颈部脊髓损伤患者24 h内外周血中细胞因子水平与ASIA功能分级的相关性：对照组比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0809

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞因子(cytokine，CK)：是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。
ASIA神经功能分级：美国脊柱损伤协会ASIA神经功能分级：A级完全性损伤，骶段S4-S5无任何运动及感觉功能保留；B级不完全性损伤，神经平面以下，包括骶段S4-S5存在感觉功能，但无任何运动功能；C级不完全性损伤，神经平面以下有运动功能保留，一半以上的关键肌肌力< 3级；D级不完全性损伤，神经平面以下有运动功能保留，一半以上的关键肌肌力≥ 3级；E级正常，感觉和运动功能正常。

摘要
背景：研究表明细胞因子在脊髓损伤的病理生理机制中发挥着至关重要的作用。直接或者间接的抑制或者减轻脊髓损伤后免疫炎性反应，能够改善患者的预后以及神经功能的恢复。
目的：分析颈部脊髓损伤早期(< 24 h)患者外周血中的白介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1和干扰素γ水平的变化与ASIA神经功能分级的相关性，并探讨细胞因子介导的免疫炎症反应在颈部脊髓损伤发病机制中的作用。
方法：30例颈部脊髓损伤患者为脊髓损伤组，另外20例健康的血液捐献者为对照组。采集外周静脉血，并使用酶联免疫吸附(ELISA法)测定外周血中细胞因子水平。脊髓损伤组依据ASIA分级分成A级10例为完全性脊髓损伤组，B级+C级+D级+E级20例为不完全性脊髓损伤组。
结果与结论：①脊髓损伤组外周血中白细胞介素1β、白细胞介素6和转化生长因子β1水平均明显高于对照组；②颈部脊髓损伤患者中完全性脊髓损伤组外周血中转化生长因子β1水平明显高于不完全性脊髓损伤组(P < 0.01)；③结果说明，颈部脊髓损伤早期患者外周血中白细胞介素1β、白细胞介素6和转化生长因子β1的水平升高；颈部脊髓损伤患者外周血中转化生长因子β1水平与脊髓受损的严重程度有相关性，提示颈部脊髓损伤后患者神经系统功能缺失的程度与免疫反应之间存在着一定的联系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2635-8345(张勇)

关键词: 颈部脊髓损伤, ASIA分级, 神经功能, 细胞因子, 白细胞介素1β, 白细胞介素6, 转化生长因子β1, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Cytokines play a critical role in the pathophysiologic mechanism of spinal cord injury (SCI). Direct or indirect inhibition or alleviation of immune inflammatory reactions following SCI can improve the patient’s prognosis and recovery of neurologic function.
OBJECTIVE: To investigate the correlation between the levels of interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor-α, transforming growth factor-β1 and interferon-γ in the peripheral blood of patients with early cervical SCI and the American Spinal Injury Association (ASIA) impairment scale, and explore the role of cytokine-mediated immune inflammatory responses in the pathogenesis of cervical SCI.
METHODS: Thirty patients with cervical SCI and 20 healthy controls were enrolled. The levels of related cytokines in the peripheral blood were detected by ELISA. According to the ASIA impairment scale, all patients were divided into two groups: complete SCI group (Grade A, 10 cases) and incomplete SCI group (Grade B+C+D+E, 20 cases).
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of interleukin-1β, interleukin-6 and transforming growth factor-β1 in the peripheral blood in the SCI patients were significantly higher than those in the control group. The level of transforming growth factor-β1 in the peripheral blood of the complete SCI patients was significantly higher than that of incomplete SCI patients. Our findings imply that the levels of interleukin-1β, interleukin-6 and transforming growth factor-β1 in the peripheral blood of patients with cervical SCI in early period are increased significantly, and the level of transforming growth factor-β1 is associated with the severity of SCI, suggesting that there is a correlation between dysfunction of nervous system and immune response post-cervical SCI.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Spinal Cord Injuries, Cytokines, Interleukin-1beta, Interleukin-6, Transforming Growth Factor beta1, Tissue

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析包括30例颈部脊髓损伤的患者和20名健康的血液捐献者在内的50例受试者的资料全部进入结果分析，数据无脱落。颈部脊髓损伤组和对照组分组流程图见图2。

2.2 健康捐献者和颈部脊髓损伤患者的特征比较根据ASIA 功能障碍评分标准对脊髓损伤组内30例患者在受伤后24 h以内进行ASIA评分，得到A级10例，B级9例，C级5例，D级6例和E级0例，进一步将其分成完全性脊髓损伤组(A级，10例)，不完全性脊髓损伤组(B级+C级+D级+E级，20例)。两组基线特征比较见表1。

2.3 颈部脊髓损伤组与对照组外周血中细胞因子水平比较白细胞介素1β水平：脊髓损伤组显著高于对照组[(13.58±0.80)，(6.193±0.80) ng/L，t=6.291，P < 0.000 1]；白细胞介素6水平：脊髓损伤组显著高于对照组[(11.12± 0.78)，(8.34±0.35) ng/L，t=3.232，P=0.002 5< 0.01]；白细胞介素10水平：两组差异无显著性意义[(4.35±0.26)，(4.493±0.23) ng/L，t=0.3873，P=0.700 2> 0.05]；肿瘤坏死因子α水平：两组比较差异无显著性意义[(29.52± 0.18)，(28.5±0.66) ng/L，t=1.488，P=0.151 2 > 0.05]；转化生长因子β1水平：脊髓损伤组显著高于对照组 [(16 505±1 510)，(5 028.0±784.9) ng/L，t=6.745，P < 0.000 1]；IFN-γ水平：两组比较差异无显著性意义(35.86± 0.11)，(35.72±0.059) ng/L，t=1.165，P=0.250 3> 0.05)。见图3。

2.4 完全性脊髓损伤组与不完全性脊髓损伤组外周血中各细胞因子水平比较两组白细胞介素1质量浓度比较，差异无显著性意义(t=1.56，P > 0.05)；两组白细胞介素6质量浓度比较，差异无显著性意义(t=0.560 2，P > 0.05)；完全性脊髓损伤组外周血中转化生长因子β1水平显著高于不完全性脊髓损伤组(t=9，P < 0.0001)。见表2和图4。

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引言

脊髓损伤是一种高致残率的灾难性疾病，通常会导致不同程度的运动、感觉功能缺失和自主功能紊乱等一系列不可逆的神经系统损伤，同时继发多种严重的并发症，并进一步导致机体内环境的紊乱和病理生理功能障碍，甚至导致死亡^[1]。这一疾患不仅给患者个人带来了生理和情感永久的创伤，甚至是毁灭性的打击，同时对家庭、社会以及医疗机构也造成了巨大的经济负担和压力。脊髓损伤常常是由交通事故、枪伤或其他各种形式的暴力造成，伤者多为青壮年和老年人。脊髓损伤的年发生率在全球范围内有所不同^[2]，但随着人类活动范围和空间的扩大，发病率呈现上升趋势^[3-4]。此外，颈部脊髓损伤是脊髓损伤中最常见的损伤，约占75%^[5]。

多年来，关于脊髓损伤的研究已经非常广泛并且不断深入，作者对脊髓损伤的认识也在逐渐加深，但是其发病的病理生理机制并未完全阐明。目前，越来越多的证据和大多数研究者认为，脊髓损伤的机制涉及到原发性损伤和继发性损伤^[6-10]。原发性损伤通常是由直接或者间接的暴力作用于脊髓引起的不可逆损伤，包括最初的机械损伤，如椎体、血肿以及韧带等对脊髓和血管的牵拉和压迫；而继发性损伤是在此基础之上引起的一系列可逆的且可调控的复杂的免疫炎性反应。

20世纪初，艾伦最先突出提出了继发性损伤理论^[11]，他指出微血管损伤、水肿、缺血、兴奋毒性、电解质失衡、自由基生产、免疫应答和细胞死亡等多种病理生理学的变化导致神经细胞死亡、炎症、脱髓鞘损伤和轴突损伤，从而导致神经系统功能的缺失。而且，早期的损伤导致的炎症反应能够诱发产生一些列效应细胞和分子水平的变化，在这一过程中，涉及了多种细胞因子、免疫细胞和自由基等化学分子参加的自我破坏性的级联反应^[12-13]。近年的研究也揭示了细胞因子在脊髓损伤发病机制中的调节作用和联系^[14-16]，表明细胞因子在脊髓损伤的病理生理机制中发挥着至关重要的作用。因此，直接或者间接的抑制或者减轻脊髓损伤后免疫炎性反应，能够改善患者的预后以及神经功能的恢复。

此次试验分析颈部脊髓损伤早期患者外周血中细胞因子水平和ASIA神经功能分级的相关性，从而进一步探讨这些细胞因子在脊髓损伤的发病机制中可能起到的作用。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计以外周血中细胞因子的酶联免疫吸附测定(ELISA法)为基础的试验研究。

1.2 时间及地点病例均收集自2016年3月至2017年2月安徽医科大学第一附属医院脊柱外科。

1.3 对象颈部脊髓损伤患者30例为脊髓损伤组。均进行了完整的X射线、CT及MRI等影像学检查并保存有完整的病历资料。经过2位从事脊柱外科的主治医师及以上级别的骨科医师共同确诊为颈部脊髓损伤。30例患者中男/女为21/9，年龄34-70岁，平均54.9岁。对照组中20例健康血液捐献者均来自于合肥市中心血站，所有个体均不存在以下排除标准的因素。对照组20例志愿者男/女为12/8，年龄36-74岁，平均53.45岁。

1.3.1 脊髓损伤患者纳入标准 ①患者均符合脊髓损伤的诊断标准；②未合并其他严重外伤、感染疾病等；③纳入患者对实验知情同意，并签署知情同意书。

1.3.2 排除标准 ①非创伤性脊髄损伤的病例，包括肿瘤压迫引起的病理性脊髓损伤、医源性脊髄损伤和慢性脊髓压迫等；②血传染性疾病，如艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等；③既往存在神经肌肉病变的患者；④存在精神疾病的患者；⑤既往有中枢神经系统疾病，如颅脑外伤、脑血管疾病、截瘫、脑炎等；⑥严重过敏或者感染性疾病；⑦有癌症、自身免疫病等；⑧接受激素冲击治疗、抗生素治疗、接受免疫抑制或者免疫调节治疗，以及近期接种疫苗者；⑨任何可能干扰免疫反应的疾患或治疗等。

所有受试者均知晓并自愿加入此次试验，在试验前均签署了知情同意书，且得到医院伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 血样本收集所有的血样本均采集自患者和健康捐献者的外周静脉，采血时间均在上午8至10时，脊髓损伤患者的血样本均在受伤24 h以内采集。收集的血液临时储存在6 mL的EDTA抗凝管内，随后立即离心15 min (2-8 ℃，1 000×g)并收集血浆，-80 ℃冰箱储藏以备检测。实验全程均注意无菌操作，避免样本污染。

1.4.2 ASIA分级国际标准神经和脊髓损伤的功能分类(ISNCSCI)是由美国脊髓损伤学会(ASIA)在1982年首次发表。目前其第七版国际脊髓损伤的神经学分类标准仍是广泛用于脊髓损伤后感觉和运动障碍分类的文献依据^[17]。ISNCSCI是基于测试在每个皮节上神经系统反应、触觉和针刺感觉，以及控制身体两侧的10个关键动作的肌肉的力量，包括髋关节屈曲(L₂)，耸肩(C₄)，屈肘(C₅)，手腕伸展(C₆)和肘部伸展(C₇)^[18]。

基于ASIA功能障碍评分，创伤性脊髓损伤分为5类： A：完全性损伤，骶段S₄-S₅无任何运动及保留感觉功能；B：不完全性损伤，神经平面以下，包括骶段S₄-S₅存在感觉功能，但无任何运动功能；C：不完全性损伤，神经平面以下有运动功能保留，一半以上的关键肌肌力< 3级；D：不完全性损伤，神经平面以下有运动功能保留，一半以上的关键肌肌力≥ 3级；E：正常，感觉和运动功能正常。

1.4.3 检测细胞因子水平采用酶联免疫吸附技术(双抗体夹心法)，实验中每一个细胞因子的测定均在同一批次实验完成。酶联免疫吸附测定(ELISA法)试剂盒，均由深圳市达科为生物有限公司提供。实验方法与步骤见流程图1。

1.5 主要观察指标脊髓损伤组和对照组外周血中白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1和IFN-γ等细胞因子水平比较，以及完全性脊髓损伤组和不完全性脊髓损伤组相应细胞因子水平的比较。

1.6 统计学分析该研究中使用软件GraphPad Prism 7.00版本对实验数据进行统计学分析。连续变量以x(_)±s_x(-)表示，两组独立样本比较采用t 检验。分类变量以频数或百分比表示，显著性检验采用卡方检验。该研究中P < 0.05说明差异有显著性意义。

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讨论

3.1 白细胞介素1β和白细胞介素6在脊髓损伤发病机制中的作用脊髓损伤涉及多种病理生理机制，其中以免疫系统的激活和效应为主。一方面，脊髓损伤后会刺激机体产生自身免疫应答反应，生成的部分细胞因子可以诱导免疫细胞产生神经营养因子，进一步保护神经系统、加快损伤脊髓的功能恢复；另一方面，脊髓损伤后也诱发了一系列的免疫炎性反应，细胞因子之间的炎症级联反应进一步加重了脊髓损伤的程度^[19]。包括促炎性细胞因子和抗炎细胞因子在内的细胞因子均参与了免疫反应的调节，这些细胞因子在免疫细胞之间、免疫细胞和其他细胞之间以及细胞免疫激活中发挥着关键的调节作用，其中最主要的也是研究最多的细胞因子包括白细胞介素1β和白细胞介素6等。

白细胞介素1β和白细胞介素6是能发挥广泛生物学活性的促炎性细胞因子和多肽调节因子，在炎症反应及免疫调节等方面发挥着重要作用，同时也可能是一种间接的神经毒素^[20]。此外，其来源及生成也非常广泛，主要由活化的巨噬细胞/小胶质细胞分泌，但机体内多种细胞如B细胞、T细胞、单核细胞、纤维母细胞和内皮细胞都能产生白细胞介素1β和白细胞介素6^[21-22]。也有研究认为，中枢神经系统中小胶质细胞和星形胶质细胞也能分泌白细胞介素1β和白细胞介素6^[23]。

在脊髓损伤的早期，中枢神经系统中神经元和神经胶质细胞分泌产生细胞因子，其中早期即出现升高的白细胞介素1β和白细胞介素6不仅能调节中枢神经系统内细胞生长和功能^[24]，同时也参与中枢神经内的炎症反应和免疫反应。脊髓损伤后多种细胞因子和免疫活性物质的水平升高并持续存在，这一现象可能是造成神经损伤区域扩大、炎症反应加重和触发损伤后继发免疫损伤的重要因素^[25]。其中，白细胞介素1β是属于白细胞介素1家族由白细胞介素1B基因编码的细胞因子成员，在免疫炎症反应中起着至关重要的作用。白细胞介素1β含量的增加能上调各种黏附分子的功能及数量，进而导致炎性细胞在微血管内皮细胞表面聚集、黏附，并迁移到受损部位而加剧炎症反应；此外，白细胞介素1β水平的上升还能增强中性粒细胞以及单核细胞等多种趋化因子表达，促使损伤区域内大量炎症细胞浸润^[26]。白细胞介素1β也能诱导其他相关细胞因子以及炎性介质的释放，对氧自由基和兴奋性氨基酸的生成也有部分作用^[20^，^27]。而且，白细胞介素1β能激活小胶质细胞，进而破坏血脊髓屏障并加剧损伤^[28]。

白细胞介素6作为一种多功能细胞因子，其可被多种淋

巴细胞和非淋巴细胞自发或者在多种因素刺激下产生^[29]。不仅B细胞、T细胞和内皮细胞等能产生白细胞介素6，同时白细胞介素1和肿瘤坏死因子α对白细胞介素6的产生具有调节和促进作用。有报道认为，白细胞介素6能够作为反应损伤程度的早期指标^[30]。目前的研究表明白细胞介素6既有促炎作用^[31-32]，又有抗炎作用的双重功能^[33]。一方面，白细胞介素6能够刺激刺激炎症细胞聚集、激活和炎症递质的释放，细胞生长，促进细胞分化，加速肝细胞急性期蛋白的合成；调节肿瘤细胞的生长和分化；白细胞介素6诱导组织中成纤维细胞、软骨细胞等内的金属蛋白酶的抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)^[34]，金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂1的平衡调节结缔组织中胶原等细胞外基质的降解；另一方面，白细胞介素6作为创伤后炎症反应及微血管损伤的重要介质, 可刺激星形胶质细胞增生, 促进神经元的修复, 加速瘢痕形成, 同时又可促进星形胶质细胞分泌神经营养因子如神经生长因子, 且自身也具有神经生长因子样作用^[35]。

该实验结果表明，颈部脊髓损伤的患者早期外周血中白细胞介素1β和白细胞介素6的水平明显高于对照组，有统计学意义，表明白细胞介素1β和白细胞介素6与颈部脊髓损伤有着密切的关系，并且在颈部脊髓损伤的发病机制中起着重要作用。此实验结果于国内外多数研究结果是一致的。然而白细胞介素1β和白细胞介素6的作用机制尚未完全阐明，有待于进一步探究。同时，在以ASIA功能分级为基础的完全性脊髓损伤组外周血中白细胞介素1β和白细胞介素6的水平较不完全性脊髓损伤组相比差异无统计学意义，这说明白细胞介素1β和白细胞介素6的水平与颈部脊髓损伤患者神经损伤的严重程度无明显的相关性，但这也可能是该实验中的样本量过少导致。

总之，白细胞介素1β和白细胞介素6在颈部脊髓损伤发病的早期可能发挥着至关重要的作用，对机体免疫炎性反应起着促进的作用，因此，可以实验性使用白细胞介素1β和白细胞介素6受体拮抗剂作为抑制脊髓损伤病情进展和控制免疫反应的一种方法。

3.2 转化生长因子β1在脊髓损伤发病机制中的作用转化生长因子β1是属于转化生长因子β家族的多肽类生长因子，是一种受到严格调控的有效的多功能细胞因子，影响着组织创伤修复、细胞的生长、分化和免疫、炎症和基因表达等^[36]。这种生物活性分子广泛存在于骨、软骨基质以及血小板等几乎所有组织中，并与细胞受体结合后被激活^[37]。在脊髓损伤的早期，外周血中转化生长因子β1的水平会升高且持续存在^[38-39]。转化生长因子β1在不同的组织和器官组发挥着重要的生物学效应^[40]。

有研究认为，尽管名为转化生长因子，实际上它却抑制了多种不同细胞谱系的增殖^[41]，而这种原始的“转化”活性很可能是由于对基质产生的和其他生长因子的合成二次作用。也有报道称，转化生长因子家族成员在间充质分化中起着至关重要的作用^[42]，例如转化生长因子β1可诱导间充质干细胞向软骨细胞分化^[43]。也有研究表明转化生长因子β1能够促血管生长活性、诱导软骨生长板内血管的形成并加速成骨进程^[44]，进而促进骨折合并脊髓损伤患者的骨折愈合。

Aigner等^[45]认为转化生长因子β1在中枢神经损伤、神经保护、星形胶质细胞表形、炎症反应以及血管生成等方面发挥作用。Tyor等^[46]发现转化生长因子β1能够减少脊髓损伤部位及周围单核吞噬细胞的浸润，以此减轻继发性损伤的炎性反应。Ihn和Mittaud^[47-48]认为转化生长因子β1能够刺激成纤维细胞和星形胶质细胞的增殖从而阻碍神经再生。Letterio和Wahl^[49-50]认为转化生长因子β1对外周单核细胞产生激活效应并且能够刺激各种细胞因子(如白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α)、趋化因子(如单核细胞趋化蛋白1)和生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子)的合成以及增加整合素的表达。但是Werner和Feinberg^[51-52]认为转化生长因子β1对成熟巨噬细胞主要是抑制作用，并且抑制促炎细胞因子和趋化因子的合成以及活性氧的产生。Kohta等^[53]的研究发现通过抗转化生长因子β1抗体治疗来抑制的活性能够促进脊髓损伤后运动功能的恢复，而且这种功能的改善同时伴随着胶质瘢痕形成的减少和小胶质细胞/巨噬细胞的活化增强，为神经网络的恢复提供了有利的环境，也可能与轴突的生长有关，这一研究成果也支持了使用转化生长因子β1抑制剂治疗脊髓损伤、促进神经功能恢复的可能性。

此次实验结果表明，颈部脊髓损伤患者的早期外周血中转化生长因子β1水平明显高于对照组，表明转化生长因子β1与颈部脊髓损伤有着密切的关系，并且在颈部脊髓损伤的发病机制中起着重要作用。然而转化生长因子β1的作用机制仍未完全阐明，有待于进一步探究。同时，在以ASIA功能分级为基础的完全性脊髓损伤组外周血中转化生长因子β1水平明显高于不完全性脊髓损伤组且有统计学意义，这说明转化生长因子β1的水平与颈部脊髓损伤患者神经损伤的严重程度存在相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程