骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0435

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 680-685.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0435

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骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织细胞凋亡的影响

孙经淞¹，周雪颖²，曲淑贤³，步同静⁴，李双月²

¹大连医科大学附属第一医院，辽宁省大连市 116011；大连医科大学，²公共卫生学院，³肿瘤干细胞研究院，辽宁省大连市 116044；⁴大连市公安局公安医院，辽宁省大连市 116011

修回日期:2017-10-22 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 李双月，博士，副教授，大连医科大学公共卫生学院，辽宁省大连市 116044
作者简介:孙经淞，男，1988年生，辽宁省大连市人，汉族，2014年大连医科大学毕业，硕士，主要从事神经毒理相关研究。并列第一作者：周雪颖，女，1992年生，河北省邢台市人，汉族，2015年大连医科大学毕业，硕士，主要从事干细胞相关研究。

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation inhibits apoptosis in the rat spinal cord injured by acrylamide

Sun Jing-song¹, Zhou Xue-ying², Qu Shu-xian³, Bu Tong-jing⁴, Li Shuang-yue²

¹First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China; ²School of Public Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ³Institute of Cancer Stem Cells, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ⁴Public Security Hospital of Dalian, Dalian 116011, Liaoning Province, China

Revised:2017-10-22 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Li Shuang-yue, M.D., Associate professor, School of Public Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Sun Jing-song, Master, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China. Zhou Xue-ying, Master, School of Public Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China. Sun Jing-song and Zhou Xue-ying contributed equally to this work.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
丙烯酰胺：一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品在高温烹调下容易产生丙烯酰胺。生产劳动过程中由于通风不良或发生意外事故，经呼吸道吸入丙烯酰胺粉尘或经皮肤直接接触其水溶液而导致中毒。目前对于丙烯酰胺中毒尚没有有效的治疗方法，需要进一步探索和研究。应用骨髓间充质干细胞治疗丙烯酰胺所导致的神经中毒具有重要意义。
细胞凋亡：是基因控制的细胞自主性死亡方式，其过程又称为细胞程序性死亡。凋亡异常激活会导致细胞呈现凋亡性死亡，使组织器官结构破坏、功能障碍，甚至引起各种疾病发生。抑制凋亡的发生，对受损组织可能具有积极的修复作用。

摘要
背景：目前，针对丙烯酰胺导致的周围神经病变尚无有效的治疗方法，因此，探索新的治疗手段尤为重要。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓损伤的保护作用及机制。
方法：全骨髓贴壁法制备骨髓间充质干细胞，通过形态学观察、流式细胞仪检测表面标记物进行鉴定。将30只清洁级SD大鼠随机分成正常对照组、丙烯酰胺中毒组、骨髓间充质干细胞移植组，每组10只。丙烯酰胺中毒组大鼠给予丙烯酰胺50 mg/(kg•d)灌胃，每周连续灌胃染毒5 d，间隔2 d，共染毒2周。骨髓间充质干细胞移植组给予丙烯酰胺灌胃染毒2周后，尾静脉注射3×10⁶个骨髓间充质干细胞，每周连续5 d，共3周。5周实验结束后处死SD大鼠，分离脊髓组织，通过苏木精-伊红染色观察脊髓组织形态，Tunel法检测脊髓组织细胞凋亡水平，Western-Blotting检测脊髓组织Bcl-2和Bax的蛋白表达。
结果与结论：①丙烯酰胺中毒后，脊髓组织结构破坏，并出现明显的细胞凋亡，骨髓间充质干细胞移植后凋亡细胞显著减少、组织结构修复；②与丙烯酰胺中毒组相比，骨髓间充质干细胞移植组大鼠脊髓Bcl-2表达水平明显升高，而Bax表达水平明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果提示，骨髓间充质干细胞移植可抑制丙烯酰胺中毒导致的脊髓组织细胞凋亡，其机制可能与促进Bcl-2表达、抑制Bax表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-8030-2062(孙经淞)

关键词: 丙烯酰胺中毒, 脊髓组织, 细胞凋亡, Bcl-2, Bax, 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Until now, there is no effective treatment for peripheral neuropathy caused by acrylamide. Therefore, it is necessary to explore new treatment methods.
OBJECTIVE: To explore the protection role and its mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) against acrylamide-induced intoxication in the spinal cords of rats.
METHODS: BMSCs were cultured by the whole bone marrow adherence method and identified by morphological observation and flow cytometry detection. Thirty Sprague-Dawley rats, clean grade, were randomly divided into three groups (n=10 for each group): normal control group, acrylamide group and BMSCs transplantation group. The latter two groups received acrylamide by gavage, 50 mg/(kg•d), 5 days per week, for 2 weeks with an interval of 2 days. Then, in the BMSCs transplantation group, 3×10⁶ BMSCs were transplanted by the caudal vein, 5 days per week, for 3 consecutive weeks. Hematoxylin-eosin staining was utilized to observe the morphological changes of the spinal cord. Tunel assay was used to detect cell apoptosis. Western blot assay was adopted to detect the expression levels of Bcl-2 and Bax.
RESULTS AND CONCLUSION: In the acrylamide-exposed rats, the damage to the structure was found in the spinal cords by morphological observation, which was significantly alleviated after BMSCs transplantation. The disturbed expression levels of Bax and Bcl-2 were also significantly inversed after BMSCs transplantation (P < 0.05). These results suggest that BMSCs transplantation can inhibit cell apoptosis in the spinal cords of acrylamide-intoxicated rats, probably by up-regulating expression of Bcl-2 and down-regulating expression of Bax.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Acrylamide, Spinal Cord, Apoptosis

中图分类号:

R394.2

孙经淞，周雪颖，曲淑贤，步同静，李双月. 骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 680-685.

Sun Jing-song, Zhou Xue-ying, Qu Shu-xian, Bu Tong-jing, Li Shuang-yue. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation inhibits apoptosis in the rat spinal cord injured by acrylamide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 680-685.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的形态 原代培养细胞呈圆形，大小不一，折光性强，大多数漂浮在培养液中。培养6-8 h后细胞开始逐渐贴壁，换新的培养液除去未贴壁的细胞，在培养24 h时可见细胞形态不一，呈多角形改变，见图1A。3 d后细胞集落呈放射状排列，伸出长短不等、粗细不一的突起。胞浆丰富，核仁清晰可见，见图1B。在10-12 d细胞之间融合成片，细胞相互贴附生长，细胞排列呈螺旋状或漩涡状，见图1C。细胞生长旺盛，四至五天可传代1次，细胞形态和生长速度均未发现有明显异常，大多数呈不规则的三角形或者四边形，见图1D。

2.2 骨髓间充质干细胞表面标志物表达 通过流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物的表达，结果显示，第3代骨髓间充质干细胞的CD44、CD90阳性率均大于90%，而CD45的阳性率不足5%，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞分化能力 骨髓间充质干细胞经成骨诱导21 d后，茜素红染色显示，实验组细胞呈现广泛的橙红色，有明显的矿化结节形成，见图3A。

骨髓间充质干细胞经成脂诱导18 d后，油红O染色显示，实验组出现较多强阳性成脂细胞，其特征为细胞体积较大、呈圆形、内含鲜红色串珠样或大的融合脂滴，见图3B。

2.4 实验动物数量分析 30只SD健康大鼠，在模型制备过程中无死亡。每组3只大鼠脊髓组织用于苏木精-伊红染色，每组2只大鼠脊髓组织用于Tunel染色；每组5只大鼠脊髓组织用于Western-Blotting检测。

2.5 脊髓组织苏木精-伊红染色结果 正常对照组镜下可见大量的神经元细胞且形态正常，尼氏体清晰，细胞膜完整，细胞质染色均一，细胞核可见，见图4A。丙烯酰胺中毒组镜下可见神经元细胞数量较少，尼氏体消失，细胞膜破坏，细胞核固缩、消失，见图4B。骨髓间充质干细胞移植组镜下可见大量新生的神经元细胞，尼氏体清晰，细胞膜结构完整，细胞核清晰可见，见图4C。

2.6 Tunel法检测细胞凋亡情况 如图5所示，对照组几乎未观察到TUNEL阳性细胞，丙烯酰胺中毒组大鼠脊髓TUNEL阳性细胞显著增多，而骨髓间充质干细胞移植后脊髓TUNEL阳性细胞明显减少。

2.7 Western-Blotting检测脊髓组织Bcl-2和Bax表达水平 如图6所示，与对照组相比，丙烯酰胺中毒组大鼠脊髓组织Bcl-2的表达水平明显下降、Bax的表达水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞移植后，脊髓组织Bcl-2的表达水平升高、Bax的表达水平降低，与丙烯酰胺中毒组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。与对照组相比，骨髓间充质干细胞移植组脊髓组织Bcl-2表达几乎恢复至正常水平，而Bax表达略高于正常水平。

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引言

随着社会、经济的发展，丙烯酰胺的使用越来越广泛，长期接触低浓度丙烯酰胺导致的职业病已得到了社会媒体和预防医学工作者的密切关注。丙烯酰胺慢性中毒主要损伤神经系统，可以引发周围神经病变，导致四肢无力、感觉缺失，甚至出现生殖毒性作用和致癌作用^[1-3]。目前主要通过神经营养因子、能量合剂、理疗、功能锻炼等方法缓解丙烯酰胺中毒症状，尚缺乏有效的治疗方法^[4-8]，所以探索新的干预手段越来越重要。研究显示，丙烯酰胺对神经功能的损伤作用主要是通过诱导凋亡实现的^[9-12]。凋亡是细胞程序性死亡的另一种形式，生理水平的凋亡有助于维持组织结构的稳定和功能的完整，而凋亡水平过高将导致组织结构破坏和功能缺失。因此，抑制丙烯酰胺所导致的细胞凋亡可能是恢复受损神经功能的有效方法。

骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新和分化能力，已被用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症等多种退行性神经病变，越来越受到学者的青睐^[13-20]。Forostyak等^[21]报道，肌萎缩侧索硬化症模型小鼠脊髓内可观察到大量凋亡细胞，经椎管内移植骨髓间充质干细胞后，凋亡细胞数量显著减少。Chelluboina等^[22]对脑缺血24 h模型小鼠静脉移植骨髓间充质干细胞，发现缺血区组织结构明显改善、凋亡细胞显著减少。然而，骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺致脊髓组织细胞异常凋亡的影响尚不明确。

实验利用骨髓细胞差速贴壁的特性，建立起简单、高效的骨髓间充质干细胞培养方法，得到纯度较高、活性较强的骨髓间充质干细胞，并将其移植于丙烯酰胺中毒模型大鼠，用TUNEL法检测大鼠脊髓组织细胞凋亡水平，Western-Blotting技术检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平，探讨骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织细胞凋亡的保护作用及其抗凋亡机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机分组动物实验。

1.2 时间及地点 于2016年9月至2017年2月在大连医科大学基础医学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康、清洁级雄性SD大鼠30只，两三个月龄，体质量为(200±5) g，清洁级SD大鼠20只，雌雄不限，四五周龄，体质量约120 g，均由大连医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待动物实验动物的指导性意见》标准。

1.3.2 主要试剂与仪器 胎牛血清(NQBB，澳大利亚)；LG-DMEM培养基(GIBCO，美国)；细胞培养皿(Corning，美国)；IX-70型倒置显微镜(Olympus，日本)；FITC-CD44抗体、PE-CD45抗体、PE-CD90抗体(e-BIOSCIENCE，美国)；兔抗大鼠Bax、Bcl-2抗体(Cell Signing Technology，美国)；兔抗大鼠 GAPDH抗体(Sigma，美国)。丙烯酰胺(国药集团化学试剂有限公司，批号F20100927)。?

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的原代分离培养 20只四五周龄SD大鼠脱臼处死，体积分数为75%乙醇浸泡5 min，分离胫骨和股骨，PBS清洗，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，PBS冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，用无菌注射器反复吹打成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，以细胞浓度1×10⁹ L^-1接种于25 cm²培养瓶中，在37 ℃、饱和湿度的CO₂培养箱培养。48 h后全量换液，之后每3 d换液1次，当细胞长至80%-90%融合时，胰酶消化，以1︰3的比例传代。

1.4.2 骨髓间充质干细胞鉴定 收集第3代对数生长期骨髓间充质干细胞，PBS(含1%BSA)清洗，制成单细胞悬液，计数细胞，各管分别加入CD29、CD45和CD90单克隆抗体，每管样品设立阴性对照，在避光条件下孵育45 min，PBS(含1%BSA)溶液清洗3次，0.5 mL PBS(含1%BSA)重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测和分析。

将第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁生长至细胞密度达80%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基和成骨诱导分化培养基。每周换液2次，以未加诱导培养液的细胞培养孔作为对照。成脂细胞诱导剂诱导18 d后，经40 g/L多聚甲醛固定，进行油红O染色；成骨细胞诱导剂诱导21 d后，经40 g/L多聚甲醛固定，进行茜素红染色。

1.4.3 动物分组、造模、干预 30只雄性SD大鼠适应性饲养1周后开始进行实验，随机将SD大鼠分为3组，每组10只。对照组：不进行任何操作，无特殊处理，饲养5周后处死。丙烯酰胺中毒组：丙烯酰胺50 mg/(kg•d)灌胃，每周连续灌胃染毒5 d，间隔2 d，共染毒2周，继续饲养3周后处死^[23-24]。骨髓间充质干细胞移植组：50 mg/(kg•d)丙烯酰胺灌胃染毒2周后，尾静脉注射3×10⁶个骨髓间充质干细胞，每周连续5 d，共3周。5周实验结束后处死SD大鼠，分离脊髓组织，保存于-80 ℃冰箱内。

1.4.4 苏木精-伊红染色 取各组大鼠的脊髓组织，40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，浓度梯度乙醇脱水，石蜡包埋固定，切片厚度为5-10 μm，保持和脊髓长轴垂直。切片常规脱蜡、复水，苏木精染色5 min，经0.5%盐酸乙醇分色、水洗蓝化后，伊红染色30 s，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下观察脊髓组织形态并拍照。

1.4.5 Western-Blotting检测脊髓组织Bcl-2、Bax蛋白表达 冰冻脊髓样本称质量，利用液氮、研钵粉碎组织块，加入裂解液(50 mmol/L Tris-Cl、pH 6.8、10 mmol/L EDTA、2%SDS、5 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF)使组织裂解、变性，收集蛋白并定量后，加入浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸以充分变性蛋白。等量上样后，进行SDS凝胶电泳，PVDF膜转膜，用含有5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h后，加入Bcl-2、Bax抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光显影并拍照。利用gel-pro Analyzer软件对蛋白条带的灰度值进行分析，进行统计学比较。

1.4.6 Tunel法检测脊髓组织细胞凋亡 取脊髓组织制备冰冻切片，切片厚度为8-12 μm。切片经0.1% Triton X-100处理5 min后，滴加TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育1 h，DAPI复染，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的形态和表面抗原CD44、CD45和CD90的表达以及成脂、成骨分化能力；②脊髓组织病理形态；③脊髓组织细胞凋亡数量；④脊髓组织凋亡相关基因Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或者神经细胞等^[25-27]。骨髓间充质干细胞的来源有很多，例如肝脏、羊水或者胚胎血，但是实验和研究中骨髓间充质干细胞的主要获取来源是骨髓组织^[28-30]。目前，骨髓间充质干细胞在体外可通过如下4种方法获取：密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、流式细胞仪分选法和全骨髓贴壁法^[31-32]。其中，密度梯度离心法所获取的杂细胞较多，纯度无法满足实验所需要的标准^[33]。而免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法影响细胞活性，获得的骨髓间充质干细胞活性较低，甚至出现细胞全部失活的结果^[34]。与以上3种方法相比较，全骨髓贴壁法的操作步骤简单，污染机会少，利用骨髓间充质干细胞贴壁速度快的特性，可以对后代进行分离纯化。对于骨髓间充质干细胞的鉴定，通常选用CD44、CD90为阳性表达指标和CD45为阴性表达指标作为标准^[35]。实验利用全骨髓贴壁法来分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，通过形态学镜下观察、流式细胞仪检测和分化能力检测结果可以看出所得细胞为骨髓间充质干细胞。

众所周知，细胞凋亡是基因控制的细胞自主性死亡方式，其过程又称为细胞程序性死亡^[36]。凋亡异常激活会导致细胞呈现凋亡性死亡，使组织器官结构破坏、功能障碍，甚至引起各种疾病发生。抑制凋亡的发生，对受损组织可能具有积极的修复作用。Liu等^[37]以大鼠肺损伤为模型，发现骨髓间充质干细胞移植能通过抗凋亡作用保护受损的肺部组织。Wang等^[38]利用骨髓间充质干细胞对2，5-己二酮中毒大鼠进行干预，发现骨髓间充质干细胞能起到抗凋亡作用，而阻断骨髓间充质干细胞的凋亡抑制作用，骨髓间充质干细胞则失去了对神经组织结构和功能的保护作用。Tunel染色结果显示，丙烯酰胺暴露引起大鼠脊髓组织Tunel阳性细胞即凋亡细胞明显增多，而骨髓间充质干细胞移植后Tunel阳性细胞显著减少。提示，骨髓间充质干细胞可能通过凋亡抑制作用实现对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织的保护作用。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用。Bcl-2家族根据基因功能的不同可分为两类，一类是抗凋亡分子，例如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一类是促凋亡分子，如Bax、Bak等。若Bax在细胞内的含量增多，会导致其同源二聚体的数量倍增，使细胞对凋亡信号的敏感性增加，启动凋亡程序。反之，若Bcl-2在细胞内表达增多时，Bcl-2/Bax异源二聚体生成，对抗凋亡发生。多项研究证实，Bcl-2和Bax的表达水平是细胞凋亡的关键调控蛋白^[39-40]。实验结果显示，骨髓间充质干细胞移植使丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织Bcl-2表达水平显著升高、Bax表达水平显著降低，提示骨髓间充质干细胞可能通过调节Bcl-2和Bax表达水平抑制凋亡发生。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植可显著抑制丙烯酰胺中毒导致的大鼠脊髓组织细胞凋亡，其抗凋亡机制与Bcl-2和Bax的表达调节有关。该研究为临床应用骨髓间充质干细胞治疗丙烯酰胺中毒提供动物实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠脊髓组织细胞凋亡的影响

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation inhibits apoptosis in the rat spinal cord injured by acrylamide

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