非血瘀证腰椎间盘突出症非手术治疗的血清蛋白质组学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0835

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (16): 2570-2576.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0835

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非血瘀证腰椎间盘突出症非手术治疗的血清蛋白质组学分析

桂裕昌1，许建文2，邰志洪1，饶远森1，曹玉举1，尹利军3

1广西中医药大学第一临床医学院，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西医科大学第一附属医院康复医学科，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西中医药大学第一附属医院骨科，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2018-01-30 出版日期:2018-06-08 发布日期:2018-06-08
通讯作者: 许建文，博士，教授，主任医师，广西医科大学第一附属医院康复医学科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:桂裕昌，男，1990年生，湖北省黄石市人，汉族，广西中医药大学第一临床医学院在读硕士，主要从事脊柱外科临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81260544)；广西自然科学基金项目(桂科自2013GXNSFAA019194)；广西医疗卫生重点科研课题(S201307-1)

Non-surgical treatment of lumbar intervertebral disc protrusion without blood stasis: a serum proteomic analysis

Gui Yu-chang1, Xu Jian-wen2, Tai Zhi-hong1, Rao Yuan-sen1, Cao Yu-ju1, Yin Li-jun3

1the First Clinical Medical School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Rehabilitation Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2018-01-30 Online:2018-06-08 Published:2018-06-08
Contact: Xu Jian-wen, M.D., Professor, Chief physician, Department of Rehabilitation Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Gui Yu-chang, Master candidate, the First Clinical Medical School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260544; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2013GXNSFAA019194; the Medical Treatment and Public Health Project of Guangxi Province, No. S201307-1

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
蛋白质组学：蛋白质组学是从整体的角度研究蛋白质特征，包含蛋白质的表达、功能、结构、修饰以及蛋白之间的相互作用。由此获取蛋白质水平上有关疾病发生、分子代谢等过程的信息，这些信息能够帮助研究者精确地把握某一特定状态中的蛋白质信息，推测蛋白和疾病发生、发展的联系。近年蛋白质组学研究发展迅速，随着蛋白质组学方法的更新优化、数据库的升级扩展，结合基因组学、生物信息学及网络分析，为研究疾病分子标记和治疗作用靶标提供了新的途径和思路。
腰椎间盘突出症：主要病因为椎间盘变性，椎间盘组织的微观结构发生改变。青壮年体力劳动者是腰椎间盘突出症的高发人群，主要表现为腰腿痛、脊柱侧弯、活动障碍、下肢疼痛麻木等，并且常常反复发作，给患者生活质量造成严重影响。目前，大多数腰椎间盘突出症患者可通过非手术治疗治愈，但是其具体机制尚不明确。

摘要
背景：蛋白质组学是一项较成熟的实验技术，目前应用于腰椎间盘突出症非手术治疗的研究报道较少。
目的：通过蛋白质组学相关技术筛选非血瘀证腰椎间盘突出症患者经非手术治疗前后的差异表达蛋白。
方法：选取非血瘀证腰椎间盘突出症患者60例，予非手术综合治疗4周，应用iTRAQ联合LC-MS/MS筛选和鉴定患者治疗前后的血清差异表达蛋白，并对鉴定出的蛋白质进行相关生物信息学分析，同时观察患者临床疗效。
结果与结论：①患者治疗后较治疗前的目测类比评分明显降低(P < 0.05)，JOA评分明显升高(P < 0.05)，疗效优良率达95.0%；②质谱共筛选出有意义差异蛋白300个，并鉴定到25个显著性差异蛋白(P < 0.05)，生物信息学分析发现其中9个差异蛋白富集至15条KEGG信号通路；③结果提示，采用西医非手术综合疗法治疗非血瘀证腰椎间盘突出症可取得较满意的疗效；补体C1qA、cDNA(FLJ60724)蛋白、补体C4B移码突变、cDNA(FLJ53025)蛋白、甘露糖结合蛋白C、载脂蛋白B、血红蛋白α-1珠蛋白链变体、血红蛋白β亚基及cDNA(FLJ76254)蛋白可能为非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的血清标志蛋白。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5966-2573(桂裕昌)

关键词: 腰椎间盘突出症, 非手术治疗, 同位素标记, 蛋白质组学, 组织构建, 血清, 生物标志物, 生物信息学, 分子机制, 中医证型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Proteomics is a well studied research method, but its application in the non-surgical treatment of lumbar intervertebral disc protrusion (LIDP) is little reported.
OBJECTIVE: To screen the differentially expressed proteins in patients with LIDP but without blood stasis before and after non-surgical treatment by proteomics.
METHODS: Sixty patients with LIDP but without blood stasis were selected, and treated with non-surgical treatment for 4 weeks. The differentially expressed proteins were screened and identified by iTRAQ combined with LC-MS/MS. The bioinformatics analysis of the identified proteins was carried out, and the curative effectiveness was investigated.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with those before treatment, the Visual Analogue Scale scores were significantly (P < 0.05), the Japanese Orthopedic Association scores were significantly increased decreased (P < 0.05), and the excellent and good rate reached 95.0% post-treatment. A total of 300 differentially expressed proteins were screened and 25 significantly expressed proteins were identified (P < 0.05). Bioinformatics analysis revealed that nine of the significantly expressed proteins were enriched to 15 KEGG signaling pathways. These results suggest that the use of Western medicine non-surgical treatment for the LIDP without blood stasis can achieve satisfactory results. Besides, complement C1qA, cDNA protein (FLJ60724), complement C4B frameshift mutation, cDNA protein (FLJ53025), mannose binding protein C, apolipoprotein B, hemoglobin α-1 globin chain variant, hemoglobin β subunit and cDNA protein (FLJ76254) may be the potential serum markers of the non-surgical treatment for the LIDP without non-blood stasis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Intervertebral Disc Displacement, Isotope Labeling, Proteomics, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

桂裕昌1，许建文2，邰志洪1，饶远森1，曹玉举1，尹利军3 . 非血瘀证腰椎间盘突出症非手术治疗的血清蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2570-2576.

Gui Yu-chang1, Xu Jian-wen2, Tai Zhi-hong1, Rao Yuan-sen1, Cao Yu-ju1, Yin Li-jun3. Non-surgical treatment of lumbar intervertebral disc protrusion without blood stasis: a serum proteomic analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2570-2576.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析纳入患者60例，按意向性处理分析，全部进入结果分析。

2.2 效果评价治疗全程无患者失访及脱落，未发生不良事件。治疗前后疼痛目测类比评分及治疗前后JOA评分比较差异均有显著性意义(P < 0.05，见表1)，治疗后临床控制30例，显效19例，有效8例，无效3例，总有效率95% (57/60)。

2.3 质谱鉴定结果通过iTRAQ标记技术联合LC-MS/ MS技术共鉴定到300个蛋白质组，筛选出治疗前后表达差异的蛋白质25个，其中上调表达的差异蛋白11个、下调表达的差异蛋白14个(见表2)。

2.4 差异蛋白GO功能注释聚类分析生物过程方面发现差异蛋白主要参与了单一生物过程、细胞过程、应激反应、生物调节、代谢过程、免疫系统过程、多细胞过程、细胞定位、信号传导、细胞成分组织、发育过程、多生物过程、生长过程、细胞移动和生物黏附(具体注释见图1A)。分子功能方面发现差异蛋白主要涉及了结合、催化活性、转运活性、酶调节活性、抗氧化活性、分子传导活性、结构分子活性、受体活性(具体注释见图1B)。细胞构成方面这些差异蛋白主要定位在细胞器、胞外区、细胞、细胞膜、大分子复合物组分、细胞外基质和膜蛋白等部位(具体注释见图1C)。

2.5 差异蛋白KEGG通路注释聚类分析应用KASS (KEGG Automatic Annotation Server)通过同源/相似蛋白的KO号注释至相关KEGG通路，进一步分析22个差异蛋白，结果提取到被注释至15条KEGG信号/代谢通路的9个差异蛋白：补体C1qA、cDNA(FLJ60724)蛋白、补体C4B移码突变、cDNA(FLJ53025)蛋白、甘露糖结合蛋白C、载脂蛋白B、血红蛋白α-1珠蛋白链变体、血红蛋白β亚基和cDNA(FLJ76254)蛋白。15条KEGG信号/代谢通路中补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染富集到4个差异蛋白，百日咳、系统性红斑狼疮、疟疾富集到3个差异蛋白，细胞吞噬体、非洲锥虫病富集到2个差异蛋白，PI3K-Akt信号通路、粘着斑、ECM受体作用、叶酸合成、朊粒病、美洲锥虫病、脂肪消化吸收、维生素消化吸收8条信号通路富集到1个差异蛋白(见表3)。

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引言

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计自身前后对照观察。

1.2 时间及地点病例来源于2013年7月至2014年12月期间于广西中医药大学第一附属医院治疗的腰椎间盘突出症非血瘀证患者。

1.3 对象取同期广西中医药大学第一附属医院治疗的腰椎间盘突出症非血瘀证患者60例，男32例，女28例；年龄(41.7±11.8)岁；其中48例为腰痛合并下肢放射痛，12例仅有腰臀部疼痛；影像学检查示L_4/5椎间盘突出26例；L₅/S₁椎间盘突出24例，2个及以上节段椎间盘突出10例。研究符合广西中医药大学第一附属医院医学伦理委员会的相关制度，受试者均自愿签署知情同意书。

1.3.1 入选标准 ①根据临床症状体征及影像学资料确诊腰椎间盘突出症并符合国内行业公认的西医诊断标准^[3-4]，且参照国家中医药管理局2012年发布的《中医病证诊断疗效标准》辨证为寒湿证、湿热证或肝肾亏虚证者^[5]；②年龄大于18岁，小于59岁；③自愿参加该研究，并签署知情同意书者。

1.3.2 排除标准 ①合并有肝脏或肾脏相关疾病、心脑血管系统疾病、呼吸系统疾病、血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤或各种精神病；②资料不全的患者。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法及效果评定入组患者均给予甘露醇注射液(江西回音必集团东亚制药有限公司，生产批号：H36020156)250 mL，每日静脉滴注2次，连续使用5-7 d；地塞米松磷酸钠注射液(华中药业股份有限公司，生产批号：H42021492)5-10 mg，每日静脉滴注1次，连续使用3-5 d；塞来昔布胶囊(辉瑞制药有限公司，生产批号：J20140072)200 mg，每日口服1次，连续使用5-7 d；甲钴胺片(华北制药股份有限公司，生产批号：H20031126) 0.5 mg，每日口服3次，连续使用7-10 d；骨盆电动牵引，牵引质量为体质量35%-50%，30 min/次，1次/d，15 d为1疗程；总疗程为4周，治疗期间嘱患者卧床休息的同时指导患者适当行腰背肌功能锻炼。通过目测类比评分法在治疗前及治疗4周后评价患者腰腿痛水平；根据腰椎JOA (Japanese Orthopaedic Association Scores日本骨科协会评估治疗分数)评价临床疗效，按改善率=[(治疗后评分-治疗前评分)/(29-治疗前评分)]×100%计算，设定改善率达75%以上为临床控制，改善率为50%至75%为显效，改善率在25%-50%之间为有效，改善率低于25%为无效。

1.4.2 标本采集与处理治疗前后抽取2 mL空腹外周静脉血，冰盒取回后放置4 ℃冰箱2.0-3.0 h后，4 ℃下离心10 min(以3 500 r/min)，取上清液分装，编号后置于-80 ℃冰箱中保管。

1.4.3 总蛋白提取、SDS-PAGE电泳将每组样品运用Agilent Multiple Affinity Removal Column(H14)顺次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分浓缩后，Bradford法蛋白质浓度测定。两组样品各取10 μg，体积比5∶1加5X上样缓冲液，沸水浴5 min后在14 000×g条件下离心10 min，取上清液进行12.5% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。

1.4.4 酶解、肽段定量及标记样品各取400 μg，分别加30 μL SDT裂解液(含100 mmol/L DTT)，沸水浴5 min后静置冷却至室温。滴加200 μL UA buffer(8 mol/L Urea， 150 mmol/L TrisHCl pH 8.0)混匀，转置30 ku超滤离心管，离心14 000×g 15 min。加入200 μL UA buffer在14 000×g条件离心15 min，弃滤液。加100 μL IAA(50 mmol/L IAA in UA)后600 r/min振荡1 min，避光下室温静置30 min，在 14 000×g条件离心10min。随后滴加100 μL UA buffer，重复14 000×g条件离心10 min 2次。滴加100 μL Dissolution buffer后离心14 000×g 10 min，重复2次。随即加入40 μL Trypsin buffer(3 μg Trypsin in 40 μL Dissolution buffer)后600 r/min振荡1 min，并于37 ℃酶解16到18 h。更换新的收集管，14 000×g条件再次离心10 min，取滤液后OD280肽段定量。取等量混合为内参，各取100 μg肽段，根据AB公司提供的iTRAQ(AB SCIEX)试剂盒说明书要求进行标记，标记试剂117用于标记治疗前，标记试剂118用于标记治疗后，标记试剂119用于标记内参，均重复iTRAQ标记2次。

1.4.5 质谱分析及鉴定利用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离，然后使用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析及鉴定。质谱分析原始数据用软件 Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库鉴定及定量分析，蛋白鉴定的置信度设置为95%^[6]，同时进行蛋白反库搜索，设置假阳性率(FDR≤0.01)，以比值(治疗后/治疗前)≥1.2(上调)和≤0.8(下调)选取差异蛋白。

1.4.6 生物信息学分析通过Uniprot数据库中的注释信息鉴定iTRAQ筛选出的差异表达蛋白质，选择GO的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类和富集分析；利用KEGG GENES数据库进行信号通路分析。

1.5 主要观察指标 ①患者治疗前后目测类比、JOA评分比较；②患者治疗前后血清显著差异表达蛋白；③差异蛋白GO功能注释聚类分析；④差异蛋白KEGG通路注释聚类分析。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用x(_)±s表示，治疗前后比较采用配对样本t 检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

腰椎间盘突出症的病理为退变的椎间盘出现破裂或凸起等情况，进而对相关神经等造成压迫或刺激，导致一系列的疼痛和功能障碍，严重影响患者的生活质量。目前，保守治疗是大多数腰椎间盘突出症患者首选的治疗方法，有研究发现，手术与保守治疗的长期疗效无显著差异^[7]。

另一方面，蛋白质是生命活动功能的执行物，绝大多数生命的调控过程、疾病的发生过程和大多数药物靶标均处于蛋白质水平。因此，为了寻找腰椎间盘突出症综合病理生理机制，鉴定相关差异表达蛋白是必不可少的。随着蛋白组学技术快速发展，近来出现的ITRAQ标记联合LC-MS/MS技术，其具有蛋白检出率高，高重复性和定量分析的准确性，尤其适用于低丰度蛋白、不同分子质量和极酸极碱蛋白的筛选。该研究采用iTRAQ标记联合LC-MS/MS技术筛选出腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后显著性差异的蛋白25个，通过KEGG通路注释进一步提取到与9个差异蛋白相关的15条KEGG信号/代谢通路。显著性差异蛋白主要集中在补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染这2条信号通路上，说明补体及凝血级联与腰椎间盘突出症密切相关，但金黄色葡萄球菌感染与腰椎间盘突出症相关的研究证据目前尚不足。非血瘀证腰椎间盘突出症患者经非手术综合治疗后，目测类比评分明显降低(P < 0.05)，JOA评分明显升高(P < 0.05)，疗效优良率达95.0%，说明非手术综合治疗非血瘀证腰椎间盘突出症可取得比较满意的临床疗效。

C1q构成补体经典途径的起始分子成分，其不但能启动补体系统经典途径，还可以识别和结合其他配体^[8]。有报道显示补体C1q能够增强β-淀粉样蛋白对小胶质细胞的活化作用^[9]。另一方面，有学者发现神经损伤的疼痛因素会促进某些细胞因子产生、激活胶质细胞^[10]，释放疼痛相关的活性物质及疼痛介质，导致神经病理性疼痛。近来有报道提示，小胶质细胞激活后能够介导一些炎症递质受体表达，缓解外周神经损伤后的疼痛^[11]。而腰椎间盘突出症是以腰腿痛和放射性坐骨神经痛为主要及首发症状，ROPPER等^[12]总结以前的研究认为腰间盘突出导致神经根压迫是放射性坐骨神经痛的主要原因。此次研究发现补体C1qA在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后呈下调显著差异表达，并显著富集至补体与凝血级联、百日咳、金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、朊粒病、美洲锥虫病6条信号通路，其中补体与凝血级联与免疫应答密切相关，而刘振刚等^[13]的研究显示炎症和自身免疫反应是导致腰椎间盘突出症患者临床症状的主要原因，提示补体C1qA可能参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其可能与炎症及自身免疫反应相关。

cDNA(FLJ60724)蛋白为人高度相似软骨寡聚基质蛋白，软骨寡聚基质蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)是软骨代谢的主要产物。有报道显示，COMP在正常腰椎间盘和退变腰椎间盘的纤维环和终板中均有表达，并在退变腰椎间盘中表达较正常腰椎间盘中显著增强，由此提示COMP表达在纤维环及终板中表达增强可能对椎间盘退变起保护作用^[14-15]。陈帅等^[16]研究发现，COMP随着疾病的严重程度不同而在退变的髓核中出现表达差异，提示其可能是椎间盘退行性疾病的独立危险因素。因此作者认为cDNA(FLJ60724)蛋白可能参与椎间盘组织的代谢过程。

研究发现cDNA(FLJ60724)蛋白在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后呈上调显著差异表达，并显著富集至细胞吞噬体、PI3K-Akt信号通路、黏着斑、ECM受体作用、疟疾5条相关信号通路。另一方面，在炎性环境中，ECM受体介导ECM成分与结构的改变能够引起软骨细胞基质微环境发生变化，从而影响软骨细胞代谢过程^[17]。由此提示cDNA(FLJ60724)蛋白可能参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其可能与椎间盘退变及代谢相关。

补体C4B的DNA分子中，碱基遗失或增多非3的倍数，引起其位置之后的一系列编码产生移位错误的变化过程称为移码突变，补体C4B移码突变是C4B基因缺陷的一种。cDNA(FLJ53025)蛋白是人高度相似C4B蛋白，补体C4B移码突变与cDNA(FLJ53025)蛋白均属于C4B基因符号。补体系统是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白及补体受体构成，其主要参加机体的免疫应答机制。炎症与腰椎间盘突出症密切相关，免疫反应又是炎症启动的重要因素，由此提示补体系统和补体蛋白的激活及表达与腰椎间盘突出症的发生和发展相关。补体C3作为血清中含量最高的组分在补体系统中起关键作用，而C4B作为C4激活后的重要产物主要参加C3的激活。另一方面，有研究报道发现补体C3与腰椎间盘突出症相关^[18-19]，但是目前尚未发现有相关研究提示补体C4B与腰椎间盘突出症相关的报道。此次研究发现补体C4B移码突变与cDNA(FLJ53025)蛋白在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后均呈下调显著差异表达，并都显著富集至补体与凝血级联、百日咳、金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮4条相关信号通路，提示补体C4B移码突变与cDNA(FLJ53025)蛋白可能也参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其在治疗前后下调表达的原因及其作用，尚需进一步研究。

甘露糖结合蛋白C具有免疫调节、补体活化及调节炎症反应等作用。血清中甘露糖结合蛋白C水平上调和活性增强与炎性疾病相关，其过度活化可导致组织损伤。目前虽尚未见明确证据显示甘露糖结合蛋白C与腰椎间盘突出症相关，而孙志岭等^[20]研究发现甘露糖结合蛋白C可能与强直性脊柱炎的发病及病理过程相关联。该研究发现甘露糖结合蛋白C在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后呈上调显著差异表达，并显著富集至补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染、细胞吞噬体3条相关信号通路，提示甘露糖结合蛋白C可能参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其可能与炎症、免疫反应相关。

氧自由基损伤在腰椎间盘退变中起重要作用^[21]，腰椎间盘突出症可以引起微静脉血流停滞或受压神经节段发生缺血^[22]，造成神经根急慢性无菌性炎症；而当椎间盘内压下降时，神经根受压减轻，能够暂时改善血液供应，从而在局部引起反复的缺血-再灌注。研究表明，急慢性炎症和缺血-再灌注都能够导致自由基产生上调，脂质过氧化作用增强。超氧化物岐化酶是具有抗氧化能力的酶促体系，其能通过消除自由基(O^2-)和活性氧，下调脂质过氧化或分解过氧化物，减少体内积累的自由基对组织造成的损伤^[23-26]。瞿群威等^[27-29]报道发现超氧化物岐化酶参与了腰椎间盘突出症生理、病理过程的发生和发展。另有研究显示，过多的活性氧自由基可以导致体内各血浆脂蛋白，尤其是低密度脂蛋白显现出显著的氧化应激，使其极易转变成氧化低密度脂蛋白^[30]。载脂蛋白B是低密度脂蛋白的主要载脂蛋白，其参加脂质运输和外源性脂质的转运和消化吸收，在脂类的转运与代谢过程中起重要作用。由此提示载脂蛋白B可能通过脂质氧化应激与腰椎间盘突出症相关。此次研究发现载脂蛋白B在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后呈上调显著差异表达，并显著富集至脂肪消化吸收、维生素消化吸收2条相关信号通路，提示载脂蛋白B可能参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其可能与脂质代谢相关。

血红蛋白是人体红细胞的主要蛋白质，其能够将氧输送至身体各个组织、器官。正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链与4个亚铁血红素组合的亚基形成，而人血红蛋白的珠蛋白肽链有α、β、γ、δ、ε、ζ链6种类型。肽链结构变化能够引起血红蛋白功能及相应理化性质发生改变或异常，任何一种珠蛋白链都可发生结构异常。目前已报道的异常血红蛋白有1 000余种，涉及多种珠蛋白链^[31-32]。多数变种仅具有遗传特性，只有少数变种能够产生临床症状。另一方面，已有不少学者认为腰椎间盘突出症与遗传相关^[33]。有研究报道发现，血红蛋白β亚基随着不同临床分期强直性脊柱炎患者病理阶段的改变而表现出显著差异表达^[34]。刘路路等^[35]研究提示腰椎间盘突出症患者可能存在慢性红细胞消耗，其外周血中红细胞和血红蛋白明显减少。由此提示血红蛋白α-1珠蛋白链变体可能与腰椎间盘突出症相关。本研究发现载血红蛋白α-1珠蛋白链变体与血红蛋白β亚基在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后均呈上调显著差异表达，提示血红蛋白α-1珠蛋白链变体和血红蛋白β亚基可能参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，筛选出的血红蛋白α-1珠蛋白链的突变体并有可能成为腰椎间盘突出症遗传相关性的潜在血清标志物。

核因子κB通路的激活，可以在椎间盘退变过程中上调相关炎性基因的表达，进而影响椎间盘营养物质的交换，引起椎间盘的退变^[36]。血清白细胞介素1β^[37-38]、白细胞介素8作为致炎物质是参与腰椎间盘突出症炎症反应的重要因素^[39-40]。综上所述，核因子κB通路与白细胞介素1β、白细胞介素8在腰椎间盘突出症中起重要作用。叶酸属于B族维生素的一种，其由喋酸与谷氨酸结合而成。叶酸是体内多种生化反应中的重要辅助因子，并参与核酸、磷脂及蛋白质的代谢等多种生化反应。何智映等^[41]报道发现叶酸可能通过NF-κB通路抑制炎症因子白细胞介素1β和炎症趋化因子白细胞介素8的表达阻断炎症反应。由此推测叶酸代谢通路有可能与腰椎间盘突出症相关。另一方面，γ-谷氨酰水解酶是叶酸代谢通路相关的基因，而cDNA(FLJ76254)蛋白为高度相似人γ-谷氨酰水解酶，其是否参与叶酸代谢通路影响腰椎间盘突出症还有待进一步研究。此次研究发现cDNA(FLJ76254)蛋白在腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后呈上调显著差异表达，并显著富集至叶酸合成1条相关信号通路，提示cDNA(FLJ76254)蛋白可能也参与非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证的过程，其在治疗前后上调表达的原因及其作用，尚需进一步研究。

综上所述，此次研究通过iTRAQ结合LC-MS/MS技术筛选腰椎间盘突出症非血瘀证非手术综合治疗前后血清差异表达蛋白并通过GO和KEGG生物信息分析，发现补体与凝血级联通路与腰椎间盘突出症密切相关，筛选到补体C1qA、cDNA(FLJ60724)蛋白、补体C4B移码突变、cDNA (FLJ53025)蛋白、甘露糖结合蛋白C、载脂蛋白B、血红蛋白α-1珠蛋白链变体、血红蛋白β亚基与cDNA(FLJ76254)蛋白可能为非手术综合治疗腰椎间盘突出症非血瘀证潜在的血清标志物。但这些蛋白在腰椎间盘突出症发生、发展中的详细作用机制尚未完全清楚，需要进一步研究评价其可靠性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

非血瘀证腰椎间盘突出症非手术治疗的血清蛋白质组学分析

Non-surgical treatment of lumbar intervertebral disc protrusion without blood stasis: a serum proteomic analysis

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