稳恒直流电场对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0377

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (32): 5150-5156.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0377

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稳恒直流电场对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响

张馨月1，李晨军1，2，李焰2，任凯歌1，潘莲1，陈俊驰1

1西南医科大学附属口腔医院，四川省泸州市 646000；2解放军成都军区总医院附属口腔医院，四川省成都市 610000

收稿日期:2018-02-06 出版日期:2018-11-18 发布日期:2018-11-18
通讯作者: 李晨军，西南医科大学附属口腔医院，四川省泸州市 646000；解放军成都军区总医院附属口腔医院，四川省成都市 610000
作者简介:张馨月，女，1991年生，山西省运城市人，汉族，2017年西南医科大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔医学方面的研究。
基金资助:
医学3D打印技术应用于头面部战伤防护及救治的研究(15QNP034)

Effect of steady direct current electric field on the vascularization of chorioallantoic membrane

Zhang Xin-yue1, Li Chen-jun1, 2, Li Yan2, Ren Kai-ge1, Pan Lian1, Chen Jun-chi1

1Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Hospital of Stomatology, General Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2018-02-06 Online:2018-11-18 Published:2018-11-18
Contact: Li Chen-jun, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Hospital of Stomatology, General Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Zhang Xin-yue, Master, Physician, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Research of Three Dimensional Printing applied in Prevention and Treatment of Craniofacial Trauma Caused by War, No. 15QNP034

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
稳恒直流电场：研究发现自发的稳恒直流电场通过调控细胞行为，可控制上皮细胞的细胞分裂和迁移，加快上皮愈合，刺激神经向伤口内生长，刺激血管内皮生长因子的表达，增加其分泌量，同时血管内皮细胞向伤口趋电迁移，损伤处出现血管发芽再生，促进伤口血液供给，加快愈合速率。在骨缺损中，稳恒直流电场同样能发挥促进骨缺损愈合的作用。
组织工程骨植入体内后的营养供应：目前限制组织工程骨应用于临床的问题中最棘手的是植入体内后的营养供应问题。植入体内的组织工程骨主要由血液-细胞间液完成营养供应，此种方式营养供应极其有限，同时新生血管长入缓慢，容易发生植入的变性坏死，一旦发生此类情况就意味着植入失败，同时会给患者带来严重伤害。所以组织工程骨的快速血管化问题是植入成功与否的关键问题。

摘要
背景：组织工程骨因其微创、安全、精确的特性，已成为恢复颌面部骨缺损及牙周组织的重要手段。
目的：以鸡胚绒毛尿囊膜血管为模型，加载不同强度电场，检验血管生长相关参数，研究电场对组织工程骨预血管化的作用，以期得到促进组织工程骨预血管化的方法，增加缺损修复成功率。
方法：使用孵化至第8天的鸡胚建立鸡胚绒毛尿囊膜血管模型(Inshell模型)，将模型随机分为A、B、C、D、E 5个组，分别加载0，-0.75，-1.5，-3，+1.5 V的不同大小及不同方向的稳恒直流电场，在加电0，12，24，36，48 h拍摄相关图片，使用Image J测量相关血管数据，观察指标为血管平均长度及血管生长角度，使用SPSS 22.0分析结果。
结果与结论：①加载不同大小电场以后，A组平均血管长度增长速率为0.012 mm/h，B组为0.023 mm/h，C组为0.047 5 mm/h；②使用独立样本t检验进行比较，加载-1.5 V电压48 h后的绒毛尿囊膜血管平均长度为(4.22±0.436)mm/mm2，加载0 V电压48 h后为(3.21±0.31)mm/mm2，两者差异有显著性意义(P < 0.01)；③48 h后，加载-1.5 V电压血管角度为(21.36±20.16)°，加载0 V电压则为(82.17±50.44)°，差异有显著性意义(P < 0.05)；④D、E 2组电极周围的鸡胚绒毛尿囊膜发生变性，鸡胚死亡；⑤提示适宜大小范围内的负电促进血管生长，同时改变血管生长角度，证明稳恒直流电场对鸡胚绒毛尿囊膜血管有明显影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5589-5276(张馨月)

关键词: 组织工程骨, 鸡胚绒毛尿囊膜, 稳恒直流电场, 血管化

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered bone has become an important means of repairing maxillofacial bone defects due to its minimally invasive, safe and accurate characteristics.
OBJECTIVE: The model of chick chorioallantoic membrane was loaded with different intensities of electric field, to detect the blood vessel growth-related parameters, and to explore the effect of electric field on force-vascularization of tissue-engineered bone, in order to search for a method that can promote force-vascularization of tissue-engineered bone, thus increasing the repair success rate.
METHODS: The model of chick chorioallantoic membrane (Inshell model) was established using the chicken embryos hatched for 8 days. The models were randomized into A, B, C, D, and E groups, followed by loaded with 0, -0.75, -1.5, -3 and +1.5 V and steady direct current electric fields at different directions. The images were taken at 0, 12, 24, 36 and 48 hours. The average blood vessel length and growth angle were measured by Image J, and analyzed on SPSS 22.0 software.
RESULTS AND CONCLUSION: After loaded with different currents of electric fields, the average growth rate of vessel length in the groups A, B and C was 0.012, 0.023, and 0.047 5 mm/h, respectively. Independent sample t test results revealed that after loaded with -1.5 and 0 V for 48 hours, the average length of blood vessel was (4.22 ±0.436) and (3.21±0.31) mm/mm2, respectively, and the difference was significant (P < 0.01). After loaded with -1.5 and 0 V for 48 hours, the angle of blood vessels was (21.36±20.16)° and (82.17±50.44)°, respectively, and the difference was significant (P < 0.05). The chick chorioallantoic membrane around the electrode in the groups D and E degenerated and chick embryos died. These findings indicate that appropriate negative electricity promotes the growth of blood vessels, and changes the angle of blood vessel growth, suggesting that steady direct current electric field greatly affects chick chorioallantoic membrane.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chick Embryo, Chorioallantoic Membrane, Neovascularization, Physiologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张馨月，李晨军，李焰，任凯歌，潘莲，陈俊驰. 稳恒直流电场对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5150-5156.

Zhang Xin-yue1, Li Chen-jun1, 2, Li Yan2, Ren Kai-ge1, Pan Lian1, Chen Jun-chi1 . Effect of steady direct current electric field on the vascularization of chorioallantoic membrane[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5150-5156.

图/表（结果） 5

2.1 实验现象加载-3 V电压12-24 h后多数鸡胚绒毛尿囊膜出现蛋白变型，鸡胚基本死亡，血管可能退化也可能停留在充盈状态(图8)。

加载-1.5 V电压可以观察到血管角度发生明显变化，同时血管数量增加。加载-0.75 V电压时也可观察到此现象(图9)。

加载+1.5 V电压成功率较低，容易发生鸡胚死亡，常观察到滤纸变色，同时周围绒毛尿囊膜上可能会出现变色及蛋白变性(图10)。

2.2 实验结果使用SPSS软件绘制加载-1.5 V电压血管平均长度变化(图11)，可见电压加载后的24 h内血管平均长度发生变化，出现增加的趋势，增加速率平均为 0.047 5 mm/h，24 h后基本处于稳定状态。由于鸡胚的生长发育，加载0 V电压48 h后，平均血管长度增加，使用独立样本t 检验比较，加载-1.5 V电压48 h后的绒毛尿囊膜血管平均长度为(4.22±0.436) mm/mm²，对照组(加载0 V电压48 h)为(3.21+0.31) mm/mm²，P < 0.01，差异有显著性意义(表2)。

将加载0，-0.75，-1.5 V电压的平均血管长度进行比较，由折线图可见(图12)，0 V与-0.75 V的平均血管长度从0-48 h一直处于增加状态，-0.75 V电压下增加速率平均为0.023 mm/h，而0 V为0.012 mm/h。

加载-1.5 V电压48 h后血管角度发生明显变化，其均值由79.09°变为21.36°，与电场线之间的夹角变小，同时方向为向心性生长，其95%置信区间也由(71.32°，86.85°)变为(18.78°，23.93°)。加载-1.5 V电压48 h后血管角度为(21.36±20.16)°，对照组(加载0 V电压48 h)则为(82.17± 50.44)°，同时P < 0.05，差异有显著性意义(图13及表3)。

统计0 V电压下鸡胚绒毛尿囊膜血管角度数值，将5个不同时间点数据进行方差分析，各个组间进行比较，P值最大为0.997，最小为0.053，均> 0.05，差异无显著性意义。表明加载0 V电压后血管角度未发生明显变化(表4)。

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引言

骨缺损常引起患者功能缺损或缺失，造成容貌缺陷，是医学中较常见的问题。在口腔医学领域，创伤、肿瘤及炎症等均可引起不同程度的牙周组织缺损或颌骨缺损。目前，国内外修复此类缺损多采用骨移植或骨组织工程复合物，不论是自体骨移植还是异体骨移植都有诸多缺陷^[1]，这些缺陷限制了骨移植在临床中的使用。

骨组织工程的基本含义是将细胞、合成材料、处理过的天然材料和组织、细胞因子及基因治疗广泛地应用于体内的骨组织再生或体外的骨组织构建。由于组织工程骨仅需要少量的细胞，并且来源于自体，抗原性甚微，同时支架材料可以被制备成所需要的三维形状^[2-4]，这种微创、安全、精确的特性使骨组织工程复合物成为恢复颌面部骨和牙周组织缺损的主要手段。

目前限制组织工程骨应用于临床的问题中最棘手的是植入体内后的营养供应问题。植入体内的组织工程骨主要由血液-细胞间液完成营养供应^[5]，此种方式营养供应极其有限，同时新生血管长入缓慢，容易发生植入的变性坏死，一旦发生此类情况就意味着植入失败，同时会给患者带来严重伤害。所以组织工程骨的快速血管化问题是植入成功与否的关键问题。

组织损伤时，必然有细胞的破坏，伤口处跨细胞电势差骤降，因此在伤口和正常组织之间将产生一稳恒电势梯度并形成损伤电流及稳恒直流电场(steady direct current electric field，sDCEF)，通常在人体上，损伤产生的自发性电场强度为40-200 mV/mm^[6]。19世纪40年代，DuBios-Reymond就在新鲜创口处观察到这种sDCEF，称其为内源性电场，首次提出了这种内源性电场具有促使损伤愈合等生物学效应^[7-8]。现已有大量研究证实，外源性直流电场同样可以调控血管内皮细胞细胞形态、垂直取向和定向迁移等运动行为^[9-12]。在外源性电场的作用下，血管内皮细胞为降低跨细胞电压，其细胞长轴将按垂直于电场方向排列^[13]，血管内皮细胞分泌血管内皮生长因子量增多，所有与血管生成有关的细胞其增殖能力增加^[14]。这些研究都提示，sDCEF在促进组织工程骨的快速预血管化及成骨方面可能有重大作用。

在以往的体外实验中，研究者多使用仓鼠颊囊、兔耳气室等作为实验对象，通过皮下植入材料来模拟组织工程材料的三维结构^[15]。这些实验动物价格昂贵，体外模型建立比较复杂，难以大量复制。鸡胚价格便宜，容易制备，同时鸡胚发育过程中的血管生长有利于模拟组织工程骨的血管构建。鸡胚发育至第3天时，卵黄囊上的血管开始初具形态；培育至第4天或第5天时，在胚胎附近将出现尿囊膜与胚胎相连。胚胎发育至第8天，尿囊膜上出现初级血管和原始血管网用以交换气体和进行新陈代谢，随后血管开始飞速生长直至第11天。第11天后血管内皮细胞有丝分裂指数下降，第18天后达到其最终形态^[16]。第8-11天时，绒毛尿囊膜血管内皮细胞有丝分裂指数较大，血管生成活跃，利用此时期能模拟组织工程骨在骨缺损断端处的血管生长情况，建立体外实验模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照实验。

1.2 时间及地点于2015年2月至2016年10月在解放军成都军区总医院实验室完成。

1.3 材料罗曼鸡受精鸡蛋(四川省圣迪乐村生态食品股份有限公司)、无齿镊、持针器、注射器、无菌敷贴、ETHICON 7-0缝线、滤纸、琼脂、电解液、蒸馏水、生理盐水、孵化箱、恒温恒湿箱、无菌操作台、体视野显微镜、直流电源等。

1.4 实验方法

1.4.1 建立鸡胚绒毛尿囊膜血管模型(Inshell模型) 选择罗曼鸡受精鸡蛋，用蒸馏水擦拭鸡蛋表面后使用乙醇进行消毒。于温度为37.5 ℃，湿度为60%的孵化箱中孵化，3 d后使用强光手电进行检查，淘汰所有未孵化的鸡胚。剩余鸡胚继续孵化。孵化途中保持湿度及温度，每间隔半小时，孵化箱自动翻蛋1次。孵化至7 d后将鸡胚直立于培养杯中，气室向上。

孵化8 d后，将培养杯连同鸡胚从孵化箱中取出置于无菌操作台上。进行如下操作：①乙醇消毒鸡胚表面，并用甲紫溶液以鸡胚顶点为中心做一半径为0.75 cm的圆；②使用持针器仔细沿甲紫线剥除蛋壳。使用无齿镊仔细取出壳膜，注意不能伤及下方绒毛尿囊膜及血管；③打孔器制备直径为6 mm的圆形滤纸片，紫外线消毒后使用生理盐水浸润，7-0外科缝线标记方位。10 mL一次性滴管吸取加热后融化状态的琼脂，滴一滴在滤纸片上(图1，2及表1)；④将制备的琼脂滤纸复合体放置于绒毛尿囊膜上，使用体式野显微镜拍摄图片。将显微镜倍率调整为×0.7，拍摄鸡胚血管全貌，随后将每枚鸡胚分为9个区域，其中1个区域为滤纸全貌，每个区域使用×1.0倍率进行拍摄(图3)。拍摄后使用外科无菌敷贴封闭开窗处。将鸡胚放置于37.5 ℃，湿度为60%的恒温恒湿箱中继续培养。

1.4.2 sDCEF加载将孵化至第8天的罗曼鸡鸡胚按随机数字表法分为A，B，C，D，E共5组，分别加载0，-0.75， -1.5，-3，+1.5 V的电压，每组6枚鸡胚。每个鸡胚培养杯中添一定量电解液，电解液与银丝及鸡胚接触，银丝长 5 mm，直径1.5 mm。另取一根长度为50 mm，直径为0.3 mm的银丝由上至下从无菌敷贴处垂直插下，以与滤纸中心接触但不造成压力为适宜。2处银丝分别与直流电源相连，每组加载不同大小的直流电电压(图4)。继续于恒温恒湿箱中培养，每隔12 h观察鸡胚存活情况，淘汰已死亡的鸡胚，剩余鸡胚于体式野显微镜下拍照后继续培养，直至48 h。

1.5 主要观察指标每枚鸡胚随机选择一个区域按拍摄时间顺序进行数据分析及统计，使用Image J软件统计鸡胚血管生长方向及平均血管长度。

1.5.1 血管生长方向 AB延长线与CD延长线之间的夹角即为血管角度。血管向圆心生长取值为0°-90°，反之则取值为90°-180°(图5)。

1.5.2 血管平均长度统计血管总长度取均值并测量图形统计面积，所得血管平均长度为长度/面积，单位为mm/mm²(图6，7)。

1.6 统计学分析数据使用SPSS Statistics 22.0进行统计分析，组间比较使用独立样本t 检验，组内比较使用方差分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨缺损的修复离不开血管的形成，血管生成在骨的新生、再生和修复中都有着重要作用^[17]。血管内皮细胞不仅是血管形成的种子细胞，它还可以分化为成骨细胞或成骨前细胞，这意味着血管直接参与了骨形成^[18]。同时，新生血管的建立，为骨缺损部位及组织工程骨再生及代谢提供有利的微环境。所以血管生成是保证植入材料成功修复骨缺损的重要前提^[19]。

内源性电场是创伤愈合及胚胎发育的重要条件^[20-22]。研究发现自发的sDCEF通过调控细胞行为，控制上皮细胞的细胞分裂和迁移，加快上皮愈合，刺激神经向伤口内生长^[23-24]，刺激血管内皮生长因子的表达，增加其分泌量，同时血管内皮细胞向伤口趋电迁移，损伤处出现血管发芽再生，促进伤口血液供给，加快愈合速率^[25]。在骨缺损中，sDCEF同样能发挥促进骨缺损愈合的作用，已有大量研究证实，细胞在受到电刺激时细胞骨架发生重排，同时生理强度的外源性电场可控制和加强骨髓间充质干细胞在骨愈合过程中的迁移，促进骨形成^[26-27]。Li等^[28]研究发现，外源性直流电场可诱导表皮干细胞向负极定向迁移；同时，Rouabhia等^[29]研究发现电刺激能促进成纤维细胞的增殖和迁移，增加生长因子的分泌量，促进细胞分化，从而促进伤口愈合。

此次实验加载-3 V电压后，多数绒毛尿囊膜出现蛋白变型，鸡胚死亡，同时血管退化或处于充盈状态。造成的变性死亡的原因可能为长时间加载过大电压超过鸡胚绒毛尿囊膜蛋白所能承受范围，造成血管退化，同时过大的电压引起鸡胚心血管系统受损，致使鸡胚死亡^[30-31]。部分血管死亡时停留在充盈状态，此现象提示稳恒直流电加载后，血管首先出现的反应可能是充血或淤血，随后再出现血管的改建。加载-1.5 V及-0.75 V电压后，均出现血管密度及角度的明显变化，统计结果中，加载-1.5 V电压后血管走形与电场线之间的夹角变小，同时生长方向为向着负电加载点的方向。此现象与Bai等^[32]的研究结果相似，他们研究发现，暴露于电场强度为150-200 mV/mm的直流电场中，血管内皮细胞向负极发生定向迁移。但也有学者认为，加电后血管向负极生长与血液流体动力学有关^[33]。

在平均血管长度的比较中，-0.75 V与-1.5 V电压对血管的影响大小有所不同。加载-1.5 V电压24 h后，血管生长趋于平缓，而-0.75 V在加电48 h后仍呈现增加的状态，且可能未达到其最高值，这提示不同的电压其加电效应是不同的，对于此研究分组来看，-1.5 V电压最能促进血管生长。但不同生物的最适电压应有所不同，尚需大量实验研究不同生物的合适电压。适当范围内的负电通过血管后，血管的生长被促进，有国内外学者认为与不同因子的分泌量改变有关，特别是血管内皮生长因子分泌的增加。血管内皮生长因子与血管内皮生长因子受体结合后通过产生血管基底膜分解所需的蛋白酶及整合素，促进内皮细胞的增殖与迁移，同时增加微血管通透性，促进新生血管形成，后期产生的血小板衍生生长因子可通过募集周细胞，促进血管平滑肌细胞发育，促进新生血管的功能和稳定^[34]。电压加载第24-48小时，绒毛尿囊膜处于发育中的第9，10天，其有丝分裂仍处于高峰期，但此时加载-1.5 V电压的鸡胚其平均血管长度维持在一个比较稳定的数值，与快速发育期应有的表现有所出入，可能为电流加快了鸡胚绒毛尿囊膜血管发育的进程更早的达到峰值，目前尚需大量研究探索其原因。

加载0 V电压后，不同时间点血管角度的变化无明显差异，这提示此加电模型中滤纸、琼脂以及插入银针后造成的轻微压力对鸡胚发育无明显影响，不会干扰加电后产生各种变化的分析结果。加载+1.5 V电压的成功率较低，出现的变性及变色现象对结果统计产生了严重影响，所以未与其余组进行比较分析。加正电后出现鸡胚死亡的原因猜想为，正电加载后对鸡胚绒毛尿囊膜上血管的生长有抑制作用，抑制了鸡胚的新陈代谢，同时正电通过与鸡胚相接触的银针后，在电流的作用下，银针可能发生一定程度的电离，银粒子释放，过量的银离子致使鸡胚死亡^[35-37]，同时引起绒毛尿囊膜蛋白变性及形成黑色物质。应采用其余导电物体研究正电对血管的影响。

组织工程骨植入体内后营养供应问题急需解决，若能实现组织工程骨的体外预血管化或体内快速血管化将有利于提高移植成功率。sDCEF对血管有明显影响，电压加载后平均血管长度明显增加，意味着血管密度及数量的增加，同时走形为向负电生长。在组织工程骨内加载负电，有利于血管大量且快速的向生物材料内生长，将植入后细胞间液扩散营养转变为由血液直接供应营养，结合与牙周组织及颌面部骨组织相关的各种种子细胞共培养体系^[38-40]、可实现快速成骨，提高颌面骨缺损患者的整复成功率，增加牙周缺损患者牙槽骨成骨概率，采用更好的方式治疗骨缺损及其带来的其他不良影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

稳恒直流电场对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响

Effect of steady direct current electric field on the vascularization of chorioallantoic membrane

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