“手风琴”技术治疗骨折不愈合模型兔

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0384

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
“手风琴”技术：是近年来新兴起的治疗骨不连的一种技术。其创新的理念在于对不愈合的骨折断端不进行单纯的加压，而是一种依次应用加压、牵开再加压的方法联合两种不同的力学机制分别促进骨折愈合的方法，这种反复的加压-牵开-再加压的技术最早是由Giotakis教授提出的，同时被命名为“手风琴”技术。
“张力-应力”法则：活体组织在持续、稳定、缓慢的牵拉下，可刺激和激活某些组织细胞的再生和活跃生长，其生长方式类似胎儿组织，均为相同的细胞分裂。

摘要
背景：“手风琴”技术治疗骨折不愈合在临床少量应用后效果显著，但还需要进一步的基础研究作为支持。
目的：验证“手风琴”技术可治疗新西兰大白兔骨不愈合。
方法：建立新西兰大白兔单侧股骨干缺损型非感染性骨折不愈合模型，造模成功后将新西兰大白兔随机分为3组,实验组大白兔应用“手风琴”技术：用外固定架以0.5 mm/d的速度持续加压至4周，第5，6周按照0.5 mm/d的速度对骨折断端进行持续牵开，牵开结束后仍以0.5 mm/d的速度进行持续加压4周；对照组对骨折断端复位后只进行加压；对空白对照组实验动物不愈合骨折断端进行复位并确保骨折远近端接触，但不进行任何牵张处理，既不加压，也不牵开。然后分别于2，4，6，8，12周分别对兔进行拍Ｘ射线片、拍片后对骨折断端取标本，进行苏木精-伊红染色并进行组织学观察。
结果与结论：①实验组X射线检查提示骨折愈合，而对照组及空白组仍骨折不愈合(P < 0.01)；②组织学检查示实验组骨折不愈合部位可见明显由骨折不愈合状态向愈合状态的转变，最后骨折愈合，对照组及空白对照组未见明显骨折愈合变化；③结果表明，“手风琴”技术可简单、微创及高效地治愈骨折不愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7032-8939(冯震)

关键词: 模型, 动物, 外固定架, 股骨, 骨折, 不愈合, 兔, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: “Accordion” technique achieves satisfactory outcomes in the treatment of nonunion, but there is a lack of basic research.
OBJECTIVE: To verify that the “accordion” technique is effective for nonunion in New Zealand white rabbits.
METHODS: The model of unilateral femoral fracture with noninfectious nonunion was created in the New Zealand white rabbits. The model rabbits were then divided into three groups: experimental group: treated with “accordion” technique (4 weeks of pressure with external fixator at a speed of 0.5 mm/d, then 2 weeks of retraction at the same speed, and finally 4 weeks of pressure); control group: external fixation and pressure; blank control group: only external fixation. The rabbits underwent X-ray examination at 2, 4, 6, 8 and 12 weeks. The fracture specimens were taken for hematoxylin-eosin staining and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: The X-ray examination of the experimental group suggested that the fracture
was healed, while the control group and the blank control group still did not heal (P < 0.01). Histological examination showed that the fracture stump of the experimental group changed from the nonunion state to the healing state, and the blank control and control groups showed no obvious changes. Thus, “accordion” technology is a simple, minimally invasive and efficient treatment method for nonunion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Models, Animal, External Fixators, Femur, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

冯震，张猛，吴薇娜. “手风琴”技术治疗骨折不愈合模型兔[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5175-5179.

Feng Zhen1, Zhang Meng2, Wu Wei-na3. “Accordion” technology treats nonunion in model rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5175-5179.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰大白兔150只，分为3组，术后至实验结束全部实验动物出现围手术期并发症共1只，出现死亡例数共7只，均排除，142只进入结果分析。见表4。

2.2 动物分组基线资料分析经卡方检验，3组实验动物月龄分布差异无显著性意义(P > 0.05)；经卡方检验，3组实验动物体质量分布差异无显著性意义(P > 0.05)。见表5，6。

2.3 动物大体观察全部实验动物均在相同环境下饲养及进行手术操作。术后第1天所有实验动物均状态萎靡，进食水量较术前减少，且手术切口可见明显渗出。术后第3天实验动物可自由活动，恢复术前状态，且手术切口干燥结痂。

2.4 X射线检查结果通过X射线Ⅴ级评定法及Paley评定法，实验组共25只达到骨折愈合标准，即表3的骨折愈合标准，对照组1只达到骨折愈合标准，空白对照组无骨折愈合例数，见表7，8。

2.5 各组兔骨折愈合结果实验组共25只(89%)骨折愈合，对照组共1只(4%)骨折愈合，空白对照组(0%)无骨折愈合例数，见图2。

2.6 组织学检查 2周：实验组及对照组可见大量坏死结缔组织，未见明显软骨及骨痂形成，可见肌纤维位于骨折断端；4周：实验组及对照组可见大量炎性细胞浸润；6周：实验组及对照组可见骨折断端周围骨膜细胞出现，并有少量已成骨，并伴有少量新生血管及破骨细胞形成，纤维结缔组织及肉芽组织消失；8周：实验组可见视野中软骨细胞占大部分，并泌出大量软骨基质，同时可见大量成骨细胞形成，并增生形成骨小梁。对照组较6周时未见明显变化；12周：实验组可见大量新骨形成，成骨细胞大量增生，成骨过程基本完成。见图3。

参考文献

[1] 王昌俊,郑欣,邱旭升, 等. 影响骨折愈合的生物物理学因素研究进展[J]. 中国矫形外科杂志,2014, 22(10): 898-901.

[2] 刘千祥. 四肢长骨骨折骨不连的原因和手术治疗探讨[J]. 当代医学, 2014,20(14): 59-60.

[3] 李冀,赵伟超,关鹏飞,等. 长骨医源性骨不连的临床流行病学调查[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2012, 27(1):34-36.

[4] 赵玉峰,刘华渝,任永川,等. Ilizarov 骨延长和骨搬移技术治疗下肢长骨创伤后慢性骨髓炎[J].中华创伤杂志, 2015, 31(4):294-298.

[5] Ilizarov GA. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin Orthop Relat Res. 1989;(238):249-281.

[6] Ilizarov GA. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin Orthop Relat Res. 1989;(239):263-285.

[7] 陈伟,齐新文,张英明,等. Ilizarov 技术骨搬移治疗胫骨骨不连并软组织缺损感染[J]. 西部医学, 2014, 26(8): 993-995.

[8] 秦泗河,李刚. Ilizarov 技术骨科应用进展 [M].北京:人民军医出版社,2014.

[9] 段建伟,魏俊强,张猛, 等.外固定架加压-牵开-再加压治疗非感染性骨折不愈合实验研究[J].新医学, 2016,47(5): 319-324.

[10] 林坚平. 骨生化标志物 (NTX, CTX, OC, BSAP) 和QCT骨密度测定在早期诊断兔实验性骨不连的作用[D]. 南方医科大学, 2016.

[11] Johnson KD, Frierson KE, Keller TS, et al. Porous ceramics as bone graft substitutes in long bone defects: a biomechanical, histological, and radiographic analysis. J Orthop Res. 1996;14(3):351-369.

[12] Johnson KD, Sartor JD, Arts GH, et al.Flexible endoscopic catheter with ligasure: U.S. Patent 9,579,145[P]. 2017-2-28.

[13] Paley D, Catagni MA, Argnani F, et al. Ilizarov treatment of tibial nonunions with bone loss. Clin Orthop Relat Res. 1989;(241):146-165.

[14] 沈杰,乔林,张树明, 等.骨搬移技术治疗下肢长骨骨缺损的断端并发症分析[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2017, 32(1): 49-52.

[15] 强毅. 股骨干骨不连病因及治疗方法的临床研究[D]. 第四军医大学, 2016.

[16] 刘强. 四肢长骨骨折不愈合原因分析与治疗[D]. 太原: 山西医科大学, 2015.

[17] 郑昊,吕游,徐丽,等. 下肢长管骨骨折合并骨不连的原因分析及治疗[J]. 2015,9(17):118-122.

[18] 韩利峰,王鑫. 四肢骨折术后发生骨不连原因及治疗[J]. 现代仪器与医疗, 2017, 23(1): 102-104.

[19] 柏冰,马松涛,侯志勇. 生物学内固定技术在四肢长骨骨折治疗中的应用进展[J].临床合理用药杂志, 2015, 8(21): 162-164.

[20] 陈校明,刘忠,唐新桥, 等.镶嵌式外固定器加压固定不植骨治疗肥大性骨不连[J]. 创伤外科杂志,2015, 17(3): 264-264.

[21] 丁文义,安小刚,倪金和,等.四肢骨折术后骨不连的治疗策略及相关问题分析[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2015, 30(12): 1338-1340.

[22] 秦泗河. 外固定与肢体重建——走向中国化 Ilizarov 技术时代[J]. 中国矫形外科杂志, 2017, 25(4): 289-291.

[23] 刘培亭,王振军, 臧建成. Ilizarov 技术与骨科自然重建理念的哲学视野[J]. 医学与哲学: 临床决策论坛版, 2015 ,36(8B): 14-16.

[24] 任义军,严立,胡锐,等. Ilizarov 技术在治疗胫骨骨与软组织缺损中的应用[J]. 中华创伤骨科杂志, 2017, 19(3): 213-218.

[25] 郭保逢,秦泗河,任龙喜, 等. Ilizarov 技术治疗下肢血管瘤致屈膝畸形[J]. 中国矫形外科杂志, 2016, 24(17): 1570-1574.

[26] 赵志明,董桂贤,于桂泳,等. 撬拨复位结合 Ilizarov 技术治疗胫骨平台 Schatzker Ⅳ~ Ⅵ 型骨折[J]. 临床骨科杂志, 2016, 19(2): 211-213.

[27] 焦绍锋,秦泗河,郭保逢,等. Ilizarov 技术结合有限手术治疗伴有皮肤溃疡的马蹄内翻足[J]. 中国骨伤, 2015,8(2): 145-149.

[28] Pande H, Singh CM, Prabhakara A, et al.Management of infected non-union of lower limb long bone fractures using ilizarov technique:a study of outcomes.Interna J Res Orthop.2017;3(3): 557-564.

[29] 吴雪晖,李起鸿,许建中,等. 骨外固定技术不植骨治疗复杂性骨不连与骨缺损[J]. 中华创伤杂志, 2007, 23(16):407-411

[30] 王大维,王浩,董福生. 不同应力刺激对成骨细胞影响的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2016, 22(5): 652-656.

[31] 苏佳灿,任可,张春才. 应力对骨折愈合的影响及其作用机制[J]. 第二军医大学学报,2001,22(10):994-996.

[32] 许硕贵,张春才,任可, 等. 股骨髁上骨不连的治疗[J]. 中华创伤杂志, 2005, 21(4): 260-263.

引言

骨折后并发症较常见，其中最严重也最常见的是骨折延迟愈合以及骨折不愈合^[1-2]。在李冀、赵玉峰等^[3-4]研究人员的调查中，骨折后发生骨折不愈合在骨折固定术后的并发症中所占比为10%左右。而骨折不愈合的发生及发展严重影响了患者的生活质量，同时由于目前骨折不愈合的经典治疗方法存在创伤大、易感染、造成髂骨处骨缺损等一系列缺点，骨折不愈合的治疗成为了骨科治疗中的一大难题。

近年来，“手风琴”技术的提出为骨折不愈合的治疗提供了一个契机，为临床骨科医生提供了一把解决骨科棘手问题的“金钥匙”。“手风琴”技术的理论依据是“张力-应力法则”^[5-6]。“张力-应力法则”首先由前苏联G．A．Ilizarov最早报告，后来总结成张力-应力法则，并在临床广泛应用，解决了临床上的疑难问题^[7-8]，其内容为：“处于活体状态的生物组织，在受到缓慢且较为稳定的牵拉会使组织产生一定的张力，而这种张力可以刺激组织内某些细胞的再生并活跃生长，这些组织的生长方式和胎儿组织的方式相同，均为细胞分裂。”“手风琴”技术即为在“张力-应力法则”理论基础上，加入时间因素，通过对骨折断端进行长时间的反复进行加压-牵开-再加压-再牵开，刺激骨折断端，重新激发不愈合的骨折断端的再生潜能，从而达到简单、微创及高效治愈骨折不愈合的效果。

由于“手风琴”技术近些年才提出，虽然在少数病例应用并效果显著，但仍缺乏相应的基础研究。该实验则通过新西兰大白兔制作骨折不愈合模型，造模成功后应用“手风琴”技术并进行相应的基础研究，证明“手风琴”技术同样适用于新西兰大白兔，为后续研究“手风琴”技术引起的具体骨折激活机制提供可行性证据，现报告如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年6月在承德医学院附属医院动物实验中心完成。

1.3 材料健康雄性4-6月龄新西兰大白兔150只，体质量1.5-2.5 kg，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。许可证号：SCXK(京)2015-0005。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.4 实验方法

1.4.1 骨折不愈合模型的制作新西兰大白兔150只于清洁级环境中分笼饲养，自由活动。根据段建伟等^[9]和林坚平等^[10]学者的方法制作兔股骨骨折不愈合模型，造模过程如下：将实验动物取左侧卧位固定于兔台上并保证固定牢固，3%戊巴比妥钠作为麻醉用药，以1.0 /kg剂量精确计算麻醉药用量，取兔一侧耳缘静脉作为给药部位，穿刺成功后将麻醉药缓慢匀速注入，麻醉成功后再次确认兔台固定牢固并密切观察实验动物生命体征，保证其围手术期生命体征平稳。将实验动物术侧大腿褪毛并清洁术区，常规术区消毒、铺单。然后在实验动物术侧大腿中部切长约4 cm纵行手术切口，逐层切开并充分游离显露兔股骨干，操作过程中动作手法轻柔，避免手术副损伤。然后固定外固定架(Orthofix M103微型外固定架)，各取2枚2.0 mm斯氏针分别固定于股骨远端及其近端，固定后安装外固定架，并保证外固定架固定牢固。使用线锯于股骨中段截取骨皮质、骨内外膜及骨髓10 mm，操作结束后止血，冲洗消毒，逐层缝合。术后将实验动物继续置于清洁级环境中，自由活动。术后1周内日1次给予40万单位青霉素肌注及日2次手术切口消毒换药预防切口感染。术后8周行X射线检查，符合骨折不愈合X射线表现者即造模成功(图1)。

1.4.2 实验分组取骨折不愈合模型造模成功新西兰大白兔150只，随机分成3组，每组50只，用外固定架将兔骨折断端复位并保证骨折断端接触。①实验组大白兔应用“手风琴”技术：用外固定架以0.5 mm/d(分早晚2次完成，每次0.25 mm)的速度持续加压至4周，第5，6周按照 0.5 mm/d(分早晚2次完成，每次0.25 mm)的速度对骨折断端进行持续牵开，牵开结束后仍以0.5 mm/d(分早晚2次完成，每次0.25 mm)的速度进行持续加压4周；②对照组实验动物在明确骨折断端接触并功能复位后，通过外固定架对骨折端进行持续加压10周；③空白对照组所有实验动物在保证骨折断端复位并牢固固定后，不进行任何操作。

1.4.3 X射线检查造模成功后2，4，6，8，12周，麻醉后对3组分别用CR-X线机拍片，分别观察断端有无愈合迹象。参照Johnson等^[11-12]制定的X射线片骨痂评定标准(见表1)对每次X射线结果进行评定，同时根据Paley等^[13]制定的Paley骨折愈合评分对12周时X射线结果进行评定(见表2)，最后根据上述两标准制定骨折愈合及不愈合评定标准(见表3)。

1.4.4 组织学检查于2，4，6，8，12周行X射线检查后每组分别随机选取5只处死，截取骨折断端骨痂及软组织，分别A2、A4、A6、A8、A12代表实验组；B2、B4、B6、B8、B12代表对照组，C2、C4、C6、C8、C12代表空白对照组，使用0.9%氯化钠溶液后冲洗彻底，然后将组织迅速放入40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)中，在4 ℃恒温下固定 48 h。固定结束后使用20%的乙二胺四乙酸二钠脱钙4周，每3 d更换1次脱钙液，脱钙满意后，使用梯度乙醇进行脱水，二甲苯透明，纵向石蜡包埋，做成层厚6 μm纵向组织切片，行苏木精-伊红染色，染色成功后进行组织学观察。

1.5 主要观察指标 ①实验兔X射线检查结果；②组织学检查；③各组兔骨折愈合率比较。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计数资料采用χ²检验，计量资料采用t 检验，P < α时有统计学意义，检验标准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

非感染性骨不愈合分肥大型和萎缩型两种。肥大型骨不愈合断端纤维软骨组织存在成骨的潜能，由于固定不稳定引起的异常应力抑制了骨折的愈合进程^[14-15]，而萎缩型骨折不愈合的骨折断端周围因其血运遭到破坏而导致其成骨活性基本丧失，因此萎缩型骨折不愈合的治疗较之肥大型骨折不愈合更为困难。因萎缩型骨折不愈合的骨折断端成骨活性更低，更难治愈，故该实验采用的动物模型造模为萎缩型骨折不愈合，通过“手风琴”技术反复牵拉刺激骨折断端，从而使骨折断端重新拥有成骨活性，最终达到治愈骨折不愈合的效果。

在既往的文献中，很多作者报告采用内固定治疗骨折不愈合^[16-18]，同时指出骨折不愈合的内固定在稳定牢靠固定的同时要保证其生物力学因素不丧失^[19]。但该方法仍有较大的缺陷：①从原切口入路，对软组织进行二次损伤并导致断端血运遭到严重破坏；②对伴发的短缩和成角畸形很难同时矫正；③内固定器械需要再次取出，增加患者的负担^[20-21]。因此，寻找一种简单、微创、高效的治疗骨折不愈合的方法来代替目前的大创伤、负担重的经典治疗方法是势在必行的。而“手风琴技术”的出现则可以说是应运而生。

“手风琴技术”的理论依据为“张力-应力法则”，前苏联的Ilizarov教授最早发现并提出牵拉成骨技术，经过长时间的总结，后来发展为“张力-应力法则”，故应用该项法则的牵拉成骨技术又称Ilizarov技术。自20世纪50年代认识到牵张成骨法则 (distraction osteogenesis)以来，由于能够刺激骨折周围组织的代偿性修复，同时增加了骨折断端的成骨活性，因此证明了生理性牵张应力可以刺激骨的成骨活性并最终根据应力塑形成正常骨组织^[22-23]。而正是由于这个结论的得出，在长骨骨折不愈合、畸形愈合及大段骨缺损等机具挑战性的难题面前，llizarov技术的应用越来越多^[24-25]。而且，Ilizarov技术在应用过程中拥有创伤小、坚强固定、早期锻炼等传统治疗方法所不具备的优点^[26]。

在国内，该技术也被广泛的应用于临床，焦绍锋等^[27]报道llizarov技术治疗半肢畸形、带有溃疡的马蹄足；Pande 等^[28]报道应用Ilizarov技术治疗下肢感染性骨不愈合等。因此，基于Ilizarov技术及“张力-应力法则”基础上的“手风琴”技术更能青出于蓝而青于蓝的治疗难度更大的骨科疾病。“手风琴”技术首先通过Orthofix M103微型外固定架以0.5 mm/d的速度进行加压，根据吴雪晖等^[29]研究，相当于自身体质量的应力是骨代谢保持平衡的条件，可视为促进骨折愈合的最佳应力，而0.5 mm/d则相当于6月龄大白兔的自身体重力，因此，采取0.5 mm/d的速度加压。加压可给予骨折断端一个压应力，目前主要的研究表明除了能够保证骨折断端的稳定性^[30-31]，机械压力同时还有刺激优化细胞功能及对骨形态进行塑形的作用。间接效应是把机械能转变为电能，改变间质细胞的电化学环境，而骨的形成和吸收是受电信号诱导的^[32]。同时，给予断端一个压应力，可以挤压断端之间的软组织，导致软组织坏死，诱发相应的炎症反应从而间接达到刺激骨愈合过程重启的作用。在给予一段时间的压应力后改为给予牵张力，目前对于牵张力可以引起成骨细胞增殖，促进骨形成的观点，无论是基础研究还是临床研究均较多，也达成了共识。通过反复的加压、牵张过程，不断刺激骨折端重启骨愈合过程，从而达到治愈骨折不愈合的目的。

结论：“手风琴”技术可明显改变骨折不愈合部位的静止状态，重新激发骨的再生潜能，从而达到简单、微创及高效治愈骨折不愈合的效果。而单纯的复位或者复位后加压并不能治疗骨折不愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程