牙髓干细胞共培养改善1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的神经元凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0524

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
牙髓干细胞：具有获取容易、自我更新、增殖能力强等特点，日益受到广泛关注。已有相关报道，牙髓干细胞在体外对中脑神经元起到支持作用，并能分化为神经元，且将牙髓干细胞与中脑神经元联合培养后移植到帕金森病模型内，牙髓干细胞通过分泌神经营养因子，对1-甲基-4-苯基吡啶离子导致的神经损伤起到保护作用。
1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP⁺)：由一种神经毒剂1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶在黑质细胞内脱氢生成，能够选择性的损害黑质多巴胺能神经元，能够抑制线粒体复合酶，使细胞死亡，并导致出现类似于帕金森病的症状。目前MPP⁺被广泛用于帕金森病的各种细胞和动物模型研究。

摘要
背景：如何利用牙髓干细胞改善神经损伤对于神经退行性疾病的临床治疗具有重要的意义。
目的：探讨牙髓干细胞共培养对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP⁺)诱导的神经元凋亡的影响。
方法：分离培养人牙髓干细胞，进行形态观察和成脂成骨诱导分化能力鉴定；分离中脑神经元细胞，利用Transwell小室进行牙髓干细胞和神经元共培养，然后加入MPP⁺干预48 h，通过Tunel染色和western blot法检测牙髓干细胞对MPP⁺诱导的神经元凋亡的影响。
结果与结论：①牙髓干细胞形态呈梭形，且能够成功向成脂成骨方向诱导分化；②牙髓干细胞和神经元细胞共培养后，减轻了MPP⁺诱导的神经元凋亡；③MPP⁺处理后降低了Bcl-2的表达，促进了Bax和cleaved caspase3的表达，而在牙髓干细胞共培养条件下，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显上升，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase3表达明显下降；④结果表明，人牙髓干细胞可以保护或修复体外MPP⁺诱导的神经元损伤，该保护作用可能是通过人牙髓干细胞的旁分泌作用来实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4520-6988(朱虹倩)

关键词: 牙髓干细胞, MPP⁺, 神经元细胞, Transwell共培养, 细胞凋亡, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: How to ameliorate neural injury by dental pulp stem cells is of clinical benefit for neurodegenerative diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effect of co-culture with dental pulp stem cells (DPSCs) on 1-methyl-4-phenyl pyridinium (MPP⁺)-induced apoptosis of neurons.
METHODS: Human DPSCs were isolated and identified by morphological observation, adipogenic and osteogenic differentiation. Rat midbrain neurons were isolated and co-cultured with DPSCs by Transwell. After treatment with MPP⁺ for 48 hours, the neurons were observed in morphology, and the effect of DPSCs on neuronal apoptosis induced by MPP⁺ was detected by western blot and TUNEL staining.
RESULTS AND CONCLUSION: DPSCs were spindle-like cells capable of differentiating into adipogenesis and osteogenesis. The apoptosis of neurons induced by MPP⁺ were alleviated via co-culture with DPSCs. Further detection by western blot showed that the neurons treated with MPP⁺ reduced the expression of Bcl-2 and promoted the expression of Bax and cleaved caspase3; however, the changes in the expression of these proteins were reduced under the co-culture system of DPSCs. All the above results reveal that DPSCs may repair or prevent neuronal injury induced by MPP⁺ through paracrine actions.

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Key words: Dental Pulp, Stem Cells, Neurons, Coculture Techniques, 1-Methyl-4-phenylpyridinium, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱虹倩. 牙髓干细胞共培养改善1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的神经元凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2727-2732.

Zhu Hong-qian. Co-culture with dental stem cells ameliorates neuronal apoptosis induced by 1-methyl-4-phenyl pyridinium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2727-2732.

图/表（结果） 1

2.1 牙髓干细胞的分离和鉴定结果 倒置显微镜下观察牙髓干细胞为成纤维细胞样生长(图1A)。为了进一步确定分离细胞即为牙髓干细胞，进行了成脂和成骨诱导以验证其多能性，经成骨诱导培养液培养后茜素红染色呈阳性(图1B)；经成脂诱导培养液培养后油红O染色呈阳性(图1C)。

2.2 牙髓干细胞共培养可减轻MPP⁺对神经元的损伤 为观察牙髓干细胞对MPP⁺所致神经元的氧化应激损伤是否具有保护作用，采用Transwell小室将牙髓干细胞与中脑神经元进行共培养，随后使用MPP⁺损伤中脑神经元以建立帕金森病细胞模型。未经处理的中脑神经元(对照组)形态饱满，细胞突起连续并不断延伸，生长状态良好(图2A)；MPP⁺组细胞胞体大量萎缩、碎裂，细胞突起断裂消失，大量细胞死亡，状态极差(图2B)；MPP⁺+牙髓干细胞组细胞的胞体饱满度、形态和突起、存活情况较MPP⁺组明显改善(图2C)。进一步的MTT结果显示，原代中脑神经元经MPP⁺处理后其细胞存活数较对照组显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05，图2D)；MPP⁺+牙髓干细胞组细胞存活数较单纯MPP⁺组显著提高，差异有显著性意义(P < 0.05，图2D)。以上结果一致提示，牙髓干细胞共培养可有效减轻MPP⁺对中脑神经元的损伤而起到保护神经元的作用。

2.3 牙髓干细胞共培养对MPP⁺诱导的神经元凋亡的影响 为进一步明确牙髓干细胞对MPP⁺诱导的神经元损伤的影响，进一步检测和观察了牙髓干细胞对MPP⁺诱导的神经元凋亡的影响。正常培养的对照组神经元仅有极少量细胞出现凋亡情况(图3A-C)；经MPP⁺处理之后，MPP⁺组神经元的凋亡较对照组显著增加(图3D-F)；相反，与牙髓干细胞预先共培养的MPP⁺+牙髓干细胞组细胞凋亡则较MPP⁺组显著减少(图3G-I)。统计结果(图3J)显示，MPP⁺组细胞凋亡比例较对照组显著升高(P < 0.05)；而MPP⁺+牙髓干细胞组细胞凋亡比例则较MPP⁺组显著降低(P < 0.05)；以上结果提示牙髓干细胞可显著减轻MPP⁺诱导的神经元凋亡。

2.4 牙髓干细胞共培养对神经元凋亡相关蛋白表达的影响 为深入探索牙髓干细胞减轻MPP⁺诱导的神经元凋亡的分子机制，进一步检测了各组细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3和Casepase3等凋亡相关蛋白的表达变化。经MPP⁺处理之后，MPP⁺组的促凋亡蛋白Bax表达较对照组明显升高，而保护性蛋白Bcl-2的表达则显著下调，二者间差异有显著性意义(P < 0.05，图4A，B)；与牙髓干细胞预先共培养后，MPP⁺+牙髓干细胞组的促凋亡蛋白Bax表达较MPP⁺组明显降低，而保护性蛋白Bcl-2的表达则显著上调，两组间差异有显著性意义(P < 0.05，图4 A，B)；Cleaved caspase3被认为是凋亡的标志性蛋白，经MPP⁺处理之后，MPP⁺组的促凋亡蛋白Cleaved caspase3表达较对照组明显升高(P < 0.05，图4C，D)，与牙髓干细胞预先共培养后，MPP⁺+牙髓干细胞组细胞Cleaved caspase3表达较MPP⁺组明显降低(P < 0.05，图4C，D)。以上结果提示牙髓干细胞很可能是通过凋亡相关蛋白来减轻MPP⁺诱导的神经元凋亡。

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引言

帕金森病是多发于老年人的一种常见退行性疾病，其以黑质致密部中脑神经元的进行性死亡为主要病理特征^[1]，主要表现在静止性震颤、肌肉僵硬、动作缓慢、步态异常等一系列运动功能障碍^[2-3]。

帕金森病所致运动功能障碍严重影响患者的日常生活能力，降低生活质量，给家庭和社会造成了沉重的经济负担。然而，目前临床上仍旧缺乏针对帕金森病的有效且特异的治疗方法，原因在于帕金森病的发病机制至今仍未完全阐明。尽管如此，现有的证据提示年龄老化^[4]、线粒体功能异常^[5]、自由基集聚^[6]、环境毒素等因素所致的氧化应激失衡在其发病中起着极其重要的作用^[7-8]，即中脑神经元的氧化反应产生活性氧并引起活性氧含量的失衡，最后导致氧化应激损伤和细胞死亡^[8]。因此，寻找各种自然源性、内源性及生物性抗氧化剂，以减轻氧化应激对中脑神经元的损伤而促进更多神经元的存活和保留成为国内外学者研究的热点，也是寻找帕金森病潜在治疗靶点的重要方向。

牙髓干细胞是从牙髓组织中分离得到的成体干细胞，这种干细胞的获得过程简单且不会产生二次损伤和道德争议而受到干细胞研究者和临床医生的青睐^[9]。此外，与其他类型的成体干细胞相比，牙髓干细胞还具有增殖快、修复能力强、免疫排斥低和更好的可塑性等优势^[10]。最为重要的是牙髓干细胞是由外胚层的神经嵴干细胞发育而来，因此其兼具间充质干细胞和神经嵴干细胞的生物学特征^[11]，这为其在神经系统疾病中的应用奠定了良好的基础。前期已有研究证明牙髓干细胞在体内外均可以分化成胶质细胞和神经元^[12-13]，且其神经分化能力要强于其他间充质干细胞^[14]。最新的许多体内外实验表明牙髓干细胞可以阻止或修复神经性损伤^[15-18]，且已经在大脑和脊髓损伤的动物模型上观察到了治疗效果^[14^，^19]。

牙髓干细胞由于其独特的生物学特性和潜能已被认为在未来神经系统疾病的潜在治疗中极具前景^[20]。实验拟在体外用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP⁺)原代培养中脑神经元建立帕金森病细胞模型，并观察牙髓干细胞与之共培养时能否减轻MPP⁺对神经元的损伤而起到对中脑神经元的保护作用。

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材料方法

1.1 设计 细胞学形态观察实验。

1.2 时间及地点 2016年1月至2017年3月在西南医科大学附属口腔医院完成。

1.3 材料

1.3.1 新鲜牙髓组织块 来源于西南医科大学附属口腔医院就诊的因正畸减数拔除恒牙的患者。患者及家属签署了知情同意书，研究方案经西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验动物 孕15 d SD大鼠5只，SPF级，体质量(250±30) g，购于四川大学实验动物中心。

1.3.3 实验试剂和仪器 DMEM培养基、血清(美国GIBCO公司)；L-谷氨酰胺、噻唑蓝(美国Sigma公司)；Neural Basal培养基、B27、DAPI (美国Termo Fisher公司)；Anti-Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved Caspase3、GAPDH抗体(美国Abcam公司)；Tunel试剂盒(美国罗氏公司)；成脂、成骨诱导分化试剂盒(赛业生物科技有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；倒置相差荧光显微镜(日本尼康公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙髓干细胞分离培养 选取(25±5)岁患者因正畸减数拔除的健康恒牙，使用体积分数为75%乙醇进行消毒处理，并用含有青霉素和链霉素的PBS清洗3次。取出牙髓组织并剪碎，加入2%Ⅰ型胶原酶在37 ℃下消化约40 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37 ℃体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养，待细胞长至80%汇合时，消化传代。

1.4.2 牙髓干细胞成脂成骨诱导分化 将牙髓干细胞以1×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中，每3 d换1次液，直至细胞达到100%融合，移去培养基，分别加入成脂、成骨诱导液开始诱导，诱导2周后，观察脂滴和钙结节形成情况，利用油红O进行脂滴染色，茜素红进行钙结节染色。

1.4.3 大鼠中脑神经元的分离培养 用2%戊巴比妥钠麻醉SD孕鼠后，无菌环境下取出胎鼠并分离中脑组织，剪碎后，加入0.25%胰蛋白酶消化约20 min，调整细胞浓度至2×10⁸ L^-¹，接种于多聚赖氨酸包被的6孔板中，加入Neural Basal无血清培养基，置于37 ℃体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养，接种24 h后，向细胞培养液中加入5-氟脲嘧啶以抑制非神经细胞生长，每2 d半量换液，培养7 d左右用于实验。

1.4.4 人牙髓干细胞与大鼠中脑神经元共培养 取第3代牙髓干细胞，以3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于Transwell小室中，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，培养过夜后，将接种牙髓干细胞的Transwell小室与培养7 d的中脑神经元共培养，24 h后加入MPP⁺(10 μmol/L)于神经细胞培养基中，48 h后观察牙髓干细胞共培养对MPP⁺诱导的神经元损伤的影响。

1.4.5 MTT法检测细胞存活 将铺于6孔板中的中脑神经元分成3组：对照组，MPP⁺组和MPP⁺+人牙髓干细胞组，人牙髓干细胞与神经元共培养24 h后加入MPP⁺，干预48 h后，移去培养液，加入0.5 g/L的MTT 37 ℃孵育4 h，弃去MTT后加入150 μL二甲基亚砜，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，利用酶标仪检测570 nm波长下的吸光度值，每组实验至少重复3次并收集数据。

1.4.6 Tunel法检测细胞凋亡 将对照组，MPP⁺组和MPP⁺+人牙髓干细胞组中脑神经元用二甲苯浸洗2次，每次5 min，用梯度乙醇各浸洗1次，每次3 min，PBS漂洗2次，用蛋白酶K处理细胞15-30 min，PBS漂洗2次，加入Tunel反应混合液在37 ℃反应约60 min，PBS漂洗3次，加入DAPI进行细胞核染色10 min，PBS漂洗3次，封固，荧光倒置显微镜下观察细胞染色情况。

1.4.7 Western blot检测蛋白表达情况 取对照组，MPP⁺组和MPP⁺+人牙髓干细胞组中脑神经元，移去培养液，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞10 min，12 000 r/min离心10 min，提取蛋白质，采用BCA法进行蛋白定量后将其煮沸变性，取等量样品以10%的SDS-PAGE进行电泳，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸泡于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入Bcl-2，Bax，Caspase3，Cleaved Caspase3和GAPDH抗体(1︰1 000) 4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(1︰5 000)室温摇床孵育1 h，1×TBST液漂洗3遍，每遍5 min，加入化学发光底物并在凝胶成像系统进行显影，用美国国立卫生研究院开发的Image J软件对条带灰度进行分析。通过计算各组目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，对目的蛋白进行半定量并比较各组间表达水平的差异。

1.5 主要观察指标 ①牙髓干细胞的形态和成骨成脂分化能力；②牙髓干细胞共培养对MPP⁺诱导的神经元增殖、凋亡的影响；③牙髓干细胞共培养对MPP⁺诱导的神经元凋亡相关蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析 实验数据采用Image J软件进行采集，所得数据采用x(_)±s表示，利用统计分析软件GraphPad Prism进行t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

实验强有力的证明了人牙髓干细胞可以在体外帕金森病模型中发挥对神经元的有效保护作用。结果表明，人牙髓干细胞可以通过维持受损神经元的细胞形态、增加细胞的存活、降低细胞的凋亡率和保护细胞骨架等全方位、多角度对MPP⁺诱导的中脑神经元损伤起到保护作用，而且该保护作用可能是通过调节凋亡或存活相关蛋白的平衡来实现的。

干细胞作为具有多向分化潜能的万能细胞，其在软骨再生以及心肌细胞和神经细胞等不可再生细胞的替代治疗方面具有非常广阔的前景^[21-22]。然而由于其获取途径及其独特生物学特性等方面因素，其在临床上的应用也面临道德争议、致瘤性、促瘤性和免疫原性等一系列的风险，这为其临床应用带来了不小的障碍和困扰^[23-24]。人牙髓干细胞取自人体自身，不存在道德方面的问题，兼具间充质干细胞和神经嵴干细胞的生物学特征，而且也不存在免疫原性。与前期文献报道不同的是，实验中两种细胞的共培养并不是将二者混合后直接共培养，而是采用Transwell小室方法将两种细胞分两层并使用不同培养液进行培养，这样既避免了发生细胞污染和细胞间相互接触，同时又不影响两种细胞间各种分泌的信号分子的传递。作者在实验中发现两种细胞虽然没有直接接触，但是共培养仍然展现出对MPP⁺诱导的神经元损伤的显著保护作用，因此有理由推测其对神经元的保护作用很可能是通过牙髓干细胞分泌的神经营养因子、神经生长因子及其他各种细胞因子作用于受损神经元来实现的。这与先前Caplan^[25]报道的结果类似，该研究中发现在干细胞移植治疗期间，超过90%的干细胞都几乎立即丢失，然而却依然展现出治疗效果，因此作者猜测其最终的治疗效果很可能是通过干细胞的旁分泌功能实现的。而就牙髓干细胞而言，已有文献报道明确表明，该细胞具有强大的旁分泌功能，其可以分泌包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子等一系列重要细胞因子^[26]。前期在阿尔茨海默病研究中也发现牙髓干细胞与原代海马神经元共培养后再采用Aβ_1-42建立阿尔茨海默病细胞模型时，Aβ_1-42所致的神经元死亡和损伤较对照组显著减轻^[27]，而作者所进行的研究不仅进一步证实牙髓干细胞对神经元损伤的保护作用，还将其作用的领域由阿尔茨海默病拓展到帕金森病模型中，这为进一步深入研究牙髓干细胞的保护作用提供了重要支持和理论线索。

Bax和Bcl-2蛋白均为Bcl-2家族的重要蛋白，二者与各种原因激发的细胞凋亡密切相关^[28-29]，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而相反Bax则被认为是促凋亡蛋白，通常认为Bax/Bcl-2的比值决定了受损细胞死亡或者凋亡的最终命运^[30]。结果显示，MPP⁺处理显著上调了中脑神经元Bax蛋白水平，同时下调了Bcl-2表达水平，提示MPP⁺处理可诱导和促进神经元细胞的凋亡。然而，预先与牙髓干细胞共培养之后，其细胞中Bax水平较MPP⁺组明显回落，而抗凋亡蛋白Bcl-2水平却明显上升。这些结果提示牙髓干细胞对MPP⁺诱导神经元损伤的保护可能部分归功于其对MPP⁺暴露之后中脑神经元内Bax和Bcl-2蛋白水平的调控。

总之，当前研究结果有力证明人牙髓干细胞可以保护或修复体外帕金森病模型中MPP⁺诱导的神经元损伤，该保护作用可能是通过牙髓干细胞分泌的各种细胞因子的作用来实现的，且牙髓干细胞对凋亡相关蛋白平衡的调节在其中也起着重要作用。结果提示人牙髓干细胞在预防和治疗帕金森病及其他神经退行性疾病中可能为患者带来潜在的益处并具有良好的临床应用前景。

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