细胞块技术在胸腔积液病理诊断评估中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0210

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胸膜腔：是位于肺和胸壁之间的一个潜在腔隙。在正常情况下脏层胸膜和壁层胸膜表现上有一层很薄的液体，在呼吸运动时起润滑作用。胸膜腔和其中的液体并非处于静止状态，在每一次呼吸周期中胸膜腔的形状和压力均有很大变化，使胸膜腔内液体持续滤出和吸收并处于动态平衡。
胸腔积液：各种因素使胸膜腔内液体形成过快或吸收过缓，即产生胸腔积液，简称胸水。

摘要
背景：目前细胞学涂片是胸腔积液的常规检测方法，但其结果往往不能令人满意，实验利用胸腔积液制成细胞块并且结合免疫化学和基因检测的方法完善其结果准确性以及对预后治疗的帮助。
目的：探讨胸水细胞块技术在胸腔积液病理诊断和分析中的应用价值。
方法：收集2016年1月至2017年8月北京大学第一医院病理科胸腔积液标本105例，离心后提取有效成分制作石蜡块切片并苏木精-伊红染色，同时进行免疫组织化学标记，对诊断为肺癌者进一步切蜡膜卷提取脱氧核糖核酸行相关基因检测。
结果与结论：常规细胞学涂片恶性检出率30.5%(32/105)，明显低于细胞块切片恶性检出率44.8%(47/105)，细胞块切片结合免疫组织化学染色分析恶性检出率最高达57.1%(60/105)，并可诊断肿瘤具体组织类型。105例中19例肺腺癌细胞块标本行肺癌相关基因检测，核酸质量均合格，其中13例检测到基因突变。结果说明，细胞块合并免疫组织化学染色是胸腔积液诊断良恶性肿瘤及肿瘤来源有效的方法，并且能够进一步检测基因突变情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3811-5490(赵业)

关键词: 胸腔积液, 细胞块, 免疫组织化学, 基因检测, 恶性肿瘤, 肺腺癌, 液基细胞学, 肿瘤标志物, 鉴别诊断, 套细胞淋巴瘤

Abstract:

BACKGROUND: Cytologic smear is a routine detection method for pleural effusion, but the results are far from satisfactory. Therefore, pleural effusion is made into cell block for immunochemistry and gene detection, to improve the detection accuracy, which contributes to the treatment and prognosis of pleural effusion.
OBJECTIVE: To explore the application value of cell block technology in the pathological diagnosis and molecular detection of pleural effusion.
METHODS: Totally 105 cases of pleural effusion samples were collected at Department of Pathology, Peking University First Hospital between January 2016 and August 2017. Effective components extracted after centrifugation were used to make paraffin blocks for hematoxylin-eosin staining and immunocytochemical staining thereafter. Genetic mutations were further detected in the cases of lung cancer diagnosed by cytology.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive rate of routine cytological smear was 30.5% (32/105), which was significantly lower than that of the cell block section (44.8%, 47/105). The positive rate of immunocytochemical staining combined with cell block was the highest one with 57.1%, 60/105). Besides, this method could be used to identify tumor types. Gene mutation detection was performed in 19 cases of lung cancer, among which 13 cases were positive. These results indicate that cell block technology combined with immunocytochemical staining is an effective method for the diagnosis of malignancy and tumor origin in pleural effusion, and can be further used for mutation detection.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Pleural Effusion, Cytological Techniques, Immunohistochemistry, Pathology, Molecular, Neoplasms

中图分类号:

R318

赵业，张继新，梁丽，李挺. 细胞块技术在胸腔积液病理诊断评估中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1934-1938.

Zhao Ye, Zhang Ji-xin, Liang Li, Li Ting. Cell block technology in the pathological diagnosis of pleural effusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1934-1938.

图/表（结果） 2

2.1 常规细胞学诊断结果纳入的105例胸水标本中，63例(60.0%)诊断为良性，32例(30.5%)恶性，10例(9.5%)由于涂片中细胞重叠、成分少、结构不清、背景不清晰等诊断为不确定或可疑恶性。

2.2 细胞块切片及免疫标记诊断结果纳入的105例胸水标本经细胞块切片苏木精-伊红染色，其中47例(44.8%)诊断为恶性，较常规TCT制片阳性率明显增高(P < 0.05)。其中常规细胞学不确定的10例均被确诊为恶性，另外5例TCT制片中见小淋巴细胞、巨噬细胞，中性粒细胞及间皮细胞等，诊断为良性，但在细胞块切片中观察到腺样或小团状异型细胞。实验对细胞块进一步加做免疫组织化学，结果发现，45例(42.9%)诊断为良性，60例(57.1%)恶性(表1)，阳性率显著高于常规细胞学涂片(P < 0.05)。恶性病例中，肺腺癌27例(图2)，转移癌腺癌考虑胃肠道来源3例，腺癌(形态上表现为腺癌形态，但免疫标记缺乏支持)3例，鳞癌1例，淋巴瘤1例(图3)，肉瘤样癌1例，非小细胞癌1例，乳腺癌转移3例，浆细胞肿瘤2例，剩余18例细胞块中均见异型细胞团聚集，考虑恶性肿瘤细胞，未行免疫组织化学检测(表2)。

有18例常规细胞学涂片诊断为良性，经细胞块加做免疫组织化学检测后证实为恶性肿瘤，细胞块联合免疫组织化学检测为诊断恶性的金标准，其灵敏度和特异度均为100%，常规细胞学检测的灵敏度为53.3%，特异度为60.0%，明显低于前者。

2.3 细胞块标本相关基因检测在105例标本中19例肺腺癌细胞块标本行EGFR，KRAS，ALK及ROS1基因检测。19例核酸质量均合格。19例中11例检测到EGFR突变[有5例的19外显子缺失，6例的21外显子点突变(L858R)]、2例EML4-ALK基因融合；未检测到K-ras突变和ROS1融合。

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引言

目前肺癌的发病率以及死亡日益增加，除了组织学及影像学等检查方法外，胸腔积液的常规细胞涂片是筛查肿瘤的手段之一，但是由于其局限性，肿瘤检出率并不理想。实验通过大量实验，对胸腔积液制作细胞块合并免疫细胞化染色，证明肿瘤检出率明显高于常规细胞学涂片，并且诊断确诊的肺癌患者进行分子病理基因检测，对患者的个体化治疗提供重要理论依据。

胸腔积液是胸肺疾病的常见症状，其中肺癌胸膜转移引起的恶性胸水约占48.6%^[1]，有研究表明约17%肺癌患者首诊时伴有胸腔积液^[2]。严重的胸腔积液由于各种复杂的临床因素，有时为病理标本获取的惟一来源和疾病诊断评估的重要依据^[3]。近年来肺癌发病和死亡率已上升为肿瘤性疾病的第一位，全世界与肺癌的抗争进入关键阶段，肺癌诊治愈加深入细致的分类、关键基因突变及靶向治疗评估、甚至免疫治疗评估需求等对病理学提出更多的需求和挑战，而常规细胞涂片技术难以满足这些需求并越来越显示出其局限性。

胸水沉渣细胞块技术简便、无需特殊设备、离心后包埋制作的石蜡块切片可明显增加细胞密度和展现细胞细微形态学结构，提高诊断敏感性，更重要的是可联系性切片，有效用于免疫细胞化学染色及多种现代病理技术检测，从而进行深入诊断评估^[4]。

实验收集北京大学第一医院病理科近1年胸腔积液标本105例，与常规细胞学制片诊断结果比较，探讨优质细胞块制作技术及其诊断敏感性，在此基础上行免疫细胞化学染色及相关基因突变分析，实践并评估细胞块技术在胸腔积液诊断评估中的重要意义^[5]。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点于2016年1月至2017年7月在北京大学第一医院病理科技术室及分子病理室完成。

1.3 材料收集北京大学第一医院病理科2016年至2017年胸腔积液标本105例。所有标本均已经完成全部诊断，全部正式报告已经发放临床。实验仅对入组病例的细胞和组织材料取少量进行研究，保存其他组织标本的完整性，不影响标本进行细胞病理学检查及诊断，实验经北京大学第一医院伦理委员会同意。

1.4 方法

1.4.1 细胞形态观察选取标本总量控制在200-500 mL之间，未添加任何抗凝剂的新鲜标本，其中血性胸水35例，黄色透明63例，毛玻璃样5例，白色浑浊2例。首先将标本静置6-12 h，移去上清液，取50 mL入试管离心，2 000 r/min，5 min，血性胸水加入血洗液(自制体积分数5%冰醋酸含量的15%乙醇水溶液)，离心至液体清亮，取底部细胞含量高的液体10-15 mL置于胸腹水液基保存液内保存(北京康思润业生物技术有限公司)，静置10 min后上机制片，晾干后体积分数95%乙醇固定10 min，苏木精-伊红染色。

1.4.2 细胞蜡块的制作另一半胸水标本放入一次性尖底塑料管中离心，2 500 r/min，10 min，加入血洗缓冲液充分混匀再次离心，反复数次留底部细胞聚集部分。移弃上清液并加入血洗缓冲液3倍量的体积分数10%中性缓冲甲醛溶液，离心静置1 h，然后用小棉棒将沉淀物取出放入包埋盒，后同常规组织标本脱水包埋，4 μm切片，苏木精-伊红染色(图1)。

1.4.3 免疫组织化学染色将60例恶性或可疑恶性胸水细胞块行免疫细胞化学分析。细胞蜡块4 μm切片，切片晾干，60 ℃以上烤片1 h至石蜡彻底溶解。染色前处理包括蛋白溶解消化、微波抗原修复等，修复液遵照抗体要求。采用全自动免疫组织化学染色机(Autostainer Link-Thermofish，美国)。选用抗体工作液(购自北京中杉金桥生物技术有限公司和Dako Denmark A/S)。染色方法选用EnVision两步法，染色过程严格按照说明书进行，苏木精复染细胞核，随后进行结果判读。

1.4.4 恶性胸腔积液诊断标准细胞学中恶性肿瘤细胞的诊断标准^[6]：细胞核异常是恶性细胞最显著特征，主要变化有：细胞核增大，核浆比增大；细胞核的形态和数目异常；核染色质粗糙，深染，呈颗粒状；核膜增厚，外形不规则。核仁异常，出现大核仁或奇异形状的核仁。细胞将也会出现异常，可增多或减少，细胞质内可见贮存物质，如黏液等。

常规细胞学超薄细胞涂片，主要基于上述细胞学的病理诊断标准。为了进一步确诊胸腔积液中细胞的性质及来源，实验进一步将恶性或可疑恶性胸腔积液制成细胞块，并加做免疫细胞化学分析协助诊断。

1.4.5 基因检测对确诊肺癌的细胞块标本行肺癌靶向治疗相关的基因检测：EGFR，K-ras基因突变检测、ALK，ROS1融合基因检测。

核酸提取：细胞蜡块切8 μm厚10张膜；采用EGFR/K-ras：FFPE DNA，CatNO.ADx-FF01； ALK/ROS1：FFPE RNA，CatNO.ADx-FF04试剂盒进行检测；提取核酸

质量检测：Nanodrop 2000，DNA OD260 nm/OD280 nm应在1.8-2.0之间，RNA 吸光度值260 nm/280 nm应在1.9-2.1。

ARMS PCR法检测：采用试剂盒：EGFR(ADx-EG01)，K-ras(ADx-KR05-MX)，ALK(ADx-AE02)，ROS1 (ADx- RO02)，按操作说明进行，stratagene Mx3000P PCR仪(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)上机检测。结果由2名分子病理诊断医师对PCR反应扩增曲线进行判读。

1.5 主要观察指标各组细胞免疫组织化学染色结果及细胞块标本相关基因检测结果。

1.6 统计学分析计数资料用百分率表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，组间数据差异比较采用χ²检验，P < 0.05差异有显著性意义。

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讨论

近年来应用细胞块技术胸腔积液细胞学诊断敏感性和准确率明显提高已受到广泛认可^[7]。虽然胸腔积液常规细胞涂片检查是长期以来采用的简便方法，主要作用是对于反应性良性与恶性细胞的初步鉴别。但由于固定、人工影响等制片技术的原因，确定诊断有较大局限性，尤其一次性制片难以进行深入技术分析更是其缺点。胸腔积液细胞块制作，使细胞聚集并在切片上均匀分布，染色后细胞结构清晰，甚至保持部分组织学结构，与外科组织标本最接近，包埋标本可长期保存。

免疫组织化学技术是全世界外科病理实验室广泛采用的实用技术，近年来技术上的快速进步和发展、可标记细胞各种类型分子抗体的大量生产，推动了该技术成为病理学核心技术。肿瘤细胞特异性抗体染色阳性可提示相应的组织起源，例如实验图2、3中提到的免疫抗体：常用的TTF-1和Napsin A阳性多提示肿瘤起源于肺或者其他组织器官源性的腺癌鉴别^[8]；CD20常用于B细胞淋巴瘤的阳性表达^[9]，CyclinD1则主要用于套细胞淋巴瘤的诊断与鉴别诊断^[10]。由于细胞学标本存在的缺点却限制了该技术的应用。有研究采用多种形式细胞标本对比进行免疫细胞化学染色，认为细胞块包埋切片为最佳材料，有诸多优点：染色背景干净、与外科病理标本更接近，着色方式更容易解释、包埋标本可连续性切片用于多种抗体标记等，对比其他细胞标本优势明显^[11]。针对胸水标本，传统细胞学涂片难以鉴别恶性肿瘤细胞和增生的间皮细胞，而细胞块结合免疫组织化学检测很好的解决这一难题。一方面提高了诊断灵敏度，另一方面，能进一步确定肿瘤细胞的来源，为临床治疗提供更有效的诊断信息。

实验中，对比常规细胞学涂片和细胞块联合免疫细胞化学检测方法不难看出，后者更加具有临床应用意义。常规传统的TCT薄层细胞学涂片中仅32例(30.5%)明确为恶性，明显低于细胞块切片结合免疫组织化学学恶性检出率(57.1%，60/105)。前者的特异度较高(100%)，但是灵敏度为76.9%，而后者的灵敏度和特异度均达100%。文献报道，传统细胞学的诊断灵敏度为50%，特异度为100%；且研究者认为在诊断肿瘤细胞性质及来源方面，细胞块技术显著优于传统的细胞学涂片^[7]。实验根据105例病例采集以及综合检查结果，细胞块切片结合免疫化学染色检测恶性率和综合诊断结果高度接近，表明了细胞块联合免疫细胞化学检测方法更加客观，具有良好的临床应用价值。

靶基因突变检测分析是指导肺癌靶向治疗的关键。由于肺癌发病的隐匿性，发现时常为中晚期、或大量胸水产生、或患者有时不能耐受手术或穿刺活检等有创性检查等，阻碍组织标本获取，因此在国际指南中不排除采用细胞标本分子检测分析作为靶向治疗的依据^[12]。实验选取19例患者确诊肺腺癌且无活检组织标本的细胞块行EGFR，ALK，ROS1及K-ras基因检测。19例中11例检测到EGFR突变、2例EML4-ALK基因融合。未检测到K-ras基因突变和ROS1基因融合。有研究应用细胞学检测晚期肺癌患者中EGFR-T790M突变率为37.5%，并和其组织学检测突变率接近^[13]。因此，细胞学靶基因突变检测分析对患者的个体化治疗提供重要理论依据^[14-24]。

总之，胸腔积液细胞块技术可明显增加细胞密度并展现细胞细微形态结构，直接提高诊断敏感性。此外可有效适用于现代病理技术，从而有助于深入肿瘤分类和靶分子活性分析，为临床提供有用信息，尤其是肿瘤晚期难以取得活检标本的患者。但是细胞块制作周期时间要比常规细胞涂片制作时间长(离心提取聚集细胞成分、固定、脱水、透明、浸蜡一般需要至少18 h完成)，再加上免疫细胞化制作过程，一般需要一两天。因此，对于临床怀疑肺癌伴随胸腔积液的患者，其胸水标本最好同时进行常规细胞学和细胞块制作，可以有效地节约时间成本，推广细胞块技术的应用具有非常重要的实际意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程