1.1 设计 基因学实验。
1.2 时间及地点 于2017年1月至7月在广东省第二中医院中药药理(毒理)研究室完成。
1.3 材料
引物设计：ULK1基因的3'UTR全长引物，利用NCBI数据库，采用Primer Premier 5软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成；在5'-端载入XhoⅠ及NotⅠ(美国Thermo Fisher Scientific公司)酶切序列及其保护碱基。基因扩增长度为672 bp。
再根据ULK1基因3'UTR的序列，设计出点突变实验所用引物(由上海生工生物工程有限公司合成)。引物序列见表1。
表1 构建含人ULK1基因3'UTR的荧光素酶载体所用的引物序列
Table 1 Primers for constructing luciferase reporter gene vectors containing human ULK1 3'UTR area
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引物名称
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序列(5'-3')
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ULK1-Xho ⅠF
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CCG CTC GAG GGG GGG TGT CTC CCA TCT TTT AC
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ULK1-NotⅠR
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ATT TGC GGC CGC CTC GCC CTC CCA AAA CCA AT
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ULK1 MUT-F
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GGA CAG GCA AGG GCC AAT TCA GGA AGC CGA CTC AAA G
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ULK1 MUT-R
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CTT TGA GTC GGC TTC CTG AAT TGG CCC TTG CCT GTC C
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1.4 实验方法
1.4.1 总RNA提取 用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养293T细胞(人胚肾上皮细胞系293T细胞为实验室保存)，每天在倒置荧光显微镜(DMI8型倒置荧光显微镜，德国Leica公司)下观察生长情况，每隔2 d换液1次，待细胞铺满瓶底后，用体积分数0.25%胰酶(美国Gibco公司)进行消化和传代。
实验以1×105细胞种植于6孔板，培养至细胞融合度达到约90%时，每孔加入Trigol(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)1 mL，振荡混匀，室温下静置5 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡2 min，静置2 min；4 ℃、10 000 r/min条件下将混合液离心10 min，取上层水相液体至一新的 1.5 mL EP管中；加入等体积异丙醇，-20 ℃条件下放置30 min，4 ℃、10 000 r/min条件下将混合液离心10 min (5424型小型高速离心机，德国Eppendorf公司)，弃去上清液；加体积分数75%无水乙醇1 mL洗涤沉淀，4 ℃、 5 000 r/min条件下离心5 min，弃上清，静置于室温下，使充分晾干，接着加入ddH2O(美国Thermo Fisher Scientific公司)25 μL溶解RNA，于超低温冰箱(702型-80 ℃超低温冰箱，美国Thermo Scientific公司)冻存备用。
1.4.2 反转录及PCR 取新的0.2 mL PCR管进行反转录。反应的体系和条件：总RNA 1 μg；随机引物(上海英潍捷基贸易有限公司)和Oligo(dT)15的等体积混合物为反转录引物，共2 μL，在72 ℃条件处理5 min后，立即放在冰上冷却2 min。然后加入RT buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RT反转录酶1 μL，42 ℃下反应1 h，94 ℃变性5 min；PCR (ViiA7型实时荧光定量PCR系统，美国Thermo Scientific公司)扩增反应体系和条件为：反转录所得的cDNA 1 μL，特异性引物(终浓度1 μmol/L)各1 μL，5×PrimerSTAR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，dd H2O 14 μL，共25 μL反应体系，94 ℃预变性5 min， 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 5 min。
1.4.3 重组载体的构建 在120 V，25 min条件下，将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(PowerPac Basic电泳仪，美国Bio-Rad公司；JY-SPC水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；AlphaImager HP凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司)。用XhoⅠ与NotⅠ，对psiCHECK-2载体和ULK1基因3'UTR PCR回收产物进行双酶切反应，酶切体系和条件：PCR回收产物或载体10 μL，XhoⅠ1.5 μL，NotⅠ1.5 μL，10×buffer 5 μL，ddH2O 32 μL，混匀后37 ℃水浴2 h。用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，并根据凝胶回收试剂盒(美国OMEGA公司)说明书，对ULK1基因3'UTR PCR产物进行回收。
1.4.4 目的片段与载体进行连接、连接产物的转化 在 0.2 mL EP管中配制连接体系：酶切回收的PCR产物7 μL，酶切回收的载体1.5 μL，T4 DNA Ligase 0.5 μL，10×T4 DNA Ligase buffer 1 μL，充分混匀后于22 ℃反应2 h。在100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入10 μL连接产物，混匀；先将上述大肠杆菌细胞放置于冰上30 min，42 ℃热激90 s，再次置于冰上2 min；加入800 mL LB液体培养基，37 ℃，220 r/min下培养1 h；4 000 r/min条件下离心5 min，弃去大部分上清，其他上清用于重悬菌体；将菌液均匀涂布于含100 mg/L氨苄青霉素(广州捷倍斯生物科技有限公司)固体培养基上，37 ℃条件下倒置培养过夜。取800 μL含100 mg/L氨苄青霉素培养基加入一新的1.5 mL EP管中，挑取上述固体培养基上若干菌落，接种于该管，37 ℃下振荡培养5-8 h。取1 μL上述培养菌液为模板，进行PCR，反应条件和体系如前所述。
1.4.5 质粒的提取、重组质粒酶切鉴定 选取阳性克隆的菌液按1∶100的比例扩接至5 mL含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃、220 r/min下培养过夜；收集菌液，按照质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司)说明书步骤进行质粒提取。反应体系中质粒3 μL，XhoⅠ0.4 μL，Not Ⅰ0.4 μL，10×buffer 1 μL，ddH2O 5.2 μL，于37 ℃酶切2 h。采用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，将酶切鉴定完毕的质粒进行测序(上海生工生物工程有限公司)。
1.4.6 基因点突变 将构建好的质粒稀释100倍，分别取 1 µL做模板进行PCR反应，体系如下：PrimeSTAR® HS DNA Polymerase(日本Takara公司)0.5 μL，5×PrimeSTAR buffer 5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L each)2 μL，MUT-F (10 μmol/L)和MUT-R(10 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min 30 s，连续18个循环；72 ℃ 10 min，于4 ℃保存。PCR产物用Dpn Ⅰ进行酶切，以消化掉模板DNA，反应体系如下：PCR产物17 μL，10×T buffer 2 μL，Dpn Ⅰ酶1 μL，37 ℃消化3.0-4.0 h。
1.4.7 酶切产物转化 在100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入10 μL酶切产物，混匀；先将上述大肠杆菌细胞放置于冰上30 min，42 ℃热激90 s，再次置于冰上2 min； 加入800 mL LB 液体培养基，37 ℃，220 r/min下培养1 h；4 000 r/min条件下离心5 min，弃去大部分上清，其余上清用于重悬菌体；将菌液均匀涂布于含100 mg/L氨苄青霉素固体培养基上，37 ℃条件下倒置培养过夜。挑取1个上述固体培养基菌落，接种于含100 mg/L氨苄青霉素LB培养基上，在37 ℃，220 r/min条件下培养5 h，取200 μL菌液进行测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。
1.4.8 质粒共转染采用双荧光素酶报告基因进行检测 实验分为4组：ULK1-WT+NC组用ULK1野生型质粒和NC进行共转染；ULK1-WT+140-5p mimics组用ULK1野生型质粒和miR-140-5p mimics进行共转染；ULK1-MUT+NC组用ULK1突变型质粒和NC进行共转染；ULK1-MUT+ 140-5p mimics组用ULK1突变型质粒和140-5p mimics进行共转染(NC和miR-140-5p mimics，上海吉玛制药技术有限公司)。
转染开始前1 d，先将293T细胞接种于24孔板上，2×104个/孔，培养基采用含10%FBS的高糖DMEM培养基；转染当天，取出长至80%的细胞，弃旧培养液；用PBS(美国Gibco公司)洗涤细胞一两次；加入胰酶，清洗培养皿底部，弃去胰酶，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱(3111型CO2细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司)中反应两三分钟后，在倒置荧光显微镜(DMI8型倒置荧光显微镜，德国Leica公司)下观察，当细胞即将脱离而变为圆粒状时，加入新鲜培养液，使均匀遍布皿底，制备成单细胞悬液；计数，并将细胞浓度调整为8×108 L-1；取出24孔板，接种浓度为8×108 L-1细胞悬液100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中过夜。次日，进行质粒与miRNA共转染：将30 pmol miRNA加入125 μL的无血清高糖DMEM培养基中，混匀；将4 μg质粒加入125 μL的无血清DMEM培养基(美国Gibco公司)中，混匀；在125 μL的无血清高糖DMEM培养基中加入5 μL Lipofectamine™ 2000 (Lipofectamine™ 2000转染试剂盒，美国Thermo Fisher Scientific公司)，柔和混匀；在125 μL的无血清高糖DMEM培养基中加入10 μL Lipofectamine™ 2000，柔和混匀；室温放置5 min；分别将稀释好的miRNA与Lipofectamine™ 2000混合，柔和混匀，室温放置20 min，以便形成miRNA/Lipofectamine™ 2000复合物；将质粒稀释培养液与Lipofectamine™ 2000稀释培养液混匀，室温下放置 20 min，从而形成质粒/Lipofectamine™ 2000复合物；分别将250 μL质粒/Lipofectamine™ 2000复合物、miRNA/Lipofectamine™ 2000复合物加入到含细胞和培养基的培养板孔中，混匀；转染48 h后，进行后续检测；弃旧培养基，用PBS清洗2次，将100 μL的PLB(Passive Lysis Buffer)(美国Promega公司)分别加入每孔中，室温下振摇15 min，最后收集细胞裂解液；在发光板上加20 μL细胞裂解液，采用酶标仪(Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司)读取背景值2 s；在每个样品中加入100 μL LARⅡ工作液(美国Promega公司)，快速混匀后读值2 s；在每个样品中再加入100 μL Stop Glo® Reagent(美国Promega公司)，快速混匀后再次读值 2 s；保存数据，进行数据分析。
1.4.9 Western blot检测 用miR-140-5p inhibitor(上海吉玛制药技术有限公司)干预6孔板中的细胞，inhibitor浓度为20 μmo/L，每孔加入5 μL。作用48 h后收集293T细胞，利用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(Pierce® BCA蛋白定量分析试剂盒，美国Thermo Fisher Scientific公司)测浓度后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，下一步转印至PVDF膜，用体积分数5%牛奶封闭1 h，接着加入兔源ULK1蛋白(1∶1 000稀释)或兔源GAPDH蛋白(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；第2天用TBST洗膜后，分别加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶2 000稀释；ULK1蛋白一抗、GAPDH蛋白一抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，美国Proteintech公司)，室温下孵育1 h，再次用TBST洗膜后加入ECL发光液进行显色。
结果蛋白条带采用多功能成像系统(Tanon 5200 Multi多功能成像系统，上海天能科技有限公司)拍照，并分析条带灰度值，以ULK1灰度值/内参GAPDH灰度值的结果作为ULK1蛋白相对表达量。
1.5 主要观察指标 各组荧光素酶的表达活性及ULK1蛋白表达。
1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计学分析，分析结果以x±s表示。两组间比较采用独立样本t 检验。采用单因素方差分析对多组间均数进行比较；组间均数两两比较采用SNK法或Dunnett’s T3法，P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
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文题释义：
荧光素酶报告基因：荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
荧光素酶：可催化荧光素氧化，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
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文题释义：
荧光素酶报告基因：荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
荧光素酶：可催化荧光素氧化，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。