miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1173

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (15): 2397-2402.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1173

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miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用

邓贵营1，2，曾高峰3，岑忠喜1，高云兵1，曹百川1，黄建华1，宗少晖1

(1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西生物医药协同创新中心，广西医科大学，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2018-12-24 出版日期:2019-05-28 发布日期:2019-05-28
通讯作者: 宗少晖，教授，主任医师，博士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021 并列通讯作者：曾高峰，教授，博士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市530021
作者简介:邓贵营，男，1991年生，广西壮族自治区钦州市人，壮族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81560351)，项目负责人：宗少晖；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助，项目负责人：宗少晖

Effect of miRNA-136-5p on inflammatory factors in rat models of acute spinal cord injury

Deng Guiying1, 2, Zeng Gaofeng3, Cen Zhongxi1, Gao Yunbing1, Cao Baichuan1, Huang Jianhua1, Zong Shaohui1

(1Department of Spinal Osteopathy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2018-12-24 Online:2019-05-28 Published:2019-05-28
Contact: Zong Shaohui, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spinal Osteopathy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Zeng Gaofeng, Professor, Doctoral supervisor, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Deng Guiying, Master candidate, Department of Spinal Osteopathy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560351 (to ZSH); the Innovation Team and Excellence Scholar Program Guangxi Universities (to ZSH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
MicroRNAs(miRNAs)：是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长20-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
NF-κB：是真核细胞的转录因子，几乎存在于所有细胞中。在脊髓组织中，NF-κB主要存在于神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中。

摘要
背景：miRNA-136-5p对脊髓损伤后病理改变、炎症反应和再生修复产生重要的调节作用。
目的：观察miRNA-136-5p对大鼠脊髓损伤后血清细胞炎性因子、脊髓组织NF-κB蛋白的影响，探讨其作用分子机制。
方法：SPF级雄性SD大鼠36只，购买于广西医科大学动物实验中心。制备慢病毒载体系统转染脊髓损伤大鼠。改良Allen’s法成功建立36只大鼠脊髓损伤模型，对大鼠进行Basso Beattie Brenham(BBB)评分，随机分成正常对照组、模型组(LV-ctrl +脊髓损伤组)、过表达组(脊髓损伤+ LV- miRNA-136-5p)、抑制组(脊髓损伤+LV-sponge抑制组)，每组9只。手术前7 d及手术当天过表达组、抑制组在损伤区连续注射慢病毒悬液，正常对照组、模型组注射等量生理盐水。各组在第1，3，7天分别处死3只大鼠，取血、脊髓组织。ELISA测定大鼠血清白细胞介素1β，白细胞介素6和干扰素α表达水平；Western Blot和双重免疫荧光检测NF-κB蛋白的表达。
结果与结论：①术前BBB评分结果无显著差异(P > 0.05)；脊髓损伤模型组大鼠活动表现为俯卧位缓慢行走，出现不同程度的尿潴留，双后肢的运动、感觉功能完全丧失，肌肉力量为0，出现脊髓休克；②与正常对照组相比，其他3组炎症因子水平均有升高(P < 0.05)，过表达组各种炎症因子水平升高更加明显；各组炎症因子水平分别按过表达组、模型组、抑制组顺序逐渐递减；③Western Blot、双重免疫荧光检测NF-κB蛋白表达水平，模型组、过表达组、抑制组均高于正常对照组(P < 0.05)，其中过表达组表达水平最高；④结果提示，miRNA-136-5p对急性脊髓损伤大鼠炎症因子、NF-κB可产生影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1079-9939(邓贵营)

关键词: miRNA-136-5p, 脊髓损伤, NF-κB, 炎症因子

Abstract:

BACKGROUND: miRNA-136-5p plays a crucial regulatory role in pathological changes, inflammatory response and regeneration after spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of miRNA-136-5p on the expression of cytokines in serum and NF-κB protein in spinal cord in rats with spinal cord injury and to explore the molecular mechanism.
METHODS: Thirty-six male Sprague-Dawley rats, of SPF grade were provided by Laboratory Animal Center of Guangxi Medical University. The lentiviral vector system was prepared and transfected into spinal cord injured rats. Thirty-six rat models of spinal cord injury were established by modified Allen’s method. Basso Beattie Bresnahan scores were performed. Rats were randomly divided into normal control, modeling (LV-ctrl plus spinal cord injury), overexpression (spinal cord injury plus LV-miRNA-136-5p), and inhibition (spinal cord injury plus LV-sponge) groups (n=9/group). Seven days before surgery and the day of surgery, the overexpression and inhibition groups were continuously injected with the lentivirus suspension into the injured area, and the normal control and modeling groups were injected with the same amount of normal saline. Three rats were sacrificed at 1, 3 and 7 days, and blood and spinal cord tissues were taken. The levels of interleukin-1β, interleukion-6 and interferon-α in rat serum were determined by ELISA. The expression of NF-κB protein was detected by western blot assay and double immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was no significant difference in preoperative Basso Beattie Bresnahan scores (P > 0.05). In the modeling group, the rats showed prone walking, vary degrees of urinary retention, and spinal shock, with complete loss of function of both hind limbs and muscle strength of 0. (2) Compared with the normal control group, the levels of inflammatory factors in the other groups were increased significantly (P < 0.05). The expression levels of inflammatory factors were highest in the overexpression group, followed by modeling group, and lowest in the inhibition group. (3) Results of western blot assay and double immunofluorescence showed that the expression level of NF-κB protein in the modeling, overexpression and inhibition groups was significantly higher than that in the normal control group (P < 0.05), and the level was highest in the overexpression group. (4) In summary, miRNA-136-5p can affect inflammatory factors and NF-κB in rats with acute spinal cord injury.

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Key words: MicroRNAs, Spinal Cord Injuries, NF-kappa B, Tissue Engineering

中图分类号:

R446，R318

邓贵营, 曾高峰, 岑忠喜, 高云兵, 曹百川, 黄建华, 宗少晖. miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2397-2402.

Deng Guiying, Zeng Gaofeng, Cen Zhongxi, Gao Yunbing, Cao Baichuan, Huang Jianhua, Zong Shaohui. Effect of miRNA-136-5p on inflammatory factors in rat models of acute spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(15): 2397-2402.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 一般情况实验自制改良Allen’s法建立大鼠脊髓损伤模型，即10 g克氏针从3 cm高度自由落下，击中硬膜囊，导致脊髓T₁₀段受到冲击伤害。造模术后，冲击部位出现水肿、充血，颜色暗红；模型组与正常组相比，出现了下肢瘫痪和尿潴留等表现，并伴有饮食、活动减少。

2.3 脊髓功能BBB评分术前和术后第1天在平坦表面上观察大鼠受损脊髓节段下的身体和肢体的运动。结果显示：术前BBB评分结果差异无显著性意义(P > 0.05)。在脊髓损伤模型组中，双后肢的功能完全丧失，肌肉力量为0，在俯卧位行走，均显示尿潴留，并出现脊髓休克。BBB评分显著低于正常组(P < 0.05)，见表1。因此，大鼠脊髓损伤后立即BBB行为评分为0，这是手术成功的重要指标。

2.4 Elisa检测细胞因子水平表2-4结果显示，脊髓损伤后第1天，与模型组相比，过表达组、抑制组表达的炎症因子增多(P < 0.05)。第7天，各种炎症因子水平异常高，达到显著水平。这表明miRNA-136-5P可显著提高动物模型中炎症反应的水平，调节脊髓损伤后炎症反应。

2.5 各组脊髓组织NF-κB蛋白的表达图1结果显示，过表达组NF-κB蛋白表达量高于正常对照组，模型组和抑制组(P < 0.05)。同时，抑制组蛋白表达量低于模型组(P < 0.05)。在同一组的不同时间点，在脊髓损伤后第1天和第3天有蛋白质水平上调的迹象。推测NF-κB可能在脊髓损伤炎症反应期间以表达量累积。

2.6 双重免疫荧光染色图2结果显示，与正常对照组相比，脊髓损伤组织的炎症细胞浸润和NF-κB蛋白的表达显著增加(P < 0.05)。对于抑制组大鼠，炎性细胞浸润和NF-κB表达显著降低(P < 0.05)。结果提示miR-136-5p可以在脊髓损伤后上调p-NF-κB的表达，加重炎症细胞的浸润。

参考文献

[1] 杨俊松,郝定均,刘团江,等.急性脊髓损伤的临床治疗进展[J].中国脊柱脊髓杂志,2018,28(4):368-373.

[2] Böthig R, Fiebag K, Thietje R,et al. Morbidity of urinary tract infection after urodynamic examination of hospitalized SCI patients: the impact of bladder management. Spinal cord. 2013;51(1):70-73.

[3] 梁锦前,沈建雄,邱贵兴.干细胞移植修复脊髓损伤的研究进展[J].中国脊柱脊髓杂志, 2008, 18(6): 475478．

[4] Kwon BK,Dyomk MF,Fisher CG,et al.Spinal cord injury regene rative strategies and obstacles.Curr 0pin 0rthop.2004;15(3): 196-201．

[5] Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, et al. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature.2011;474(7350): 212-215.

[6] van Solingen C, Seghers L, Bijkerk R,et al. Antagomir- mediated silencing of endothelial cell specific microRNA-126 impairs ischemia-induced angiogenesis. J Cell Mol Med. 2009;13(8A):1577-1585.

[7] Ma X,Zhou J,Zhong Y,et al.Expression, regulation and function of microRNAs in multiple sclerosis.Int J Med Sci. 2014;11(8):810-818.

[8] Ksiazekwiniarek DJ, Kacperska MJ, Glabinski A.MicroRNAs as Novel Regulators of Neuroinflammation. Mediators Inflamm 2013;2013:519-530.

[9] Lee HK,Bier A, Cazacu S, et al.MicroRNA-145 is downregulated in glial tumorsand and regulates glioma cell migration by targeting connective tissue growth factor. Plos One.2013;8:e54652.

[10] Wang XH, Wang TL.MicroRNAs of microglia: Wrestling with central nervous system disease.Neural Regen Res. 2018; 13(12):2067-2072.

[11] Nishida N, Nagahara M, Sato T, et al. Microarray analysis of colorectal cancer stromal tissue reveals upregulation of two oncogenic miRNA clusters. Clin Cancer Res. 2012;18(11): 3054-3070.

[12] Visone R, Russo L, Pallante P,et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.Endocrine-Related Cancer. 2007; 14(3): 791-798.

[13] Chen HY, Lin YM, Chung HC, et al. miR-103/107 promote metastasis of colorectal cancer by targeting the metastasis suppressors DAPK and KLF4. Cancer Res. 2012;72(14): 3631-3641.

[14] Schulte LN, Westermann AJ, Vogel J. Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing. Nucleic Acids Res. 2013;41(1): 542-553.

[15] Psathas JN, Doonan PJ, Raman P, et al. The Myc-miR-1792 axis amplifies B-cell receptor signaling via inhibition of ITIM proteins: a novel lymphomagenic feed-forward loop. Blood. 2013; 122(26): 4220-4229.

[16] Zardo G, Ciolfi A, Vian L, et al. Polycombs and microRNA-223 regulate human granulopoiesis by transcriptional control of target gene expression. Blood. 2012; 119(17): 4034-4046.

[17] Siddle KJ, Deschamps M, Tailleux L, et al. A genomic portrait of the genetic architecture and regulatory impact of microRNA expression in response to infection. Genome research. 2014; 24(5): 850-859.

[18] 程素利,徐家淳,王剑歌,等.急性脊髓损伤大鼠Allen's造模方法的改良及行为学评价[J].四川中医,2015,33(10):43-45.

[19] Kozomara A, Griffiths-Jones S. mi RBase: integrating micro RNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Res.2011;39(Database issue): D152-157.

[20] Zhou X, Jeker LT, Fife BT. Selective mi RNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 2008; 205(9): 1983-1991.

[21] Bak M, Silahtaroglu A, Møller M, et al. MicroRNA expression in the adult mouse central nervous system.RNA (New York, N.Y.).2008;14(3): 432-444.

[22] Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell. 2004; 116(2):281-297.

[23] Pauley KM,Cha S,Chan EK.MicroRNA in autoimmunity and autoimmune diseases.(New York, N.Y.)J Autoimmun.2009; 32(3-4):189-194.

[24] 杨俊娜,何丽,徐陶,等.miR-124在神经系统发育、损伤及修复中作用的研究进展[J].山东医药,2018,58(20):100-103.

[25] 田密,丁宇,侯德仁,等.实时荧光定量PCR检测转基因阿尔茨海默病小鼠脑组织中miRNAs的差异表达[J].南方医科大学学报, 2013,33(2):262-266.

[26] 孔程程,杨文平,华建,等.血清miRNA-181a在帕金森病中神经保护作用及机制分析[J].南京医科大学学报(自然科学版), 2017, 37(9):1081-1085.

[27] Shi XZ,Zong SH,He JC,et al. miR-136-5p effect on A20 expression in interleukin-17-stimulated astrocytes. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(16):2587-2592.

[28] Bortolotto V, Grilli M.Novel insights into the role of NF-κB p50 in astrocyte-mediated fate specification of adult neural progenitor cells.Neural Regen Res. 2017;12(3):354-357.

[29] Strickland ER, Hook MA, Balaraman S, et al.MicroRNA dysregulation following spinal cord contusion: implications for neural plasticity and repair. Neuroscience. 2011;186:146-160.

[30] Aoki E,Yano R,Yokoyama H,et al.Role of nuclear transcription factor kappa B (NF-kappaB) for MPTP-induced apoptosis in nigral neurons of mice. Experimental and Molecular Pathlogy 2009;86:57-64.

[31] Ahn KS, Sethi G, Aggarwal BB: Nuclear factor-kappa B: from clone to clinic. Current Mol Med 2007;7:619-637

[32] Sohn KH, Jo JM, Cho WJ, et al. Bojesodok-eum, a herbal prescription, ameliorates acute inflammation in association with the inhibition of NF-κB-mediated nitric oxide and proinflammatory cytokine production.Evid-Based Complement Alternat Med. 2012: 457370.

[33] Cortez M, Carmo LS, Rogero MM, et al. A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells.Inflammation.2013;36: 379−386.

[34] Jobin C, Sartor RB. NF-κB signaling proteins as therapeutic targets for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 2000; 6: 206−213.

[35] He J, Zhao J, Peng X,et al. Molecular Mechanism of MiR-136-5p Targeting NF-κB/A20 in the IL-17-Mediated Inflammatory Response after Spinal Cord Injury. Cell Physiol Biochem. 2017;44(3):1224-1241.

引言

脊髓损伤引起原发性脊髓组织坏死、细胞溶解及继发性损害，对中枢神经系统造成严重影响，降低患者的生活质量。临床表现为损伤面以下的运动感觉功能、括约肌功能完全或不完全丧失^[1-2]。脊髓损伤发生后，会出现病理生理过程复杂多变，包括组织缺血性水肿、局部免疫炎症反应、神经元大量坏死等微环境的改变。在临床治疗中脊髓损伤常用手术和药物联合使用的治疗方法，目的是减少继发性损伤，促进神经恢复和再生^[3-5]。然而，到目前为止，没有一种方法在脊髓损伤的治疗上取得显著疗效。

微小RNA(miRNA)通过与互补mRNA序列的3'非翻译区(3'-UTR)结合来调节转录后mRNA表达，导致翻译抑制和基因沉默^[6]。数以千计的人类蛋白质的转录、翻译等编码基因过程受miRNA的严格调控，扮演许多重要生物过程的“主要调节因子”。据文献报道，miRNA在调节细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应、自身免疫性疾病和癌症的诱导中起一定作用^[7-10]。序列分析表明超过1/3的人类基因受miRNA直接调节，如miR-106b-25，miR-221，miR-103，miR-17-92a，miR-222等逐渐成为研究的热点，甚至已成为癌症诊断和预后评估的标志之一^[11-13]。研究发现，miR-223，miR-181a，miR-146，miR-1792，miR-155和miR-326在炎症性疾病和致命性自身免疫性疾病的调节中发挥重要作用^[14-17]。

课题组在前阶段使用白细胞介素17刺激星形胶质细胞瘤，实时荧光定量对3种miRNA的分析显示，与DMEM或正常组相比，这些miRNA在体内和体外均显示更高水平表达。通过电转染技术将miRNA模拟物(miR-29b-3p，miR-136-5p和miR-153-3p)和NC模拟物(阴性对照)转染大鼠星形胶质细胞和SD大鼠，通过Western blot进行分析，与对照miRNA模拟物(miR-NC)相比，转染miRNA模拟物(miR-29b-3p，miR-136-5p和miR-153-3p)的星形胶质细胞中A20蛋白水平显著降低，特别是 miR-136-5p更加明显。荧光素酶报告分析显示，与miR-NC组相比，miR 29b-3p，miR-136-5p和miR-153-3p组中pGL3-启动子/ WT A20的荧光素酶活性被显著抑制。鉴于锌指蛋白A20为NF-κB信号通路下游基因，为NF-κB依赖性表达，当NF-κB大量激活，A20能通过与IKK复合体结合，被IKKβ磷酸化，阻止IκB被磷酸化，抑制NF-κB的进一步活化，发挥反馈性调节作用，最终起到抑制炎症信号的目的。所以此次研究以SD大鼠脊髓损伤模型为实验对象，通过检测NF-κB及相关炎症因子的变化来观察miRNA-136-5p对脊髓损伤后炎症的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年12月至2018年1月在广西医科大学医学实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级体质量为180-200 g的雄性SD大鼠36只，在广西医科大学动物实验中心购买，实验许可证号：SCXK桂2014-0005。所用动物处理得到广西医科大学伦理委员会批准。

实验用主要试剂 ：miRNA-136-5p慢病毒(广州易锦生物科技公司)；NF-κB及β-actin抗体(美国abcam公司)；白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素α (IFN-α)ELISA kits 购自武汉华美公司；免疫荧光试剂盒(免疫荧光染色，CST公司)；40 g/L多聚甲醛(武汉博士德公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 miRNA-136-5p表达抑制的慢病毒载体构建及测定大鼠miR-136-5p的序列查找与设计由广州易锦公司完成。重组的LV-miRNA-136-5p和LV-sponge(抑制载体)慢病毒表达载体由广州易锦公司合成，并经测序进行验证。然后进行慢病毒滴度测定，制备完成后重组慢病毒在-80 ℃下保存。

实验动物造模过程相关问题
造模目的：	观察miRNA-136-5p对大鼠脊髓损伤后血清细胞炎性因子、脊髓组织NF-κB蛋白的影响。
借鉴已有标准实施动物造模：	参考文献[17]报道的改良Allen装置方法建立脊髓损伤模型。
选择动物的条件：	①SD大鼠；②S PF级；③体质量为180-200 g；④雄性。
模型与所研究疾病的关系：	检测SD大鼠脊髓损伤后NF-κB及相关炎症因子的变化，观察miRNA-136-5p对脊髓损伤后炎症的影响。
动物来源及品系：	36只SPF级SD大鼠购买于广西医科大学动物实验中心。
造模技术描述：	①脊髓损伤大鼠造模过程：采用10 g克氏针从3 cm高度自由落下，击中硬膜囊，导致脊髓T₁₀段受到冲击损伤；②重组的LV- miRNA-136-5p和LV-sponge慢病毒表达载体由广州易锦公司合成。
动物数量及分组方法：	36只大鼠分组：正常对照组n=9、模型组(LV-ctrl +脊髓损伤组)n=9、过表达组(脊髓损伤+ LV- miRNA-136-5p)n=9、抑制组(脊髓损伤+LV-sponge)n=9。
造模成功评价指标：	①组织学观察：造模大鼠冲击部位出现水肿、充血，颜色暗红；②行为学观察：出现下肢瘫痪和尿潴留等表现；③量表评价：立即进行BBB行为评分为0。
造模后实验观察指标：	ELISA测定：大鼠血清白细胞介素1β，白细胞介素6和干扰素α表达水平；Western Blot和双重免疫荧光检测NF-κB蛋白的表达。
造模后动物处理：	各组大鼠在第1，3，7天分别给予麻醉后取血，再处死取脊髓组织。
伦理委员会批准文件：	动物处理得到广西医科大学伦理委员会批准。

1.4.2 实验分组及造模方法大鼠标号随机分成正常对照组、模型组(LV-ctrl +脊髓损伤组)、过表达组(脊髓损伤+ LV- miRNA-136-5p)、抑制组(脊髓损伤+LV-sponge)，每组9只。麻醉后，大鼠俯卧位，固定，手术区皮肤碘伏常规消毒铺孔巾。皮肤切口大小为3 cm，分离皮下筋膜、椎旁肌肉。用眼科剪切开棘突和棘突间韧带，充分暴露T₉-T₁₁棘突，在椎板之间轻轻取出黄韧带，用钳子咬住T₁₀椎板并露出硬脑膜。使用自制的改良Allen装置^[18]，10 g克氏针从 3 cm高度自由落下，击中硬膜囊，导致脊髓T₁₀段受到冲击损伤，温盐水冲洗伤口，按顺序缝合肌肉，筋膜和皮肤。被撞击的脊髓表面迅速渗出血液，颜色暗红。手术后，将大鼠在单笼中饲养，每天1次皮下注射3万单位的青霉素。每日定期膀胱压迫排尿2次，连续3 d。

脊髓损伤建模前后对大鼠按BBB(Basso，Beattie和Bresnahan)评分标准进行行为功能评估。手术前7 d及手术当天过表达组、抑制组在损伤区连续注射慢病毒载体悬液10 μL(病毒滴度为10⁸ TU/mL)，正常对照组、模型组注射等量生理盐水。

1.4.3 样品采集在造模成功后的第1，3，7天3个时间点，各组分别取3只大鼠，采集血液及脊髓标本。从大鼠的眼球采集血液，分离获得血清。采集脊髓标本时，从左心室注入肝素生理盐水约200 mL直至清亮液体排出后，取脊髓损伤部位1.0-2.0 cm的脊髓组织。在同一时间点，采集正常组相应部分的脊髓组织。

1.4.4 ELISA法测定炎症因子水平 ①血清的提取：将各组大鼠眼球采血置洁净干燥的试管内，待自然凝固后将血清注入灭菌的冻存管内，液氮中保存待测；②按ELISA试剂盒说明书进行操作，第1，3，7天检测各组大鼠血清炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和干扰素α水平。

1.4.5 Western blot检测大鼠脊髓组织NF-κB蛋白的表达组织经无酶水洗涤3次，匀浆机破碎、搅拌均匀后，分别加入含有0.1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液1 mL，4 ℃下裂解30 min。在4 ℃，11 000 r/min条件下，离心15 min，小心收集上清液，按BCA试剂盒说明书测定所得蛋白的含量。通过进行SDS-PAGE电泳，将蛋白电泳转至PVDF膜上，转膜成功后用5%脱脂奶粉在37 ℃温度下进行封闭，所用时间为1 h；加一抗，将温度调整至4 ℃孵育过夜；次日用配制好的TBST对膜进行洗脱5次，每次用时5 min，二抗在常温下孵育2 h，TBST洗膜5次，每次洗涤时间为5 min。经过图像分析软件曝光后，测定灰度值。β-actin作为内参照，每个样本重复3次。第1，3，7天检测大鼠脊髓各组NF-κB蛋白表达的变化。

1.4.6 双重免疫荧光染色使用高温高压消毒后的手术器械收集大鼠脊髓组织，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后用石蜡包埋，用切片机连续切片10片，每个切片厚度 5 μm。首先，用NF-κB免疫荧光染色处理脊髓的石蜡切片。NF-κB浓度为1∶100，1∶200和1∶400。根据免疫荧光染色条件和程序染色，并分析染色结果。

1.5 主要观察指标 ①造模后一般情况观察；②脊髓功能BBB评分；③Elisa检测各组细胞因子水平；④各组脊髓组织NF-κB蛋白的表达；⑤大鼠脊髓组进行双重免疫荧光染色结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对实验所得数据进行统计学分析，计数资料以x(_)±s表示。LSD检验用于成对比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

近年来，miRNA 生物学功能机制研究受到了越来越多的学者的关注。在142种微生物、动物及植物中发现了 17 000多个miRNA，其中包括1 000多种人类miRNA，为进一步研究疾病的预防、诊断、治疗和预后提供新的线索^[19]。有文献报道，在正常生理条件下miRNA可调节正常免疫功能，但在异常生理条件下，如应激、疾病等，会出现miRNA表达失调，并出现调节功能紊乱，打破自身的免疫耐受，免疫系统攻击正常的细胞、组织、器官，进而发展为自身免疫性疾病^[20]。此外，miRNA参与各种生理和病理过程，如细胞增殖和凋亡，脂肪代谢，生长和发育，免疫反应，器官造血和器官形成^[21-23]。

研究表明，在中枢神经系统的神经组织中发现了许多与神经系统疾病的发生和发展密切相关的miRNA，如阿尔茨海默病、帕金森综合征、亨廷顿病等多种神经系统疾病^[24]。在对阿尔茨海默病的研究中，田密等^[25]通过实时荧光定量方法检测阿尔茨海默病转基因小鼠脑组织中的miR-669f-3p、miRNA-135a-2-3p等有差异性表达，可能表明miRNA在阿尔茨海默病的发展中起重要作用。孔程程等^[26]在1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导下，成功建立帕金森病动物模型，并使用miRNA-181a+对动物模型进行干预下，与模型组相比，干预组多巴胺神经元损伤明显改善，神经元形态和数量、细胞凋亡情况均出现改善，这表明miRNA-181a对帕金森病所致多巴胺能神经元损伤起到神经保护作用。Shi等^[27]体外培养星形胶质细胞，并用不同浓度白细胞介素17刺激细胞，同时miRNA-136-5p-inhibition慢病毒转染的小鼠星形胶质细胞，与空白组相比，miRNA-136-5p相对表达量显著下调，A20蛋白表达量显著升高。因此，作为中枢神经系统的重要组成部分，有理由认为伴随着脊髓损伤后多种基因表达水平发生改变，miRNA表达也随之出现相应的变化，这也说明在脊髓损伤的病理过程中miRNA发挥了关键作用。

NF-κB是真核细胞的转录因子，几乎存在于所有的细胞内^[28]。在脊髓组织中，NF-κB在神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中均有表达^[29-31]。脊髓损伤时可激活神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞上的NF-κB，活化后的NF-κB进入细胞核，与靶基因上启动子或增强子上的κB序列结合，使靶基因表达，释放大量的炎性细胞因子、炎性趋化因子及黏附分子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6、白细胞介素8及细胞间黏附分子1等。同时，细胞因子的激活可进一步增强NF-κB的表达，形成一系列扩增效应网络，加重脊髓损伤后的继发性损伤^[32-33]。

通过Elisa、Western Blot、双重免疫荧光光染色法检测的结果表明慢病毒载体介导动物体内miRNA-136-5p的表达上调和下调，大鼠血清和脊髓组织的NF-κB蛋白和炎症因子表达量出现相应变化。NF-κB参与许多炎症免疫过程的基因转录调控，特别是在巨噬细胞的炎症免疫反应中，通过重要的信号级联传导作用，激活炎症信号传导通路进而在脊髓损伤炎症反应中产生生物学效应。因此，许多与脊髓损伤相关的促炎细胞因子具有NF-κB结合位点^[34-35]。从此次研究NF-κB蛋白表达结果可以看出，模型组表达量增加，在过表达组上调miRNA-136-5p的表达后，增加更明显；而抑制组下调miRNA-136-5p的表达后，表达量明显减少。结果显示miRNA-136-5p对于脊髓损伤大鼠脊髓组织NF-κB的表达具有明显的调控作用。基于NF-κB对炎性细胞因子的明确调控作用和以上实验结果，miRNA-136-5p促进和NF-κB p65 活化, 进而上调复杂的促炎细胞因子表达，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6，加重脊髓损伤炎性反应和损伤，可能是miRNA-136-5p治疗脊髓损伤发病的重要作用机制之一。

综上所述，脊髓损伤动物模型中上调miRNA-136-5p，促进NF-κB蛋白表达升高并介导细胞因子的表达；反之，抑制NF-κB蛋白和细胞因子的表达，这说明miRNA-136-5p对急性脊髓损伤大鼠的炎症因子起到调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用

Effect of miRNA-136-5p on inflammatory factors in rat models of acute spinal cord injury

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[1]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[2]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[3]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[4]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[5]	马斌祥, 何万庆, 周广超, 关永林. 雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 701-706.
[6]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[7]	闫鹏, 马玉斐, 崔京福, 郝少飞, 刘金辉, 关春雷, 王潇燃, 杨小玉. 阳极阻滞电刺激骶神经根重构膀胱功能的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3684-3689.
[8]	徐伟龙, 左媛, 辛大奇, 贺晨阳, 赵鹏, 史鸣, 周博源, 刘雅婷, 赵岩. 急性钳夹型脊髓损伤模型大鼠造模方式的选择：一项网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3767-3772.
[9]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[10]	田婷, 李晓光. 脊髓损伤再生修复中的问题与挑战[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3039-3048.
[11]	任炳开, 郑怡彬, 黄磊文, 吴繁辉, 杨东. 呼吸道管理及纤维支气管镜治疗创伤性颈脊髓损伤的价值[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(18): 2902-2907.
[12]	陈星颖, 郝飞, 高钰丹, 赵文, 段红梅, 杨朝阳, 李晓光. 康复训练结合神经营养因子3-壳聚糖支架改善脊髓损伤大鼠骨骼肌形态和运动功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2514-2520.
[13]	吴存书, 詹晓萱, 赵思怡, 黄帆, 张悦, 丘明旺, 夏静娴, 卢晓波. 运用雷达图对脊髓损伤步态训练进行系统评价再评价的质量和效果[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2287-2296.
[14]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[15]	方超, 孙健, 魏来福, 高飞, 钱军. 振荡电场刺激脊髓损伤模型大鼠抑制神经炎症反应促进功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1717-1722.