃冰箱中保存待用。所有供者均对试验过程知情同意，试验方案得到石河子大学医学院第一附属医院的伦理批准。

1.4  实验方法

1.4.1  抗体  一抗Anti-MMP-3抗体、Anti-Galectin-3抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司)，二抗HRP标记山羊抗兔(武汉阿斯本生物技术有限公司)。

1.4.2  病理石蜡切片的制作  ①取材：选取合适的滑膜组织于40 g/L多聚甲醛固定24 h以上。将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀修整目的部位组织，将修切好的组织和与之对应的标签放于脱水盒内；②脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度乙醇进行脱水。体积分数75%乙醇4 h→体积分数85%乙醇2 h→体积分数90%乙醇2 h→体积分数95%乙醇1 h→无水乙醇Ⅰ 30 min→无水乙醇Ⅱ 30 min→醇苯5-10 min→二甲苯Ⅰ 5-10 min→二甲苯Ⅱ5-10 min→蜡Ⅰ 1 h→蜡Ⅱ 1 h→蜡Ⅲ 1 h；③包埋：将浸好蜡的组织置于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20 ℃冰箱冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；④切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4 μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上，待组织展平后用载玻片将组织捞起，放进60 ℃烘箱内烤片。

1.4.3  苏木精-伊红染色  ①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→无水乙醇Ⅰ10 min→无水乙醇Ⅱ10 min→体积分数95%乙醇5 min→体积分数90%乙醇5 min→体积分数80%乙醇5 min→体积分数70%乙醇5 min→蒸馏水洗；②苏木精染细胞核：切片入Harris苏木精染3-8 min，自来水洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；③伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3 min；④脱水封固：将切片依次放入体积分数95%乙醇Ⅰ 5 min→95%乙醇Ⅱ    5 min→无水乙醇Ⅰ5 min→无水乙醇Ⅱ5 min→二甲苯Ⅰ  5 min→二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封固。

1.4.4  MMP-3和Galectin-3免疫组化染色  ①石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脱蜡至水，用PBS洗3次，每次    5 min；②切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10 min后低火至沸；③自然冷却后再次使用PBS洗3次，每次5 min；④将切片置于3%过氧化氢溶液中，在室温下避光孵育10 min；⑤PBS洗3次，每次5 min，甩干后5%BSA封闭20 min；⑥去除BSA液，每张切片加入约  50 μL稀释的一抗覆盖组织，4 ℃过夜；⑦PBS洗3次，每次5 min。去除PBS，每张切片加50-100 μL相应种属的二抗，37 ℃孵育50 min；⑧PBS洗3次，每次5 min。去除PBS，每张切片加50-100 μL新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色。显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化(约1 s)，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；⑨组织切片置于体积分数75%，90%，100%，100%梯度乙醇中，各10 min，脱水干燥后二甲苯透明，自然晾干后使用中性树胶封固，加盖玻片。

1.5  主要观察指标  

1.5.1  WOMAC骨关节炎指数  是由Bellamy于1988年首先提出，该评分根据相关症状和体征来评价膝关节炎的严重程度及治疗效果^[14]，主要根据疼痛、僵硬和关节功能3个方面，又细分为24个评价指标，总分240分。WOMAC骨关节炎指数越高表示骨关节炎严重程度越重，根据总积分评估骨关节炎的轻重程度：轻度<80分，重度80-120分，重度>120分。

1.5.2  滑膜炎病理评分  从滑膜衬里层增生程度、衬里下层炎症程度及血管生成情况3个方面来评估滑膜炎程度^[15]。衬里层增生评分：低于3层为0分，3-4层为1分，5-6层为2分，超过6层为3分；炎症程度评分：没有炎症细胞浸润为0分，炎症细胞呈散在分布为1分，弥漫分布为2分，形成生发中心或淋巴滤泡为3分；血管生成评分：没有新生血管为0分，轻度新生血管生成为1分，中度为2分，重度为3分。上述3项评分相加总和即为病理学总评分，总分0-1分为正常，炎症级别为0；总分2-3分为轻度滑膜炎，炎症级别为1；总分4-6分为中度滑膜炎，炎症级别为2；总分7-9分为重度滑膜炎，炎症级别为3。   

1.5.3  免疫组化染色结果判定  使用半定量积分法分别对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色强度进行分级记分^[16]，根据两者乘积确定基质金属蛋白酶3及半乳糖凝集素3蛋白的表达强度。阳性细胞率即阳性细胞占总细胞数的比例，每张切片以计数10个40×10倍视野细胞为准进行观察，根据切片上阳性细胞数量的不同分级：未着色细胞或仅有< 10%细胞着色，计为0分；阳性细胞数10%-25%，计为1分；阳性细胞数25%-50%，计为2分；阳性细胞数50%-75%，计为3分；阳性细胞数75%- 100%，计为4分。按染色强度评分：未着色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。表达强度评分：阴性(-)0分，弱阳性(+)1-4分，中度阳性(++)5-8，强阳性(+++)9-12分。病理切片阅片均采用双盲法，由石河子大学医学院第一附属医院病理科2名经验丰富的病理医师进行独立阅片，根据免疫组化染色评判标准进行评定表达情况。

1.6  统计学分析  实验结果采用SPSS 22.0统计软件处理，所有计量资料均采用x(_)±s表示，计量资料用方差分析进行统计学分析，计数资料用连续校正卡方检验进行统计学分析，指标间相关性采用Pearson相关分析，统计结果均以P < 0.05为差异有显著性意义。

骨关节炎是常发生于中老年人群的一种慢性退行性关节疾病，确切的病因和发病机制目前尚不清楚，多种因素与骨关节炎的发生有关，比如年龄、肥胖、劳损、创伤等，在这些因素的共同作用下造成了骨关节炎。在疾病的早期阶段，患者关节常发生慢性的轻度滑膜炎，继而发生关节软骨退行性变、关节边缘骨赘形成和软骨下骨反应性增生。虽然并非所有的骨关节炎发病都与滑膜炎有关，但慢性滑膜炎的发生可能是促使骨关节炎进行性加重的关键环节^[17-18]。  

大多数骨关节炎都与软骨破坏有关，细胞外基质合成和降解失衡则是造成软骨退化的主要原因之一。基质金属蛋白酶作为细胞外基质降解过程中必不可少的酶类，与软骨破坏关系密切。研究表明，软骨细胞分泌的蛋白多糖等物质作为细胞的支撑力量在正常情况下会被基质金属蛋白酶平衡降解，但是如果软骨受损，将会分泌大量的基质金属蛋白酶，导致上述分泌和降解平衡被打破，从而加速软骨的破坏^[19]。基质金属蛋白酶3作为基质金属蛋白酶家族中的重要一员，在软骨破坏过程中有着激活家族其他成员并产生级联放大效应的作用，其次由骨关节炎软骨损伤部位的代谢产物堆积产生的酸性环境更有利于基质金属蛋白酶3降解软骨。李龙滕等^[20]通过实验发现，骨关节炎患者关节软骨体外培养液中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13均存在分泌，且以基质金属蛋白酶3的分泌量最高，表明基质金属蛋白酶3可能是导致骨关节炎关节软骨退化的最主要细胞因子之一。朱新辉等^[21]通过研究骨关节炎患者血液和滑液中基质金属蛋白酶3表达水平发现，基质金属蛋白酶3水平与骨关节炎病变严重程度(Kellgren-Lawrence分级)呈正相关，且血液基质金属蛋白酶3水平与滑液基质金属蛋白酶3水平呈正相关，提示基质金属蛋白酶3可作为骨关节炎病变严重程度的生物标记。刘琳琳等^[22]发现在骨性关节早期患者关节液中基质金属蛋白酶3含量显著升高，基质金属蛋白酶3表达与早期骨关节炎患者HSS评分呈负相关，与K-L分级呈正相关。此次研究结果与上述文献报道基本一致。在正常关节滑膜中呈低水平表达，而在骨关节炎患者滑膜中却显著增高，随着骨关节炎病情加重而基质金属蛋白酶3表达随之增强，提示在骨关节炎患者的软骨退变和滑膜增生中基质金属蛋白酶3都起着重要作用。

大部分哺乳动物细胞通过分泌各种细胞黏附分子与周围包绕的细胞外基质结合。半乳糖凝集素3通过与层黏蛋白、Mac-2 结合蛋白、IgE等结合，活动于细胞表面和细胞外环境。层黏蛋白是细胞主要的基底膜蛋白，其通过与整合素、非整合素层黏结合蛋白结合，从而调节细胞的各种生理功能。半乳糖凝集素3则是一种非整合素层黏结合蛋白，其参与调节生物信号的传导主要途径是通过改变整合素的表达及与基质的黏附，进一步参与相关生理活动，如胚胎发育、炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖、伤口愈合、肿瘤生长和转移等^[23]。Janelle-Montcalm等^[24]向大鼠膝关节腔内注射了大剂量的半乳糖凝集素3，几周后发现大鼠膝关节的软骨及软骨下骨发生了不同程度的退化及破坏，说明高水平的半乳糖凝集素3同样可以造成关节软骨及软骨下骨的破坏。此次实验结果显示骨关节炎观察组滑膜中半乳糖凝集素3的表达显著高于非骨关节炎对照组，半乳糖凝集素3的表达强度与骨关节炎严重程度相符，也同样支持上述的研究结论，提示半乳糖凝集素3同样参与骨关节炎滑膜炎的发展过程。在其进一步的骨关节炎软骨细胞体外培养实验中表明，高浓度的半乳糖凝集素3培养液引起了基质金属蛋白酶3的大量表达，而在低浓度的半乳糖凝集素3培养液中，基质金属蛋白酶3几乎不表达，实验表明在骨关节炎软骨细胞中，半乳糖凝集素3可诱导基质金属蛋白酶3的生成，而基质金属蛋白酶3是软骨中蛋白多糖降解的关键酶，进一步促进了骨关节炎的进程。半乳糖凝集素3虽然存在于细胞质、细胞核和细胞表面，但它也分泌到细胞外基质中，与细胞外基质蛋白层黏蛋白、纤维连接蛋白和IV型胶原结合，大量的半乳糖凝集素3分泌会引起包括基质金属蛋白酶3在内的基质金属蛋白酶过度产生，从而造成细胞外基质合成和降解失衡，加速软骨的破坏，这可能是半乳糖凝集素3与基质金属蛋白酶3相互作用造成软骨破坏的一个机制，后期作者会通过进一步实验验证这一猜想。
该实验结果发现，在少数患有重度骨关节炎患者的滑膜存在基质金属蛋白酶3/半乳糖凝集素3表达量减少甚至低于非骨关节炎对照组，考虑为骨关节炎重度患者滑膜组织增生严重、滑膜细胞分泌功能下降导致基质金属蛋白酶3/半乳糖凝集素3分泌减少。同时实验还发现部分非骨关节炎对照组滑膜组织基质金属蛋白酶3/半乳糖凝集素3也存在高表达，这可能是由于半月板或膝关节韧带损伤引起的滑膜炎症反应引起，对实验结果可能存在一定的影响，但同样间接反映了骨关节炎早期滑膜组织中 基质金属蛋白酶3/半乳糖凝集素3蛋白表达的情况。
此次实验证实，在骨关节炎滑膜组织中基质金属蛋白酶3及半乳糖凝集素3均呈高表达状态，且与骨关节炎严重程度呈显著正相关关系，通过整理实验数据行Pearson相关分析后显示基质金属蛋白酶3与半乳糖凝集素3的表达同样呈显著正相关关系，提示在骨关节炎病变过程中基质金属蛋白酶3及半乳糖凝集素3均发挥着重要的作用，这为治疗骨关节炎提供了更多新的思路及方向，临床上可基于其表达水平来选择相关药物及治疗方案，为预防和治疗骨关节炎及相关疾病提供新的理论与实验依据，但是由于基质金属蛋白酶3与半乳糖凝集素3的作用机制涉及多种细胞因子共同参与，关于两者之间的详细作用机制还有待于进一步研究。

大多数骨关节炎都与软骨破坏有关，细胞外基质合成和降解失衡则是造成软骨退化的主要原因之一。基质金属蛋白酶作为细胞外基质降解过程中必不可少的酶类，与软骨破坏关系密切。研究表明，软骨细胞分泌的蛋白多糖等物质作为细胞的支撑力量在正常情况下会被基质金属蛋白酶平衡降解，但是如果软骨受损，将会分泌大量的基质金属蛋白酶，导致上述分泌和降解平衡被打破，从而加速软骨的破坏。#br# #br#