左归丸调控DKK1靶点防治糖皮质激素性骨质疏松

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0230

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (16): 2520-2525.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0230

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左归丸调控DKK1靶点防治糖皮质激素性骨质疏松

张志达1，任辉2，沈耿杨1，张玉卓1，招文华1，余翔1，尚奇1，余佩沅1，梁德2，杨志东2，姚珍松2，江晓兵2

1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2018-01-31 出版日期:2018-06-08 发布日期:2018-06-08
通讯作者: 江晓兵，博士，副教授，广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东省广州市 510405 通讯作者：姚珍松，博士，副主任医师，广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东省广州市 510405
作者简介:张志达，男，1991年生，广东省河源市人，汉族，广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科硕士，主要从事骨质疏松脊柱伤病研究。
基金资助:
广东省科学技术厅自筹经费类项目(20140221)；国家自然科学基金项目(81503591，81774338，81674000)；广东省自然科学基金项目(2016A030313645)；广东省科学技术厅项目(2016A020226006)；广州中医药大学第一临床医学院优秀博士论文培育项目(YB201602)；广州中医药大学第一附属医院创新强院项目(2015QN03)

Zuogui pill regulates DKK1 in the prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis

Zhang Zhi-da1, Ren Hui2, Shen Geng-yang1, Zhang Yu-zhuo1, Zhao Wen-hua1, Yu Xiang1, Shang Qi1, Yu Pei-yuan1, Liang De2,
Yang Zhi-dong2, Yao Zhen-song2, Jiang Xiao-bing2

1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2018-01-31 Online:2018-06-08 Published:2018-06-08
Contact: Jiang Xiao-bing, M.D., Associate professor, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China Corresponding author: Yao Zhen-song, M.D., Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Zhang Zhi-da, Master, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the Self-Financing Project of Science and Technology Department of Guangdong Province, No. 20140221; the National Natural Science Foundation of China, No.81503591, 81774338 and 81674000; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2016A030313645; the Project of Science and Technology Department of Guangdong Province, No. 2016A020226006; the Excellent Doctoral Paper Training Project of the First Clinical Medical School of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. YB201602; the Innovation and Strengthening Hospital Project of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. 2015QN03

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
糖皮质激素性骨质疏松：长期摄入外源性的糖皮质激素引起的以骨量降低、骨微细结构破坏和骨强度降低，骨折风险增加的一种慢性系统性骨骼疾病，是最常见的继发性骨质疏松。
DKK1：全称dickkopf-1，是Wnt/β-catenin经典信号通路的抑制因子，与Wnt蛋白竞争性结合Frizzle-LRP5/6复合受体，降低配体Wnt的结合率，从而抑制Wnt信号通路转导。

摘要
背景：中医药可有效防治糖皮质激素性骨质疏松，但其防治机制尚不明确。DKK1是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，糖皮质激素可诱导其上调。因此，DKK1蛋白是防治糖皮质激素性骨质疏松的重要靶点。
目的：探讨左归丸防治糖皮质激素性骨质疏松中对DKK1的调控作用。
方法：18只3月龄雌性SD大鼠随机均分为3组：空白组、模型组和左归丸组。模型组和左归丸组大鼠皮下注射地塞米松建立糖皮质激素性骨质疏松模型；空白组给予等体积生理盐水；左归丸组皮下注射地塞米松同时给予左归丸水提液灌胃。1个月后取大鼠腰椎进行micro-CT检测骨量及骨微细结构、压缩试验检测生物力学性能，qPCR测定腰椎DKK1、Runx2和CTSK mRNA表达；血清检测碱性磷酸酶活性。
结果与结论： ①与空白组比较，模型组体积骨密度、相对骨体积、骨小梁数量和骨小梁厚度显著降低(P < 0.05)，骨小梁间距和结构模型指数较空白组显著增大(P < 0.05)，血清碱性磷酸酶活性较空白组呈降低趋势，DKK1 mRNA表达显著上调(P < 0.05)，成骨相关因子Runx2 mRNA表达呈下调趋势，破骨相关因子CTSK mRNA呈上调趋势；②与模型组比较，左归丸组体积骨密度、相对骨体积和骨小梁数量显著提升(P < 0.05)，结构模型指数显著降低(P < 0.05)，骨小梁间距有减小趋势但差异无显著性意义，血清碱性磷酸酶活性较模型组呈升高趋势，DKK1 mRNA表达显著下调(P < 0.05)，Runx2 mRNA表达呈上调趋势，CTSK mRNA呈下调趋势；③与模型组比较，左归丸组椎体压缩强度显著提升(P < 0.05)；④结果说明，左归丸可能通过下调DKK1的表达防治糖皮质激素性骨质疏松。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2878-6247(张志达)

关键词: 左归丸, 激素性骨质疏松, 骨密度, DKK1, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Chinese medicine is effective for preventing and treating glucocorticoid-induced osteoporosis, however, the underlying mechanism remains unclear. DKK1, an inhibitor of Wnt/β-catenin signaling pathway, can be up-regulated by glucocorticoid. Thereafter, DKK1 is an important target in the prevention and treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the regulatory effect of Zuogui pill on DKK1 in the prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis.
METHODS: Eighteen three-month-old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: control group, model group and Zuogui pill group. Rats in the model and Zuogui pill groups received the subcutaneous injection of dexamethasone to establish the model of glucocorticoid-induced osteoporosis. The Zuogui pill group rats were administrated Zuogui pill extracts, and the control rats were given the same volume of normal saline. At 1 month after modeling, the lumbar vertebrae were removed to test the bone mass and microstructures by micro-CT scanning. The biomechanical properties were detected by compression test. The mRNA expression levels of DKK1, Runx2 and CTSK were determined by Qpcr. The serum alkaline phosphatase activity was tested.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, in the model group, the volumetric bone mineral density, trabecular bone volume fraction, trabecular number, and trabecular thickness were significantly decreased (P < 0.05), the trabecular separation and structure model index were significantly increased (P < 0.05). The serum alkaline phosphatase activity was on a decline. The mRNA expression level of DKK1 showed a significant up-regulation (P < 0.05). The mRNA expression level of Runx2 showed a down-regulated trend while mRNA expression level of CTSK showed an up-regulated trend. Compared with the model group, the Zuogui pill group showed significantly enhanced volumetric bone mineral density, trabecular bone volume fraction, and trabecular number (P < 0.05); the structure model index was significantly decreased (P < 0.05); the trabecular separation was reduced; the serum alkaline phosphatase activity was enhanced; the mRNA expression level of DKK1 showed a significant down-regulation (P < 0.05); the mRNA expression level of Runx2 showed an up-regulated trend while mRNA expression level of CTSK showed a down-regulated trend. The vertebral compressive strength in the Zuogui pill group was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). In summary, Zuogui pill prevents and treats glucocorticoid-induced osteoporosis possibly through the down-regulation of mRNA expression of DKK1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Bone Density, Alkaline Phosphatase, Osteoporosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张志达，任辉，沈耿杨，张玉卓1，招文华，余翔，尚奇，余佩沅，梁德，杨志东，姚珍松，江晓兵. 左归丸调控DKK1靶点防治糖皮质激素性骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2520-2525.

Zhang Zhi-da1, Ren Hui2, Shen Geng-yang1, Zhang Yu-zhuo1, Zhao Wen-hua1, Yu Xiang1, Shang Qi1, Yu Pei-yuan1, Liang De2, . Zuogui pill regulates DKK1 in the prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2520-2525.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠18只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 左归丸提升骨量、改善骨微细结构见图1(A-F)，激素干预1个月后，模型组体积骨密度、相对骨体积、骨小梁数量和骨小梁厚度较空白组显著降低(P < 0.05)，骨小梁间距和结构模型指数较空白组显著增大(P < 0.05)，模型建立成功；与模型组比较，左归丸组体积骨密度、相对骨体积和骨小梁数量显著提升(P < 0.05)，结构模型指数显著降低(P < 0.05)，骨小梁厚度有增加趋势、骨小梁间距有减小趋势但差异皆无统计学意义。模型组大鼠椎体骨小梁较空白组稀疏，而左归丸组骨小梁较模型组密集，与空白组差异不明显。

2.3 左归丸对糖皮质激素性骨质疏松大鼠血清碱性磷酸酶活性影响见图2，模型组大鼠血清碱性磷酸酶活性较空白组减低，左归丸组较模型组增高，但差异均无显著性意义。

2.4 左归丸增加糖皮质激素性骨质疏松大鼠椎体骨强度见图3，与空白组比较，模型组大鼠椎体压缩强度显著降低(P < 0.05)；与模型组比较，左归丸组压缩强度显著提升 (P < 0.05)。模型组压缩刚度、压缩位移和能量吸收均较空白组降低，左归丸组压缩刚度、压缩位移和能量吸收均较模型组提升，但差异均无显著性意义。

2.5 左归丸对成破骨调节因子Runx2、DKK1、CTSK mRNA表达的影响见图4，与空白组比较，模型组大鼠椎

体组织DKK1表达显著上调(P < 0.05)；与模型组比较，左归丸组DKK1表达显著下调(P < 0.05)。模型组成骨调节因子Runx2较空白组下调、左归丸组Runx2较模型组上调无统计学意义；模型组破骨调节因子CTSK较空白组上调，左归丸组CTSK较模型组上调，但差异均无统计学意义。

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引言

糖皮质激素性骨质疏松是继发于糖皮质激素摄入后的一种系统性骨骼疾病，是最常见的继发性骨质疏松，其防治机制研究受到国内外学者的普遍重视^[1]。据流行病学资料显示，在长期(6月以上)使用糖皮质激素人群中约有26%继发骨质疏松^[2]，且骨密度的丢失与糖皮质激素累积剂量有关^[3]。骨质疏松主要的并发症是骨折，糖皮质激素的每日剂量与骨折风险密切相关^[4]。长期使用糖皮质激素治疗的成年患者中，有30%-50%发生骨折^[5]，而每日剂量5 mg或以下的泼尼松龙可增加20%的骨折风险，每日20 mg或以上剂量使骨折风险增加60%^[3^，^6]。糖皮质激素性骨质疏松发病率高，明显增加骨折风险，极大增大医疗和经济负担。

Wnt/β-catenin信号通路是调节成骨细胞分化、促进成骨的重要信号通路^[7-9]，其下调是糖皮质激素性骨质疏松发病的重要机制^[10-12]。Dickkopf相关蛋白1(DKK1)是该通路重要的抑制剂^[13-14]，研究显示糖皮质激素可诱导DKK1表达上调从而抑制Wnt/β-catenin信号通路^[15]。因此，DKK1蛋白是防治糖皮质激素性骨质疏松的重要靶点^[16]，这将为糖皮质激素性骨质疏松的防治提供光明前景。

骨质疏松属于中医“骨痿”范畴，糖皮质激素性骨质疏松虽未见载于中医古籍，但历代文献中可发现与糖皮质激素性骨质疏松临床表现颇为相似的“骨痿”的论述。中医典籍《素问•痿论》中记载：“肾主身之骨髓……肾气热则脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”。现代中医认为糖皮质激素为阳刚燥热之品，久服易伤阴液，肾阴不足则肾阳失去滋养，阳气化生不足，致肾阳亏虚，阴损及阳，进而影响骨髓生化功能，导致糖皮质激素性骨质疏松发病。所以，肾虚精亏是糖皮质激素性骨质疏松主要基本病机。而近年来研究发现，补肾中药在糖皮质激素性骨质疏松的防治中的确体现出明显优势^[17-18]。但其防治机制尚不明确。因此，本研究拟应用补肾填精中药复方左归丸干预糖皮质激素性骨质疏松大鼠，探讨其防治过程中对DKK1的调控作用，丰富了中医药防治糖皮质激素性骨质疏松机制的理论。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年6月至2017年9月在广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室、广州中医药大学第一附属医院科研实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级3月龄SD雌性大鼠18只，体质量为(230±20) g。所有大鼠购自广州中医药大学实验动物中心，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心(SYXK [Yue] 2013-0092)，自由摄食饮水。

1.3.2 实验药物中药复方制剂左归丸(主要成分：熟地黄、菟丝子、牛膝、龟板胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子，北京同仁堂股份有限公司，54 g/瓶，国药准字Z11020735)研磨，纯净水溶解，加热浓缩至所需浓度，并高压蒸汽灭菌，装于无菌瓶置4 ℃冰箱保存备用；地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司，5 g/L，国药准字H42020019)，用前生理盐水稀释成1 g/L。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与给药大鼠根据体质量排序分层、随机抽取方法，均分为3组：空白组、模型组和左归丸组，每组6只。参照既往文献^[19-21]，模型组和左归丸组皮下注射地塞米松(每3 d 0.6 mg/kg)，注射1个月，空白组皮下注射等体积生理盐水，注射1个月；同时，参考人-大鼠体表面积换算，左归丸组进行左归丸水提液(质量浓度220 g/L)灌胃 [1.9 g/(kg•d)]，空白组和模型组用等体积蒸馏水灌胃。

1.4.2 标本采集实验开始1个月后取材。用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血后大鼠死亡，取血液静置2 h离心(3 000 r/min，15 min)，获取血清，冻于-80 ℃冰箱；取骨标本，分离出L₁和L₂，剔除软组织，L₁用40 g/L多聚甲醛保存于4 ℃冰箱，待进行micro-CT扫描，去除附件结构，进行骨生物力学测定；L₂去除附件装冻存管置-80 ℃冰箱保存，待进行qPCR检测。

1.4.3 血清碱性磷酸酶活性检测大鼠血浆解冻溶解后，使用碱性磷酸酶(AKP)活性试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京)检测碱性磷酸酶活性。

1.4.4 骨微细结构扫描取L₁进行micro-CT扫描，扫描范围设定为椎体中部1/3，每个椎体扫描200层，设置每层厚度为14 μm，扫描时电压和电流分别设定为55 kV和80 μA。扫描后应用micro-CT自带分析软件μCT80 Evaluation Program(v6.5-1，Scanco Medical，瑞士)进行分析，感兴趣区域(VOI)设置为椎体内直径2 mm的圆形范围的松质骨区域(以椎体内正中为圆心)，获取VOI骨微细结构参数体积骨密度(vBMD，mg HA/ccm)、相对骨体积(BV/TV，%)、骨小梁数量(Tb.N，1/mm)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁间距(Tb.Sp，mm)和结构模型指数(SMI)。

1.4.5 骨生物力学测试 micro-CT扫描后游离L₁椎体并去除附件及上下终板(确保椎体上下两面平行，高约 5 mm)，置于万能材料试验机上，以1 mm/min速度进行压缩实验检测结构强度。获取压缩强度、压缩刚度、压缩位移、能力吸收等参数。

1.4.6 实时荧光定量PCR 取腰椎L₂ 50-60 mg，液氮中迅速研磨充分后用DBI公司提取试剂盒提取总RNA，Thermo全波长酶标仪分析RNA浓度和纯度，DBI公司Bestar qPCR RT Kit反转录盒进行cDNA合成反应，根据SybrGreen qPCRmasterMix操作步骤，使用Stratagene Mx3000P Real time PCR仪进行两步法定量分析，反应条件设置为94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环，每个样本设置3个技术重复孔，扩增用引物序列见表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因	引物序列(5’-3’)
DKK1	上游：GGC TCT GTC TGC CTC CGA TC
DKK1	下游：GCC TTT CCT CCT GTG CTT GG
Runx2	上游：CTT CCC AAA GCC AGA GCG
Runx2	下游：CAG CGT CAA CAC CAT CAT TC
CTSK	上游：TTG ACT CTG AAG ACG CTT ACC C
CTSK	下游：ATA GCC CAC CAC CAA CAC G
GAPDH	上游：GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA
GAPDH	下游：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠血清碱性磷酸酶活性；②骨微细结构参数：体积骨密度、相对骨体积、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁间距和结构模型指数；③生物力学参数：压缩强度、压缩刚度、压缩位移和能量吸收；④mRNA相对表达量：DKK1 mRNA、Runx2 mRNA、CTSK mRNA等。

1.6 统计学分析借助SPSS 19.0软件进行数据分析，实验数据均为计量资料，各组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用LSD分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

现代中医认为，肾虚精亏是糖皮质激素性骨质疏松的主要病机^[22-24]。肾藏精，精生髓，髓生骨。补肾填精，精足则髓充，髓在骨内，髓充则骨得滋养，骨受养则强，故补肾填精能有效防治糖皮质激素性骨质疏松^[17^，^25]。本研究应用补肾填精中药复方左归丸干预糖皮质激素性骨质疏松大鼠，并初步探讨了其起效机制，证实了左归丸防治糖皮质激素性骨质疏松的疗效，发现左归丸可能是通过下调DKK1的表达防治该病的机制。这将充实中医“肾主骨生髓”理论的实验基础，为临床采用补肾法防治糖皮质激素性骨质疏松提供依据，丰富中医药防治该病的机理，这将有利于中医药的推广。

Wnt/β-catenin信号通路是调节成骨的经典通路，Wnt配体通过与Frizzled受体(Fz)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)结合，活化Fz受体，通过骨架蛋白(Dv)和酪蛋白激酶1 ( CK1)传递信号，防止GSK3β/APC/Axin蛋白复合物将β-catenin磷酸化和降解，β-catenin在胞浆中积聚并转位入核，与转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF/LEF) 结合启动靶基因如c-myc、cyclin D1的转录，促进细胞的增殖或活化^[26]。DKK1是Wnt/β-catenin信号通路的上游抑制因子，通过与Kremen蛋白结合形成，导致细胞膜上LRP5/6被细胞摄入而清除，从而阻断Wnt信号通路的转导^[13]。因此，其表达水平直接影响下游Wnt信号通路的转导，对成骨分化具有重要调控作用。既往研究发现，骨组织DKK1表达水平与小鼠骨量成反比，血清DKK1水平升高与人骨微细结构破坏密切相关^[27]，本研究也显示了类似结果：糖皮质激素(地塞米松)干预1个月后大鼠椎体vBMD、骨微细结构和骨强度均受到损害(造模成功)，同时DKK1表达上调。

Liu等^[18]的研究显示，左归丸可上调成骨细胞Wnt/β-catenin通路的重要信号蛋白Wnt、LRP5和β-catenin的表达，改善骨组织微形态。这与作者应用左归丸干预后糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨损害得到改善的研究结果相一致。此外，实验结果中发现，左归丸能显著下调Wnt通路的上游抑制因子DKK1的表达，从而阻断了糖皮质激素对Wnt通路的抑制效应。本研究中，糖皮质激素干预后大鼠成骨相关因子Runx2呈下调趋势，破骨相关因子CTSK呈上调趋势，左归丸干预后Runx2 mRNA较模型组呈上调趋势、CTSK mRNA呈下调趋势，也提示了左归丸调控DKK1促进成骨、抑制破骨防治糖皮质激素性骨质疏松的作用。

碱性磷酸酶是评定骨重建活跃性和成骨细胞活动性的重要指标，它既反映成骨细胞的分化成熟程度，又是成骨细胞功能的标记物^[28]。本研究发现，左归丸能逆转糖皮质激素诱导的血清碱性磷酸酶活性的降低，提示了左归丸在骨代谢过程中促进骨形成的作用。本研究中血清碱性磷酸酶活性与DKK1 mRNA表达呈现的负相关趋势，其生物学关系值得后续进一步探讨。另外，研究中，大鼠皮下注射地塞米松1月可成功建立糖皮质激素性骨质疏松模型，且同时应用左归丸干预后(左归丸组)骨密度和骨强度较模型组明显较提升，且主要研究靶点DKK1 mRNA表达明显上调，因此并非必需延长实验时间。

总之，左归丸可有效改善糖皮质激素性骨质疏松骨矿含量和骨质量，并下调DKK1的mRNA表达，提示了DKK1可能是左归丸抗糖皮质激素性骨质疏松的重要靶点，其机制可能是通过下调DKK1的表达，进而阻断了糖皮质激素对Wnt/β-catenin通路的抑制。然而由于本研究经费及时间的限制，本研究仅左归丸的作用靶点进行了初步探讨，如缺少DKK1蛋白的表达，研究仅限于体内等，后续仍需完善体外研究及引入基因克隆等技术进行深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

左归丸调控DKK1靶点防治糖皮质激素性骨质疏松

Zuogui pill regulates DKK1 in the prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis

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