骨性关节炎与骨质疏松症共病模型兔的建立及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1025

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 421-426.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1025

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骨性关节炎与骨质疏松症共病模型兔的建立及鉴定

马文娟1，张开伟2，沈冯君2，邓致远3，程效进4

(1金沙县中医院骨伤科，贵州省金沙县 551800；2贵州省中医院骨伤科，贵州省贵阳市 550000；3武汉市中医院疼痛科，湖北省武汉市 430050；4山东省曹县中医院，山东省曹县 274400)

收稿日期:2018-08-07
通讯作者: 张开伟，博士，主任医师，贵州省中医院骨伤科，贵州省贵阳市 550000
作者简介:马文娟，1987年生，汉族，湖南省人，2017年贵阳中医学院毕业，硕士，主要从事骨与关节退行性改变及运动损伤研究。
基金资助:
贵州省优秀科技教育人才省长专项资金(黔省专合字[2012]34号)，项目负责人：张开伟；贵州省科技厅项目(黔科合中药字[2011]LKZ7022号)，项目负责人：张开伟

Establishment and identification of a rabbit model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis

Ma Wenjuan1, Zhang Kaiwei2, Shen Fengjun2, Deng Zhiyuan3, Cheng Xiaojin4

(1Jinsha Country Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinsha 551800, Guizhou Province, China; 2Guizhou Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, Guizhou Province, China; 3Department of Pain, Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430050, Hubei Province, China; 4Caoxian Country Hospital of Traditional Chinese Medicine, Caoxian 274400, Shandong Province, China)

Received:2018-08-07
Contact: Zhang Kaiwei, MD, Chief physician, Guizhou Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
About author:Ma Wenjuan, Master, Jinsha Country Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinsha 551800, Guizhou Province, China
Supported by:
Governor’s Fund for Excellent Technological and Educational Talents in Guizhou Province, No. [2012]34 (to ZKW); the Project of Guizhou Provincial Science and Technology Department, No. [2011]LKZ7022 (to ZKW)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨性关节炎：增生性骨关节病是指由于关节退行性变，以致关节软骨被破坏而引起的慢性关节病，又称退化性关节炎、骨关节炎及肥大性关节炎等。
骨质疏松症：是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。

摘要
背景：老年人群多同时患有骨性关节炎和骨质疏松症，但目前骨性关节炎与骨质疏松症两者之间的关系尚未明确。
目的：构建骨性关节炎+骨质疏松症动物模型并进行鉴定。
方法：贵阳医学院动物实验中心提供的37只2月龄雌性新西兰大白兔，30只随机分为骨性关节炎组、骨质疏松症组、骨性关节炎+骨质疏松症组，另设7只兔为正常对照组。分别制备骨质疏松症(造模方法：切除双侧卵巢+肌注甲泼尼龙)、骨性关节炎(造模方法：切除前交叉韧带)、骨性关节炎+骨质疏松症(造模方法：切除双侧卵巢+肌注甲泼尼龙+切除前交叉韧带)动物模型，确认造模成功后对上述3种模型软骨进行分离及培养，比较3者软骨细胞中Ⅱ型胶原酶分泌情况。
结果与结论：①运用切除兔前交叉韧带、卵巢及肌注甲泼尼松龙琥珀酸钠的方法可使骨质疏松兔骨密度降低25%以上，从关节外观可见明显关节软骨剥脱，膝关节X射线检查可见明显骨赘生成，MRI检测可显示明显关节软骨损伤，由此可知通过上述方法可成功制备骨质疏松症合并骨性关节炎的模型；②骨性关节炎组、骨质疏松症组、骨性关节炎+骨质疏松症3组兔膝关节软骨中均能成功提取出软骨细胞，与骨质疏松症组比较骨性关节炎+骨质疏松组软骨细胞Ⅱ型胶原酶的能力下降差异明显(P < 0.05)；③结果说明：实验成功建立了骨性关节炎+骨质疏松症动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9397-7408(马文娟)

关键词: 骨性关节炎, 骨质疏松, 动物模型, 前交叉韧带, 卵巢, 关节软骨, 甲泼尼龙, Ⅱ型胶原酶, 免疫组织化学染色, 细胞培养, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: The elderly often suffers from comorbid osteoarthritis and osteoporosis, but the relationship between osteoarthritis and osteoporosis is not yet clear.
OBJECTIVE: To establish and identify an animal model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis.
METHODS: Thirty-seven female New Zealand white rabbits at 2 months of age were provided by the Animal Center of Guiyang Medical University, China. Of the 37 rabbits, 30 rabbits were selected and divided into osteoarthritis group, osteoporosis group, osteoarthritis and osteoporosis group. The remaining seven rabbits were used as normal control group. Different animal models of osteoporosis (excision of bilateral ovarian and intramuscular injection of methylprednisolone)/osteoarthritis (excision of anterior cruciate ligament)/osteoarthritis and osteoporosis (excision of bilateral ovaries and anterior cruciate ligament+intramuscular injection of methylprednisolone) were made in corresponding groups. After successful modeling, cartilage samples from each rabbit were isolated and cultured. Secretion of type II collagenase was compared among three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After excision of rabbit anterior cruciate ligament and bilateral ovaries and intramuscular injection of methylprednisolone, the bone density of osteporotic rabbits was reduced by more than 25%. Exfoliation of the articular cartilage could be observed from the joint appearance, and osteophyte formed markedly shown on the X-ray film of the knee joint obviously. Obvious articular cartilage damage was also observed on the MRI image. Therefore, the model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis was successfully prepared by the above methods. (2) Chondrocytes could be successfully extracted from the rabbit knee joint cartilage in the three model groups. The ability of chondrocytes secreting type II collagenase was significantly lowered in the osteoporosis group compared to the osteoarthritis and osteoporosis group (P < 0.05). (3) To conclude, the animal model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis was successfully established.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Osteoporosis, Models, Animal, Tissue Engineering

中图分类号:

R445

马文娟1，张开伟2，沈冯君2，邓致远3，程效进4. 骨性关节炎与骨质疏松症共病模型兔的建立及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 421-426.

Ma Wenjuan1, Zhang Kaiwei2, Shen Fengjun2, Deng Zhiyuan3, Cheng Xiaojin4. Establishment and identification of a rabbit model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 421-426.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析总共纳入兔37只，其中骨性关节炎+骨质疏松组中2只死亡(肺部感染1例，腹腔感染1例)，死后及时予以补充，最终计入结果分析数量37只。

2.2 实验造模的评价

2.2.1 骨质疏松造模评价见表1。

由表1可知，骨质疏松造模组与正常组相比，脊柱、股骨及全身的骨密度均显著降低(P < 0.05)。将两组各部位骨密度均值进行变化率的计算，变化率=(正常组骨密度-骨质疏松组骨密度)/正常组骨密度，可知骨质疏松造模组与正常组对比，脊椎、股骨部位以及全身骨密度均呈下降趋势，下降值分别为25.3%，35.8%及26.8%。由以上结果可知，骨质疏松造模组与正常组相比，脊柱、股骨以及全身骨密度均有典型的骨质疏松改变，提示实验所采用的骨质疏松造模方式是可靠的，证实骨质疏松组及骨质疏松+骨性关节炎组的骨质疏松方面造模成功。

2.2.2 骨性关节炎造模评价

关节软骨外观形态对比：正常组软骨呈淡蓝色，色泽光亮，软骨表面光滑，未见裂隙及缺损，见图1A，骨性关节炎造模组：软骨呈淡黄白色，色泽暗淡，软骨表面出现剥脱，见图1B。

正常组正侧位X射线显示关节间隙正常，未见狭窄，骨质边缘光滑平整，无骨赘，见图2A，B。骨性关节炎造模组正侧位X射线显示关节间隙稍变窄，骨质边缘稍毛糙有骨赘形成，软骨下骨出现囊性变，见图2C，D。正常组膝关节MRI显示关节软骨表面境界光整，软骨线连续无中断,软骨信号呈均匀带状低信号影，见图3A，B。骨性关节炎造模组膝关节MRI显示关节软骨线中断，软骨信号不均匀，部分出现高信号影，见图3C，D。

通过对正常对照组及骨性关节炎造模组新西兰大白兔关节软骨外观形态、膝关节X射线片及膝关节MRI方面的对比，可知骨性关节炎造模组在外观及影像学上均可见典型的骨关节炎表现，提示实验所采用的骨性关节炎造模方式是可靠的，证实骨性关节炎模型组及骨质疏松并骨性关节炎模型组的骨性关节炎方面造模是成功的。
综合骨质疏松和骨性关节炎两方面评价结论，表明实验骨质疏松模型组、骨性关节炎模型组以及骨质疏松并骨性关节炎模型组的疾病造模是成功的。
2.3 软骨细胞鉴定结果
2.3.1 兔软骨细胞形态见图4。

刚消化提取的原代软骨细胞呈小圆球形悬浮于培养液中，分布均匀，未见聚集成团现象，具有折光性，见图4A；静置48 h后部分细胞开始贴壁于培养瓶底部，细胞伸长形成突起，细胞呈多角形或短梭形，见图4B；培养第5天，细胞进入对数生长期，细胞增殖迅速，细胞呈多角形或梭形，可见呈小集落样生长，可长满培养瓶约80%，见图4C。
2.3.2 软骨细胞鉴定甲苯胺蓝染色结果见图5。

由图5A-I可知软骨细胞甲苯胺蓝染色，细胞质呈淡蓝色，细胞核仁呈深蓝色，偶可见细胞周围有异染颗粒，见图5B。从图5C-I可明显观察到，软骨细胞染色后细胞质、细胞核、核仁的着色随着传代代数的增加逐渐变浅。而在P₁，P₃及P₅软骨细胞中，骨质疏松组染色较骨性关节炎组深，骨性关节炎组较骨性关节炎+骨质疏松组深。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果见图6。

由图6可知软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后，软骨细胞胞浆染成棕黄色，胞核不着色。软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后胞浆中棕黄色着色随着传代数的增加逐渐变浅。而在P₁，P₃及P₅软骨细胞中，骨质疏松组染色较骨性关节炎组深，骨性关节炎组较骨性关节炎+骨质疏松组深。

2.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后平均积分光密度结果通过IPP 6.0图像分析软件分别测定3组软骨细胞的第1，3，5代Ⅱ型胶原免疫组织化学染色图的平均积分光密度值，结果见表2。

骨质疏松、骨性关节炎及骨性关节炎+骨质疏松组细胞随着传代数的增加，其Ⅱ型胶原免疫组织化学染色的平均积分光密度呈现一个递减趋势，即P₁ > P₃ > P₅(P < 0.05)，这与前面Ⅱ型胶原免疫组织化学染色图中观察到的相吻合。在固定分组的情况下，软骨细胞代数之间积分光密度值差异有显著性意义(P < 0.05)，在固定细胞代数的情况下，3组细胞在P₁及P₃积分光密度值对比差异明显，但在P₅期，3组软骨细胞对比，积分光密度值差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。进一步进行两两比较发现骨质疏松组与骨性关节炎+骨质疏松组在P₁及P₃期比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] Kraus VB, Kilfoil TM, Hash TW, et al. Atlas of radiographic features of osteoarthritis of the ankle and hindfoot. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(12):2059-2085.

[2] 薛庆云,王坤正,裴福兴,等.中国40岁以上人群原发性骨关节炎患病状况调查[J].中华骨科杂志,2015,35(12):1206-1202.

[3] Liu MY, Pei Y, Zhang Y, et al. The effect of age on the changes in bone mineral density osteoporo and steoporosis. Bone Miner Res. 2013;6(2):114-120.

[4] Hulet C, Sabatier JP, Souquet D, et al. Distribution of bone mineral density at the proximal tibia in knee osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2002;71(4):315-322.

[5] Ding C, Cicuttini F, Boon C, et al. Knee and hip radiographic Osteoarthritis osteoarthritis predict total hip bone loss in older adults: a prospectivestudy. J Bone Miner Res. 2010;25(4): 858-865.

[6] Im GI, Kim MK. The relationship between osteoarthritis and osteoporosis. J Bone Miner Metab. 2014;32(2):101-109.

[7] Vestergaard P, Rejnmark L, Mosekilde L, et al. Osteoarthritis and risk of fractures. Calcif Tissue Int. 2009;84(4):249-256.

[8] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

[9] 刘绪立.兔骨质疏松模型的快速建立和硫酸钙复合bBMP在椎体强化中的实验研究[D].西安:第四军医大学,2009.

[10] 方锐,艾力江•阿斯拉,卢勇,等.兔骨性关节炎模型构建及早中晚期的特点[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(7): 1218-1222.

[11] Bultink IE, Lems WF. Osteoarthritis and osteoporosis: what is the overlap? Curr Rheumatol Rep. 2013;15(5):328.

[12] Oki Y, Doi K, Makihara Y, et al. Effects of continual intermittent administration of parathyroid hormone on implant stability in the presence of osteoporosis: an in vivo study using resonance frequency analysis in a rabbit model. J Applied Oral Sci. 2017;25(5):498-505.

[13] Wang J, Wang G, Gong L, et al. Isopsoralen regulates PPAR γ/WNT to inhibit oxidative stress in osteoporosis. Mol Med Rep. 2018;17(1):1125-1131.

[14] Song L, Bi YN, Zhang PY, et al. Optimization of the time window of interest in ovariectomized imprinting control region mice for antiosteoporosis research. Biomed Res Int. 2017; 2017:8417814.

[15] 李楠,王猛,刘永明,等.卵巢切除术构建大鼠骨关节炎合并骨质疏松模型的可行性[J].现代生物医学进展,2015,15(13):2413-2416.

[16] 周君,何成奇,郭华,等.兔膝骨关节炎合并骨质疏松症动物模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(41): 7639-7642.

[17] Van Staa TP, Leufkens HG, Cooper C. The epidemiology of corticosteroid-induced osteoporosis: a meta-analysis. Osteoporos Int. 2002;13(10):777-787.

[18] Van Staa TP, Leufkens HG, Abenhaim L. Use of oral corticosteroids and risk of fractures. J Bone Miner Res. 2000;15(6):993-1000.

[19] 于斐,曾晖,于红燕,等.软骨细胞特殊染色技术的比较与应用[J].中国比较医学杂志,2015,25(8):58-75.

[20] 刘薇,史俊文,岳敏,等.西藏小型猪肋软骨细胞的分离培养及鉴定[J].中国比较医学杂志,2013,23(3):1-3.

[21] 吕顺,周军杰,谢晓涛,等.软骨组织工程种子细胞获取培养及鉴定研究进展[J].中国骨与关节杂志,2015,4(11):864-867.

[22] Liu TY, Zhou GD, Wei X, et al. Influence of transforming growth factor-beta1 Inducing time on chondrogenesis of bone marrow stromal cells (BMSCs): in vitro experiment with porcine BMSCs. Zhong hua Yi Xue Za Zhi. 2007;87(31): 2218-2222.

[23] Zaucke F, Dinser R, Maurer P, et al. Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and collagen IX are sensitive markers for the diff erentiation state of articular primary chondrocytes. Biochem J. 2001;358(Pt 1):17-24.

[24] Han JL, Duan WP, Shi GH, et al. Research on pericellular matrix properties for chondrcytes. Zhongguo Gu Shang. 2015;28(6):576-579.

[25] Gillogly SD, Wheeler KS. Autologous chondrocyte implantation with collagen membrane. Sports Med Arthrosc. 2015;23(3): 118-124.

引言

骨质疏松和骨性关节炎均为年龄相关退化性疾病。骨质疏松症是以单位体积内骨量减少、骨强度降低、骨折风险增高为特点的退行性骨骼疾病。骨性关节炎是以关节软骨退行性改变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病^[1]。骨性关节炎与骨质疏松在老年人群中发病率极高，有流行病学研究表明^[2]，中国60岁以上人群中原发性骨关节的发病率高达62%。骨质疏松的患病率在中国高龄人群中超20%^[3]。骨质疏松是以破骨吸收、骨量减少为主要病变，而骨性关节炎却以成骨改变、骨质增生为主，两者从病因、发病机制、病理特征及临床表现上有较大的差异，但在实际临床工作中又发现两者时常合为一病。中国大宗流行病学报道显示：骨质疏松与骨性关节炎二者并发率约为30%^[4]。而目前的研究表明骨质疏松与骨性关节炎两者相互关系尚未明确^[3]。有研究通过对867例经X射线诊断为髋/膝关节炎受试者的髋部骨量长达2年多的研究发现受试者的骨量是逐渐丢失的状态^[5]。Im等^[6]通过对大量文献进行分析研究发现，腰椎骨密度低与膝骨性关节炎的发生率较低有关，虽然骨密度低不能阻止膝关节骨性关节炎的进展。Vestergaard等^[7]发现髋关节骨性关节炎患者骨密度较高时，与对照组比较骨折风险降低。因两病的相关性尚未明确，给疾病的治疗带来了困难，而两者共病的动物模型是研究治疗两者共病的途径，以往研究均是以新生 24 h胎兔透明软骨进行培养，但此方法不能真实的模拟两者共病的动物模型。实验从实验动物着手制备骨质疏松并骨性关节炎模型，并在此基础上建立了软骨细胞体外培养体系，以期为临床中更好的防治骨性关节炎、骨质疏松症、骨性关节炎+骨质疏松症提供帮助。实验在贵州省中医院沈冯君名中医肾虚血瘀学术思想指导下实施。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2015年9月至2016年3月在贵州医科大学动物实验室完成动物实验，细胞学实验在贵阳中医学院中心实验室完成。

1.3 材料 2月龄雌性新西兰大白兔37只，体质量(2.00± 0.15) kg，由贵阳医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(黔)2015-001。将37只兔用Excel软件随机分为骨性关节炎组、骨质疏松组、骨性关节炎+骨质疏松组及正常组，每组10只，正常兔7只。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》，实验经贵阳中医学院实验动物伦理委员会批准，伦理批准号：2015-024^[5]。

1.4 实验方法

1.4.1 造模

骨质疏松模型制备^[6]：将骨质疏松组新西兰大白兔适应性喂养1周后，切除双侧卵巢，并于术后第2-5周肌注甲泼尼松龙琥珀酸纳(天津药业焦作有限公司)1 mg/(kg•d)。

骨关节炎模型制备^[7]：将骨性关节炎组新西兰大白兔适应性喂养1周后，切断右膝前交叉韧带，术后伤肢不固定。

骨质疏松并骨关节炎模型制备：将骨性关节炎+骨质疏松组新西兰大白兔适应性喂养1周后分别进行骨质疏松组及骨性关节炎组操作，操作步骤同上。

1.4.2 模型评价造模8周后，随机从骨质疏松组和骨性关节炎+骨质疏松组中分别选出5只兔组成骨质疏松造模组(n=10)，将其与正常组(n=7)一起进行骨质疏松模型评价；随机从骨性关节炎组和骨性关节炎+骨质疏松组中分别选出5只兔子组成骨性关节炎造模组(n=10)，将其与正常组(n=7)一起进行骨性关节炎模型评价。

评价方法：①将正常组与骨质疏松造模组的(脊柱、股骨及全身)骨密度值进行对比评估；②将正常组与骨性关节炎造模组的右膝关节关节软骨的外观形态以及膝关节影像学(正、侧位X射线及MRI检查)表现进行对比评估。

检测仪器：双能X射线骨密度仪(美国Hologic公司)扫描全身，最终选取脊柱、股骨及全身3部分骨密度数据；数字化医用X射线摄影系统(DR)(Carestream Health)拍摄膝关节正侧位片：德国西门子 Megnetom avauto 1.5 T MRI仪进行膝关节水平位及矢状位扫描。

1.4.3 组织学观察

标本采集及处理：确认造模成功后，将各组新西兰大白兔分别麻醉处死，消毒双膝并完全离断，乙醇浸泡消毒后，放入含双抗的PBS中。在超净工作台上，取经膝关节内侧弧形切口，充分暴露股骨远端以及胫骨近端关节软骨面，用手术刀刮取软骨放入培养皿中，用PBS冲洗软骨组织3次，用刀片将软骨组织切至1 mm³大小后，移入无菌6孔板；加入10倍体积0.25%胰蛋白酶在摇床上消化30 min；加入3倍含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基终止消化；将组织及培养基移入离心管(1 500 r/min)离心10 min，弃上清液；DMEM培养基清洗软骨组织1次，离心去上清液；加入10倍体积0.2%Ⅱ型胶原酶摇床上消化3 h；加入3倍含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化；200目筛分离出未消化的软骨组织并将培养基移入离心管离心 10 min(1 500 r/min)，弃去上清液；加入DMEM(含体积分数5%的胎牛血清)后将细胞悬液吹打均匀，进行细胞计数，将细胞浓度为1×10⁸ L^-1的细胞悬液移入25 cm³的培养瓶中放入37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养。

软骨细胞鉴定：①甲苯胺蓝染色：将软骨细胞放入6孔板中培养(每组占2孔)，待爬满80%的6孔板时用PBS冲洗 2次；40 g/L多聚甲醛固定1 h；自来水冲洗15 min；蒸馏水冲洗5 min；加入体积分数1%甲苯胺蓝液染2 h；予移液器去除多余染液在倒置相差显微镜下观察；②Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色：将已爬满约80%软骨细胞的6孔板旧培养基抽出，用PBS冲洗3次；加入40 g/L多聚甲醛固定 20 min；吸除多聚甲醛，PBS冲洗细胞3遍，每次3 min；体积分数3%H₂O₂常温孵育20 min；抽掉体积分数3% H₂O₂，加试剂A室温孵育20 min；抽掉试剂A，加入稀释好的一抗抗体(PBS稀释1∶100)37 ℃ 孵育2 h；抽掉抗体，PBS洗3遍，每次3 min，滴加试剂B，37 ℃孵育20 min；PBS洗3遍，每次3 min，滴加试剂C，37 ℃孵育20 min；PBS洗3遍，每次3 min；配置DAB染色剂，取2 mL蒸馏水至2 mL离心管中，滴加显色液A，B，C各2滴，漩涡打匀；在孔板中加入显色剂0.5 mL，5-30 min后显微镜下观察结果。应用显微图像采集系统对行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色的软骨细胞摄片，并用IPP 6.0图像分析软件进行分析测定平均光密度值(MOD)。.

1.5 主要观察指标各组软骨细胞形态，骨密度值及软骨细胞平均积分光密度值。

1.6 统计学分析使用SPSS 18.0统计进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间数据差异比较采用两因素重复测量方差分析，组间数据两两比较采用成组t 检验， P < 0.05代表两者差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

中国已进入老龄化社会，骨质疏松症及骨性关节炎已成为影响中老年人生活质量的重要因素之一，疾病治疗极大的耗费了社会医疗资源^[10]，因此对于以上两种骨科退行性疾病进行早期防治具有重大的社会意义，而以动物模型为基础的研究已成为研究治疗上述疾病的主要方法^[11-13]。通过对骨质疏松症及骨性关节炎基础研究的文献可发现，SD大鼠及新西兰大白兔为最常用的实验动物。骨性关节炎/骨质疏松/骨性关节炎+骨质疏松的造模方法多种多样：方锐等^[10]通过改良的Hulth方法造模后发现，6，8，12周后可分别获得稳定的早期、中期及晚期骨性关节炎模型。有研究通过对切除卵巢的小鼠的骨小梁数量、厚度及碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型前胶原氨基端肽和Ⅰ型胶原羧基末端肽片段(¹²⁵I)等各项指标综合分析后发现，去卵巢后8-16周可取到满意的骨质疏松症模型^[14-16]。糖皮质激素是诱导骨丢失，影响人体对钙的处理及影响性激素水平，最终导致骨质疏松的重要因素^[17-18]。实验运用切除兔前交叉韧带的方法制备骨性关节炎模型，8周后通过对兔关节软骨外观形态观察、膝关节X射线片及膝关节MRI的观察分析来判断造模成功与否，研究结果表明，运用Hulth的方法确实可制备骨性关节炎模型，兔关节软骨表面出现剥脱现象，X射线检查发现骨质边缘出现增生硬化，软骨下骨出现囊性变。而骨质疏松模型的制备则结合运用切除新西兰大白兔双侧卵巢及肌注甲泼尼松龙琥珀酸纳的方法进行，两种方法的结合运用更保证了骨质疏松模型造模的成功，实验研究表明术后8周即可获得稳定的中期骨质疏松模型。骨质疏松症并骨性关节炎模型的制备则结合了制备骨质疏松及骨性关节炎模型的方法，结果表明，该方法能成功复制出骨质疏松并骨性关节炎模型，为后期研究两者合病的治疗提供基础。

软骨细胞的鉴定方法多种多样，但一般均采用两种或两种以上的方法对软骨细胞进行鉴定。于斐等^[19]采用了4种染色来对软骨细胞进行鉴定，并对比了4种染色方法其各自的特点：苏木精伊红染色中细胞核及细胞质分别呈紫蓝色及粉红色，番红O-固绿双染色中细胞核及细胞质分别呈粉红色及蓝绿色，这两种染色的特点是能清楚的了解细胞的形态结构。而SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色时，因衰老细胞能被染成绿色，而未衰老细胞无着色，故可以明显显示出细胞是否衰老以及衰老的数量；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色时，Ⅱ型胶原呈棕黄色，因此可以对Ⅱ型胶原进行定位与定量。刘薇等^[20]通过甲苯胺蓝染色及胶原酶Ⅱ、蛋白聚糖的免疫荧光鉴定来证实其培养的细胞为软骨细胞。吕顺等^[21]则通过甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色来对软骨细胞进行鉴定。由此可见对软骨细胞进行染色鉴定的方法是根据其各自实验目的及观察点来选择的，无论选取何种方法都能达到对软骨细胞的鉴定作用。

实验采用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对软骨细胞进行鉴定是因为软骨细胞可合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原。甲苯胺蓝染液中的阳离子具有染色作用，能把软骨细胞中的细胞基质染成蓝色^[22]。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可特异性地反映软骨细胞中Ⅱ型胶原的含量，染色时软骨细胞胞浆可被染成棕黄色，而胞核不着色。软骨细胞的退变会使蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量下降，继而软骨细胞逐渐丧失其表型，最终被成纤维细胞所取代^[23]，而软骨细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色的着色深浅分别与蛋白多糖及Ⅱ型胶原的含量呈正相关。

软骨细胞无特异性标志物，根据组织提取部位及甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果可知，实验所提取细胞确实为软骨细胞，且随着细胞传代软骨细胞中蛋白多糖及Ⅱ型胶原分泌逐渐减少，软骨细胞中的着色也逐渐减弱^[24-25]，细胞的表型亦逐渐丧失，这与文献中的描述是相吻合的，且骨性关节炎+骨质疏松组软骨细胞中蛋白多糖及Ⅱ型胶原的含量较骨质疏松组、骨性关节炎组明显降低，表明骨性关节炎+骨质疏松组软骨细胞退变明显，与骨性关节炎组及骨质疏松组对比差异显著。从软骨细胞退变角度方面分析，骨性关节炎及骨质疏松组软骨细胞中蛋白多糖及Ⅱ型胶原均比骨性关节炎+骨质疏松组多，故可推断骨性关节炎与骨质疏松可相互促进，加速软骨细胞的退变。且通过甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可发现，兔第二三代软骨细胞中蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达相对较多，能够维持软骨细胞的表型稳定，适宜进行下一步的各实验，能为两者共病的研究提供基础。

由于多种因素限制，实验在进行研究时只检测分析了骨质疏松模型组、骨性关节炎模型组和骨质疏松+骨性关节炎模型组，而未检测分析空白对照组，无法分析空白对照组与以上3组的关系，故最终数据有一定的局限性。其次受单个实验动物关节软骨样本量较少及软骨细胞体外培养有去分化现象等因素影响，能使用的细胞代数及数量均有限，为最终实验结果增加了不定性因素。实验对骨性关节炎、骨质疏松、骨性关节炎并骨质疏松共3种疾病的研究，从关节软骨细胞着手，可能对骨质疏松及骨性关节炎并骨质疏松两个疾病的体现不足，下阶段可考虑行软骨细胞及成骨细胞的共培养，以期望能更加真实的模拟上述3种疾病中，软骨细胞及软骨下骨的成骨细胞之间的相互影响及作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨性关节炎与骨质疏松症共病模型兔的建立及鉴定

Establishment and identification of a rabbit model of comorbid osteoarthritis and osteoporosis

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	李中峰, 陈明海, 凡一诺, 魏秋实, 何伟, 陈镇秋. 右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1256-1263.
[4]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[5]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[6]	侯广原, 张继学, 张志军, 孟祥晖, 段文, 高维陆. 骨水泥强化椎弓根螺钉内固定治疗伴骨质疏松腰椎退行性疾病的1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 878-883.
[7]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[8]	刘少华, 周观明, 陈希聪, 肖可明, 蔡剑, 刘效仿. 前交叉韧带缺陷对固定平台单髁置换后中期疗效的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 860-865.
[9]	肖方骏, 陈树东, 栾继耀, 侯宇, 何坤, 林定坤. 丹参干预骨质疏松症：网络药理学解释的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 772-778.
[10]	刘波, 陈祥和, 杨康, 余慧琳, 陆鹏程. DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 791-797.
[11]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[12]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[13]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[14]	马子越, 巨啸晨, 张磊, 孙荣鑫. 保留与不保留残端重建前交叉韧带后移植物腱骨愈合的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 582-587.
[15]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.