生物打印具有微网络流体通道的三维结构

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0688

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (2): 265-271.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0688

• 材料力学及表面改性 material mechanics and surface modification • 上一篇下一篇

生物打印具有微网络流体通道的三维结构

邹强^1，2，3，孙宇^1，2，3，李轩泽^1，2，3，吴展羽^1，2，杨龙²，王建吉²，刘琴⁴，马敏先⁴，叶川^1，2，3

¹贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；²贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；³贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；⁴贵州医科大学附属口腔医院修复科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2018-08-01 出版日期:2019-01-18 发布日期:2019-01-18
通讯作者: 叶川，主任医师，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:邹强，男，1990年生，贵州省铜仁市人，土家族，贵州医科大学在读硕士，主要从事组织器官生物制造研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360232，项目负责人：叶川)；贵阳市科技局创新团队资助项目(20175-17，项目负责人：叶川)

Bioprinting of 3D structure with micro-network fluidic channels

Zou Qiang^{1, 2, 3}, Sun Yu^{1, 2, 3}, Li Xuanze^{1, 2, 3}, Wu Zhanyu^{1, 2}, Yang Long², Wang Jianji², Liu Qin⁴, Ma Minxian⁴, Ye Chuan^{1, 2, 3}

¹Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ²Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ³Experimental Center for Tissue Engineering and Stem Cells, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁴Department of Prosthodontics, Affiliated Stomatology Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2018-08-01 Online:2019-01-18 Published:2019-01-18
Contact: Ye Chuan, Chief physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zou Qiang, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Experimental Center for Tissue Engineering and Stem Cells, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360232 (to YC); the Science and Technology Innovation Team Funded Project of Guiyang, No. 20175-17 (to YC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

3D生物打印：是在计算机辅助下，按照预先设计的三维结构，将活细胞与具有生物相容性的水凝胶复合物按照层层滴加原理来制造三维组织或器官。实验采用打印机是根据FDM级双喷头打印机改装的生物打印机，可根据实验要求调整打印相关参数，目的是一体化构建预血管化、大尺寸为一体的组织结构及保持其内细胞的活性。

牺牲“骨架”：单纯水凝胶进行生物打印时易坍塌、不易成形。因此，在生物打印的蓝图里设计了内外骨架，在水凝胶固化前给予支撑，以解决坍塌难题。待打印好后，将骨架通过水溶法去除，便会得到自定义尺寸的三维微网络流体通道结构。因聚乙烯醇具有良好的生物相容性、一定的刚性和良好的水溶性，因此用其作为牺牲材料来打印牺牲骨架。

背景：构建三维的预血管化系统，对于大尺寸、复杂三维结构组织内细胞的存活和功能表达均具有决定性作用。因此，寻找一种合适的预血管化策略已成为3D生物打印大尺寸、复杂三维组织亟待解决的问题。

目的：对3D生物打印大尺寸、预血管化三维结构进行初步的探索。

方法：用逆向工程软件Catia设计三维生物打印蓝图；以改装后的桌面级双喷头3D打印机为生物打印机，以聚乙烯醇为牺牲材料打印牺牲骨架；以大鼠骨髓间充质干细胞、海藻酸钠、琼脂糖和纳米纤维素溶液的混合物为细胞生物墨水。根据预先设计的参数进行生物打印，构建具有三维流体通道的组织工程三维结构体。观察打印获得的三维结构体，评价打印后及材料溶解后的细胞活性；体外培养打印获得的结构体，并用Alamar Blue试剂盒检测细胞在三维结构体中的增殖。

结果与结论：利用Catia软件设计出了具有微孔的外壁及内部纵横交错的微管结构的双喷头打印模型，用该三维生物打印技术构建出具有自定义尺寸(尤其是高度)和预血管化的三维结构，结构体中细胞12 h的存活率为(95.47±0.54)%，随着体外培养时间的延长，细胞存活率下降并稳定在80%以上。随着培养时间的增加，构建体中的细胞增殖呈上升趋势。结果表明：该生物打印方法可用于通过使用各种生物水凝胶材料制造不同特性的三维结构体，在生物制造具有临床相关尺寸的预血管化的复杂组织器官方面具有潜力。

ORCID: 0000-0002-4084-4799(邹强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D生物打印, 水凝胶, 血管化, 流体通道, 组织工程, 牺牲骨架, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Constructing a three-dimensional pre-vascularization system plays a decisive role in the survival and functional expression of cells in large and complex three-dimensional structures. Therefore, seeking a suitable pre-vascularization strategy has become a problem to be solved urgently in the 3D bio-printing of large size and complex three-dimensional tissue.

OBJECTIVE: To make a preliminary exploration on the 3D bioprinting of large-scale and pre-vascularized three-dimensional structure.

METHODS: Catia as a reverse engineering software was used to design a three-dimensional biological print blueprint. A modified desktop-grade dual-head 3D printer was used as a biological printer and polyvinyl alcohol as a sacrificial material to print a sacrificial skeleton. The mixture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, sodium alginate, agarose and nano-cellulose solution was used as cell biological ink. According to the pre-designed parameters for printing, the tissue engineering three-dimensional structure with three-dimensional fluid channel was constructed. The three-dimensional structure obtained by printing was observed to evaluate the cell activity after printing as well as after material dissolution. The printed structure was cultured in vitro and the proliferation of cells in the three-dimensional structure was detected by Alamar Blue kit.

RESULTS AND CONCLUSION: A double-nozzle printing model with micro-porous outer wall and interlaced microtubules was designed by using Catia software. The three-dimensional biometric printing technology was used to construct the three-dimensional structure with self-defined size (especially its height) and pre-vascularization. The survival rate of the cells in the printed structure within 12 hours was (95.47±0.54)%, and as the in vitro culture time prolonged, the cell survival rate decreased but still exceeded 80%. Over time, the cell proliferation showed an increasing tendency. These findings indicate that this biometric printing method can be used to produce three-dimensional structures with different characteristics by using various bio-hydrogel materials, and has potential in the biofabrication of complex tissues and organs with clinically-related dimensions of pre-vascularization.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Materials Testing, Hydrogel, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318

邹强，孙宇，李轩泽，吴展羽，杨龙，王建吉，刘琴，马敏先，叶川. 生物打印具有微网络流体通道的三维结构[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 265-271.

Zou Qiang, Sun Yu, Li Xuanze, Wu Zhanyu, Yang Long, Wang Jianji, Liu Qin, Ma Minxian, Ye Chuan. Bioprinting of 3D structure with micro-network fluidic channels[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(2): 265-271.

图/表（结果） 5

2.1 三维模型建模及微孔参数优化采用Catia软件设计出直径45 mm、高45 mm的圆柱体CAD模型，其特征是壁厚为1 mm，壁上的微孔孔径分别为100，200，300，400 μm，内部三维网格是由直径为1 mm的圆柱状微管构成，其形成的网格中心距为5 mm×5 mm×5 mm，见图2A-D。为了筛选出最佳的微孔参数，将前述生物墨水分别灌注其中，然后通过观察生物墨水是否从壁上的微孔流出来，结果发现微孔直径为100 μm和200 μm时无渗出，而为300 μm和 400 μm时渗出很明显，见图2E-H。孔径越大越容易让交联溶液渗透，因此当微孔孔径为200 μm时，既能保证生物墨水不渗出又能使交联剂有效快速渗透而达到充分交联的目的。

2.2 打印参数对牺牲骨架打印精度的影响在喷头内径、底板温度、填充率和打印层厚不变时，牺牲骨架打印精度主要受喷头温度和打印速度的影响。当打印温度为180 ℃时，打印速度在60，80 mm/s时存在拉丝现象，见图3A，C白色箭头所指，而在70 mm/s时几乎无拉丝，见图3B；当打印温度为190 ℃时，打印速度在60，70，80 mm/s时均存在拉丝现象，见图3D-F白色箭头所指，但在70 mm/s时拉丝量明显减少且粗细较均一。因此温度和速度的最佳打印参数分别是180 ℃和70 mm/s。

2.3 具有微网络流体通道的结构体观察成功地制造了尺寸为43 mm×43 mm×44 mm的类血管样网状流体通道圆柱体，且圆柱体无塌陷及缺损，大体明显可见尺寸为 1 mm左右的类血管样网状流体管道，见图4A-C，相连管道之间的距离为4 mm左右，这与预先设计的结构相符合。光镜下可见结构体中的细胞呈圆形或椭圆形均匀分布，见图4D。为了显示内部中空管道的相连，采用该方案构建出一个直径为45 mm、内部具有单层网格流体通道的不含细胞的水凝胶圆盘结构，然后用红色荧光染料对其进行灌注实验，如图4E-G所示，显示出营养物质输送的巨大潜力。

2.4 打印后细胞活性分析为了评估打印后及牺牲材料溶解过程对细胞活力的影响，观察了打印后不同时间点的细胞活力，如图5所示。

在不同层面上可见细胞分布均匀，大部分细胞呈绿色荧光(活细胞)，少量呈红色荧光的死细胞零散分布。用Image pro plus 6.0图像分析软件对活、死细胞进行计数后，计算出凝胶中骨髓间充质干细胞的存活率，在打印12 h后和第14天的细胞存活率分别为(95.47±0.54)%，(86.36± 0.55)%，随着体外培养时间的延长，细胞存活率下降并稳定在80%以上。

2.5 细胞增殖测定 Alamar Blue法测定结果表明随着培养时间的增加，构建体中的细胞增殖呈上升趋势，如图6所示。

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引言

利用组织工程技术实现缺损组织和衰竭器官的再生，是人类解决组织缺失和器官移植供体不足问题的终极目标。传统的组织工程技术基本原理是将体外培养扩增的种子细胞复合到支架材料上，构成细胞-支架复合体，再进行体外培养或植入体内相应的病损部位^[1]。生物打印是一种新型的组织工程技术，即在计算机辅助下，按照预先设计的三维结构，将活细胞与具有生物相容性的水凝胶复合物按照层层滴加原理来制造三维组织或器官。与传统的组织工程技术相比，生物打印技术克服了传统组织工程技术的局限性，不但可构建形态、结构复杂的组织工程支架，而且可实现不同密度种子细胞在不同支架材料中的三维精确定位^[2-5]。然而，该技术多数限于简单结构或小尺寸组织的构建^[6-21]，对于复杂的组织或器官尚存在很多需要克服的困难，其中打印体中细胞代谢问题便是急需克服的难题。因为组织或器官在植入之前需行体外培养，所以打印的三维结构必须存在可充分灌注的管道，以允许营养物质、氧气的扩散。因此，大尺寸、预血管化的一体化构建是复杂组织或器官生物打印的关键^[22-23]。

然而，当前的血管化方法尚不能满足大尺寸、复杂组织器官的需求。研究表明，构建具有类似血管结构和血管网络的支架或细胞/支架复合体，可为复合体内部的细胞运输营养、氧气，并排出代谢废物，使细胞能长期存活并融合到一起，有望成为血管化的有效手段^[24]。如有研究利用同轴针头打印出具有空心圆管及其类血管网络支架，结果表明该中空圆管水凝胶具有良好的生物相容性，可有效运输和灌注细胞培养液，满足组织工程中制造大块软组织的工程化需求。Lee等^[25]以细胞-明胶混合物为生物墨水，将其打印在胶原水凝胶支架上，然后明胶液化流出，以形成可动态灌注的脉管系统，再结合内皮细胞共培养，最后形成类血管样结构体。这表明，内皮细胞在三维流体通道中可沿着管道自组装形成类血管样结构。但这些方法仍未有效解决单纯水凝胶易坍塌变形的难题，因此也限制了打印大尺寸、复杂的组织及器官^[26]。为了克服这个困难，科学家利用多喷头3D生物打印机及热塑性聚合物构建具有力学支撑的框架^[27]。这解决了水凝胶易坍塌的问题，但是因所用聚合物为非水溶性材料，故不能形成明确可控的三维网络流体通道结构，且所用聚合物为需要长时间降解的刚性材料，这不利于软组织器官的构建。

鉴于此，此次研究中提出了一种新的方案来实现类血管化、大尺寸三维结构体的一体化构建，对其进行了初步探索，为人体复杂组织和器官再生研究提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计具有三维流体通道的水凝胶构建实验。

1.2 时间及地点实验于2017年5月至2018年1月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。

1.3 材料

实验细胞：人骨髓间充质干细胞，来源于贵州医科大学附属医院，所有供者对实验知情同意。

实验主要试剂及仪器：纳米纤维素(中山纳纤丝新材料有限公司)；低熔点琼脂糖粉末(上海生工生物工程股份有限公司)；海藻酸钠(Sigma-Aldrich)；CaCl₂(Sigma-Aldrich)；细胞Live/dead染色试剂盒(北京百奥莱博)；聚乙烯醇线材，直径1.75 mm，熔化点160-170 ℃，密度1.25/cm³(深圳光华伟业股份有限公司)；3D打印机(Creater Pro，浙江闪铸三维科技有限公司)；激光共聚焦显微镜LSM 5 Excitor (Carl Zeiss)；青霉素(哈药集团制药总厂，中国)；链霉素(华北制药集团，中国)；胎牛血清(杭州四季青，中国)；DMEM (Gibco公司，美国)；L-谷氨酰胺(北京索莱宝科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 生物墨水制备以下所用溶剂为PBS，除非另有说明。配制含质量浓度10 g/L海藻酸钠、5 g/L纳米纤维素和15 g/L的低熔点琼脂糖混合溶液，并在120 ℃下高压灭菌 2 h，37 ℃保存。

1.4.2 三维模型建模用逆向工程软件(Catia)设计CAD模型。拟构建牺牲“骨架”的内部结构为纵横交错的圆柱体，外形尺寸为45 mm×45 mm×45 mm，内部圆圆柱体直径和牺牲骨架的壁厚均为1 mm，由其构成的三维网格尺寸为5 mm×5 mm×5 mm；外部结构为带有微孔的薄壁，微孔孔径分别为100，200，300，400 μm，定义此牺牲骨架由聚乙烯醇纤维沉积；定义内部圆柱体之间的孔隙由细胞生物墨水来填充，如图1所示。然后将4种具有不同微孔直径的牺牲部分与填充部分以STL数据格式分别导出。

1.4.3 牺牲骨架打印参数的优化为了打印精确的3D结构，必须针对所选牺牲材料的打印参数进行优化。将测试圆筒的STL格式数据导入FDM打印机的控制软件中，设置主要打印参数，如表1所示。根据不同的参数分别生成Gcode码，然后将聚乙烯醇线材装入打印机喷头中，按照预先设置的参数打印牺牲骨架(n=5)，筛选出最优的主要打印参数。

1.4.4 细胞培养与细胞生物墨水制备在贵州医科大学附属医院(所有供者对实验知情同意^[28])，于无菌环境下收集患者骨髓血，将骨髓血置于4 ℃低温离心机内，1 500 r/s离心5 min，获得分层液体，收集下层液体并按1∶1的比例加入L-DMEM完全培养基，充分吹打均匀后按细胞浓度约1×10⁹ L^-1种植于75 cm²细胞培养瓶，并将其放入温度为37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱内扩增，取第4代骨髓间充质干细胞用于后续实验。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化、收集、计数对数生长期的第4代骨髓间充质干细胞，使用锥虫蓝染色确定初始细胞活力后，将其封装在上述生物墨水中并混匀，最终获得细胞浓度为3×10⁹ L^-1的细胞生物墨水。

1.4.5 3D打印具有微网络流体通道的结构体采用环氧乙烷灭菌聚乙烯醇，装入根据FDM双喷头打印机改装的生物打印机喷嘴1中，将细胞生物墨水装入无菌的点胶针筒中，并通过点胶针头与喷嘴2链接。然后喷嘴1按照预先设计的CAD数字模型及优化后的成形参数挤出微丝，进行有序沉积，形成内外牺牲骨架；细胞生物墨水经喷嘴2挤出并按照预先设计的程序进行有序的填充内部牺牲骨架之间的孔隙，有序逐层完成打印。根据上述筛选出的最优打印参来设置生物打印的主要控制参数：喷头1打印温度为180 ℃，其内径为0.4 mm，打印速率为70 mm/s；喷头2打印温度为37 ℃，其内径为1.6 mm，气动挤出压力为 0.03 MPa，底板温度为37 ℃。打印完成后将其三维构建体取出，置入含2%CaCl₂溶液中交联15 min，然后用PBS漂洗3次以去掉交联剂对细胞的影响，随后将其转入含青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L及体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。每15-30 min更换培养基并用PBS漂洗二三次，待聚乙烯醇完全溶解去除后，改为每48 h更换培养液。整个过程均在无菌环境下进行。

1.5 主要观察指标

细胞活性分析：为了评估该构建方案对细胞活力的影响，分别对第12小时、14 d和28 d构建体中的细胞进行活/死染色实验。取5 mm×5 mm的组织块，用PBS漂洗3次(3× 5 min)，随后根据Live/dead试剂盒说明书进行染色。使用激光共聚焦显微镜分别在488 nm(CAM激发波长)和543 nm (PI激发波长)的激发光下观察构建体内细胞的活性，沿Z轴每隔20 μm对构建体进行拍照。每个构建体任意选取6个激光共聚焦扫描层面图像，用Image pro plus 6.0软件对图像中绿色、红色点的个数进行计数(红色光点代表死细胞，绿色光点代表活细胞)，计算细胞成活率，细胞成活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

细胞增殖：使用Alamar Blue测定试剂盒(DAL1100；Life Technologies)检测构建体内细胞在第1，7，14，21，28天的增殖情况，根据试剂盒说明书进行检测。简而言之，将测定溶液与细胞培养基以1∶10的体积比混合后，将其加入到每个构建体中并37 ℃孵育5 h。温育后，取每个样品的测定溶液100 μL放入96孔板中，使用多功能酶标仪在544 nm/590 nm(SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)的激发/发射下测量荧光强度。除去所有测定溶液并用PBS洗涤样品2次后，将样品进一步培养以用于下一个实验。

1.6 统计学分析结果采用均数±标准误表示。采用单因素方差分析，数据采用SPSS 17.0软件进行处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 三维牺牲骨架的设计及三维流体通道形成牺牲骨架是此次研究中三维生物打印蓝图设计的核心部分，因为其可维持生物墨水在凝胶化前的力学以不至于坍塌，故能起到很好的塑形作用。在生物墨水不从微孔渗出的前提下，为了使CaCl₂溶液与生物墨水在牺牲骨架溶解前接触，以达到Ca²⁺与海藻酸钠快速交联，同时减少交联时间的目的。理论上，生物墨水与交联剂接触的越充分，交联所需要的时间就越少，继而钙离子对细胞的活性和增殖影响就越小。为达此目的，在牺牲骨架的壁上设计了相同数量的4种不同直径微孔，分别是100，200，300，400 μm，孔径参数优化结果提示：当直径为300，400 μm时有大量生物墨水渗出，因此不符合目的要求；而当微孔孔径为100，200 μm时均无生物墨水渗出，但200 μm比100 μm孔径大，故所渗入到内部的交联剂的量和速度均优于100 μm的孔径。因此，200 μm的孔径是最佳选择。而在三维结构体的内部，则设计为微管纵横交错的结构。笔者定义聚乙烯醇来打印

内外部牺牲骨架，其具有生物相容性，易溶于水，能够与含有细胞的水凝胶共同打印，因此在打印完成后将它溶解掉，随之形成纵横交错的微网络流体通道，这与水凝胶自身的微孔隙相连形成多级的管道系统，从而有利于培养基的顺畅灌注，进而有利于促进氧气与营养的扩散^[29]，延伸扩散极限(100-200 μm)^[30]，同时有利于细胞代谢产物的排出。

此次实验中，牺牲骨架是基于牺牲材料聚乙烯醇的良好刚性和水溶性来设计，相比其他牺牲材料，如明胶^[25]、琼脂糖^[31]、Pluronic F127等^[32]，该牺牲骨架在尺寸、形状、结构设计和打印方面更可控，而明胶、琼脂糖和Pluronic F127为凝胶类材料，刚性较差，因此限制了牺牲骨架设计和打印的可控性。此次实验之所以将牺牲骨架的内部微管直径设计为1 mm，即微流体通道的孔径。据文献报道，生物打印的微流体管道孔径多数在数百微米左右^[33]，而此次实验所构建的尺寸为1 mm，这与文献所报道的并不矛盾，因为所构建的技术及所用牺牲材料和研究目的等不一样，故所构建的尺寸不一致。而实验所用聚乙烯醇因遇水易溶解变形，故对于直径较细的聚乙烯醇丝容易在水凝胶固化前溶解，导致微流体通道塌陷，因此为了初步探索该构建方案可构建出具有微流体通道大尺寸结构体的可行性，故选择直径较大的流体管道进行探索。然而对于数百微米甚至数十微米级的管道构建，需要对构建技术、生物墨水和聚乙烯醇材料进行优化，如改进技术以提高打印精度，同时改性聚乙烯醇以明显减缓遇水就发生溶解的速度，这也正是本课题组后续的研究方向之一。

3.2 牺牲骨架打印精度分析为了获得高精度的具有微网络流体通道的结构，便于培养基的顺畅灌注，对牺牲骨架的主要打印参数进行了优化，得出打印温度180 ℃、打印速度70 mm/s、填充率20%、打印层厚0.2 mm、喷头内径0.4 mm和底板温度37 ℃时所打印的牺牲骨架精度最高。虽然局部仍有拉丝现象，但是正好可作为微米级的牺牲骨架。然而在此次研究中只根据当前的打印机进行了优化，尚未与其他打印机作出对比，由于不同打印机的自身精度和参数设置项目有所差异，故牺牲骨架的打印精度应根据具体的打印机进行优化。值得注意的是，由于聚乙烯醇在空气中暴露太久后会发潮，因此在调节打印温度时应根据其具体情况进行调整。

3.3 打印后细胞的活性和增殖评价评价细胞打印效果的关键指标是打印后细胞活性和细胞增殖。打印过程和材料牺牲过程容易对细胞造成损伤，如果不能使细胞所受损伤降至最低或零损伤，打印所得的三维结构体亦将随着细胞的大量死亡而失去意义。此次研究中的骨髓间充质干细胞经三维生物打印后，第12小时存活率可达(95.47± 0.54)%，随着培养时间的增加，细胞存活力有所下降，但生存能力保持稳定且细胞从圆形或椭圆形向梭形生长增殖，并继续保持80%以上可达6周甚至更久，这与其他同类技术研究结果相比，细胞存活率较高，维持时间较长^[34-38]。虽然打印聚乙烯醇的喷嘴温度为180 ℃，但该喷嘴并不直接与打印细胞生物墨水喷头及细胞生物墨水接触，且在聚乙烯醇打印喷嘴侧面安装了快速降温系统，以加快打印后快速降温。此外，在喷嘴1与喷嘴2之间有个缓冲时间，即喷嘴1打印好一层之后，喷嘴2才开时打印相应的生物墨水层，同时，水凝胶对细胞也具有一定的保护作用，可缓冲一定的热传递损伤。因此，打印温度对细胞的热传递损伤就明显减小，但损伤还是存在的。为了进一步评估这一影响，采用 Alamar Blue检测打印后4周内骨髓间充质干细胞在三维结构体中的增殖情况，结果表明骨髓间充质干细胞在三维结构体内的增殖呈上升趋势。

此次研究实现了骨髓间充质干细胞-海藻酸钠-琼脂糖-纳米纤维素共混物在生物打印设备上按照一定参数打印，成功构建具有多级微网络流体通道、自定义形状、尺寸的三维结构体，打印后12 h的细胞存活率为(95.47±0.54)%，骨髓间充质干细胞在该结构体内可增殖。尽管此次研究是利用基于FDM打印机改装的生物打印设备构建的预血管化结构体，但在很大程度上解决了打印体内细胞的代谢困难问题，以及单纯水凝胶易坍塌问题，进一步推动了三维生物打印技术在复杂组织、器官再造中的应用，相信随着进一步的优化及内皮细胞的加入，该技术可能产生临床上有用的复杂组织器官，其在精确位置并入多种细胞类型，以重现构建体的结构和功能。因此在生物制造具有临床相关尺寸的预血管化的组织器官方面具有潜力，可作为解决移植供体器官不足的新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

生物打印具有微网络流体通道的三维结构

Bioprinting of 3D structure with micro-network fluidic channels

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