1.1 设计 细胞学实验观察。
1.2 时间及地点 实验于2016年1月至2017年7月在西南医科大学附属中医医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验用细胞 C518大鼠膝关节软骨细胞(购于昆山市北纳创联生物技术有限公司,中国,批号:BNCC 340190)。
1.3.2 实验动物 成年SD大鼠12只,雌雄不限,购于西南医科大学附属中医医院中心实验室,批号:161123。
1.3.3 实验用药物 ①少阳生骨方:柴胡10 g、黄芩6 g、半夏10 g、生姜6 g、骨碎补10 g、怀牛膝6 g、山茱萸10 g、党参10 g、大枣10 g、甘草6 g,西南医科大学附属中医医院制剂室提供,浓缩至含生药1 g/mL的药液;②盐酸氨基葡萄糖胶囊:购于香港澳美制药厂,中国,规格:0.75 g,批号:HC20110004。
1.3.4 实验用主要试剂 生理盐水、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS
);Ⅱ型胶原的Ⅰ抗(批号:Ab34712
)、基质金属蛋白酶13的Ⅰ抗(批号:Ab75606
)以及Ⅱ抗(批号:ZB-5301
)均购于美国Abcam公司;总RNA提取试剂盒购自美国Axygen公司;PCR Master Mix试剂盒购自美国ABI公司;PVDF膜、SYBR Premix Ex Taq II、TRIZOL裂解液、苏木精、伊红、乙醇、分离胶、浓缩胶、蛋白电泳缓冲液、ECL发光试剂盒均购自广东光华科技股份有限公司。
1.3.5 实验用主要仪器 细胞培养箱产自美国Thermo公司(型号:HERAcell 150i);倒置显微镜产自德国Leica公司(型号:DMi8);离心机产自美国Thermo公司(型号:Multifuge X3);超微量核酸蛋白检测仪产自美国Alpha Innotech公司(型号:AlphaSpec);荧光定量PCR仪产自美国ABI公司(型号:ViiA7);紫外凝胶成像系统产自美国基因公司(型号:SYOR4-2050);化学发光成像仪产自北京赛智创业科技有限公司(型号:SmartChemi 610);稳压稳流电泳仪产自上海复日科技有限公司(型号:EPS-300)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及干预 首先制备含药血清:大鼠称体质量后按照组内均衡一致原则,用随机数字表法将12只SD大鼠随机分为3组,即少阳生骨方组、盐酸氨基葡萄糖组、生理盐水组,每组4只,3个组分别用相应的药物灌胃。少阳生骨方由柴胡、半夏、党参、甘草、黄茶、大零、骨碎补、川牛膝组成(由西南医科大学附属中医医院制剂室)提供,浓缩至含生药1 g/mL的药液;盐酸氨基葡萄糖胶囊,由香港奥美制药有限公司生产,规格0.75 g×20粒/瓶,给予粉末温水溶解后约。用量和浓度按Meeh Rubner公式换算,连续3 d,末次灌胃2 h后麻醉状态下腹主动脉采血,4 ℃静置过夜后离心,取血清56 ℃灭活30 min,过滤除菌,分装,并配置体积分数10%含药血清的培养基,-20 ℃冰箱保存备用。
将C518细胞分为少阳生骨方组、盐酸氨基葡萄糖组、生理盐水组,用提前制备好的相对应的体积分数10%含药血清培养各组细胞72 h。
1.4.2 C518细胞复苏及培养 将装有C518细胞的冻存管从-80 ℃的液氮罐中取出,立即置于37 ℃水浴箱中,然后移至离心管中,1 000 r/min,5 min,弃除上清液,再加入含1%青-链霉素和体积分数10%FBS的DMEM培养基摇匀,细胞浓度为1.0×108 L-1,装入培养瓶中,于细胞培养箱中培养。每隔3 d更换1次培养液,当细胞铺满细胞瓶底时,进行传代,同时密切观察细胞繁殖情况。
1.4.3 C518细胞苏木精-伊红染色 将清洁盖玻片放置于6孔板内,将各组C518细胞以1.0×108 L-1细胞浓度分别种植于盖玻片上,等细胞贴壁后再培养细胞48 h,用PBS冲洗玻片,加入40 g/L多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗3次。苏木精-伊红染色:二甲苯Ⅰ6 min→二甲苯Ⅱ6 min→体积分数100%乙醇3 min→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→75%乙醇Ⅰ3 min→清水冲洗10 min→苏木精6 min→ 50 ℃温水冲洗10 min→75%乙醇Ⅱ3 min→伊红30 s→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→烤箱烘干→树胶封固。最后放置在倒置显微镜下观察C518细胞形态,并用图像分析系统采片。
1.4.4 RT-qPCR检测 采用Trizol法提取干预后各组C518细胞总RNA,测定所提取RNA的浓度、纯度(A260 nm/A280 nm在1.8-2.0之间)。目的基因以及内参基因的引物由上海生工
内参基因(β-actin):
上游:5'- GAT CAA GAT CAT TGC TCC TCC TG-3',
下游:5'- GTC ACA GTC CGC CTA GAA GC-3',
163 bp;
Ⅱ型胶原:
上游:5'-CTT CCT ACG CCT GCT TTC CA- 3',
下游:5'-GGT GTG TTT CGT GCA GTC,AT-3',
199 bp;
基质金属蛋白酶13:
上游:5'-TTC GAG TCA TGC CAA CAA AT-3',
下游:5'-TAA GCT TTG CCC TGA AAC CT-3',
141 bp。
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公司采用Primer Premier 5.0 软件设计并合成。
反转录反应体系为:PrimeScript RT Master Mix,2 μL;样本对应的总RNA,500 ng;ddH2O,10 μL。反应条件:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s。扩增反应体系为:SYBR Premix Ex TaqⅡ,10 μL;Primer F,0.3 μL;Primer R,0.3 μL;cDNA,1 μL;ddH2O,8.4 μL。扩增条件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;62 ℃,30 s,共40个循环。把加好的样品放入PCR仪中进行反应。结果采用相对定量法2-ΔΔCt,进行3次独立实验并收集数据。
1.4.5 Western blot检测 分别取各组C518细胞提取蛋白,用BCA法进行蛋白含量测定。按照试剂盒说明书制备分离胶和浓缩胶,电泳至溴酚蓝条带至胶底部。加入缓冲液,进行转膜。转膜完成后,将PVDF膜进行一抗和二抗孵育。最后加入ECL发光试剂后置于化学发光成像仪中拍照并保存。
1.5 主要观察指标 Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13 mRNA和蛋白相对表达量。
1.6 统计学分析 所有资料采用IBM SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。数据以x±s表示,应用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13的mRNA和蛋白相对表达量,两两组间比较采用最小显著性差异法(LSD-t 检验),检验水准α=0.05。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程