1.1 设计 随机对照动物细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2018年4月在中国中医科学院实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 16只体质量2.5-3.0 kg健康新西兰兔,4-6月龄,雌雄不限,由中国中医科学院实验动物中心提供。
1.3.2 实验用主要试剂和仪器[10-13] 胎牛血清、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司),TRIZOL(美国invitroge公司),引物(上海生工生物工程公司),NAS-99分光光度计(美国ACTGene公司),BioSens SC 810B凝胶成像仪(上海山富科学仪器有限公司),ABI7900HT实时PCR仪(美国ABI公司),BC-subMIDI 电泳仪(北京六一仪器厂),Beckman Allgre 21R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 兔脊柱节段终板的分离与培养 根据随机数字表法将16只实验新西兰兔随机分为压力组与对照组。通过耳缘静脉将肝素钠注入麻醉后的新西兰兔,并在5 min后空气栓塞处死,带入超净工作台;在无菌条件下,从腰背部取出下胸段及腰段脊柱,并用含肝素PBS冲洗;在2.5倍放大镜下用咬骨钳、手术刀片切取L2/L3、L4/L5、L6/S1(3节段)椎间盘运动节段,并进行分离得到完整的椎间盘运动节段;用含肝素的高渗PBS进行标本表面冲洗,再在含肝素的HBSS液中漂洗2 min,后放入六孔板[10-13]。
2组样本分别放入脊柱运动节段离体加载和培养装置中,压力组予29.4 N压力,对照组不予压力。2组均放入渗透压为410 mOsm/kg的培养基中(培养基成分:细胞培养液DMEM、体积分数10%胎牛血清、25 mg/L抗坏血酸、50 g/L庆大霉素)[14]。并将2组离体模型放入37 ℃,体积分数5%CO2恒温培养箱中,隔天更换培养液。随后分别在培养前(0 d)和培养后第3,7及14天,取出标本并分离出椎体终板。
1.4.2 组织学观测[10-13] 将2组各时间点取出的终板软骨组织进行体积分数10%甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋等处理,将终板组织平均切成两半,其中一半切成厚4-6 μm的连续切片,另一半行免疫组织化学检测。
1.4.3 免疫组织化学检测[10-13] 终板软骨组织进行石蜡包埋、切片、脱蜡、水化常规处理,PBS冲洗5 min×3次;热修复法抗原修复;山羊血清封闭5 min,加入一抗,4 ℃过夜;PBS清洗5 min×3次;加入二抗,室温孵育20min,PBS清洗5 min×3次;滴加DAB显色,约3 min,PBS清洗;苏木精复染30s;梯度乙醇脱水干燥,中性树胶封固后置于显微镜下观基质金属蛋白酶13蛋白、蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达情况。
1.5 主要观察指标 ①2组兔终板软骨组织的组织学观察;②终板软骨组织基质金属蛋白酶13蛋白、蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。
1.6 统计学分析 采用 SPSS 17.0统计软件分析,计量资料x±s表示,组内比较采用χ2检验,2组数据之间比较采用t 检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。